王健，張薈蓉，趙盼，王光鎖，鄒暢

1.深圳市人民醫(yī)院胸外科，廣東 深圳 518000；

2.暨南大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 深圳 518000；

3.南方科技大學第一附屬醫(yī)院，廣東 深圳 518052；

4.深圳市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心，廣東 深圳 518000；

5.深圳市腫瘤精準醫(yī)療與分子診斷公共服務平臺，廣東 深圳 518000

研究表明，腫瘤的發(fā)生及發(fā)展與腫瘤所處的微環(huán)境有著直接必然的聯系[1]，體外腫瘤細胞的三維培養(yǎng)技術，能夠更好地模擬腫瘤細胞在體內的真實狀態(tài)[2-3]。腫瘤細胞三維培養(yǎng)體系的建立涉及到細胞生物學和組織工程學的交叉結合，相對于傳統的平面培養(yǎng)，三維培養(yǎng)可為腫瘤的體內實驗搭建一個橋梁[4]。在腫瘤研究的基礎領域，三維培養(yǎng)體系的建立對于臨床前體外藥物的篩選、腫瘤干細胞的維持和分化以及信號的異常傳導都有著非常重要的研究意義[5-6]。特別是針對一些少見的惡性腫瘤，臨床前的藥敏實驗和藥物篩選、三維培養(yǎng)體系的建立將會為不必要的Ⅰ、Ⅱ期臨床實驗提供有價值的引導，有效減少資金和資源的浪費[7]。因此本實驗在平面培養(yǎng)的基礎上，嘗試建立一個穩(wěn)定有效的體外三維篩藥模型，并且通過試用不同化療藥物對該模型進行了初步試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 腫瘤組織標本來源于2020年1月至2020年7月在深圳市人民醫(yī)院胸外科接受手術切除的腫瘤患者。

1.1.2 主要試劑和藥物 完全培養(yǎng)基F培養(yǎng)基成分包括DMEM、F-12 nutrient mix、FBS、L-glutamine、hydrocortisone epidermal growth factor(EGF)、insulin、ROCK inhibitor(Y-27632)、青霉素/鏈霉素；胰酶包括0.05%的Trypsin/EDTA、0.25%的Trypsin/EDTA；主要化療藥物有順鉑、卡鉑、培美曲塞和鹽酸吉西他濱；其他還有海藻酸鈉溶液、氯化鈣。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤原代細胞培養(yǎng) 將胸外科手術取下的肺癌組織標本轉移至組織保護液中，并放置在冰上取回至實驗室。腫瘤組織塊轉移至6 cm的培養(yǎng)皿中用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗三次，洗去組織塊上的血水，用已經高壓滅菌消毒的手術剪刀將組織剪成1 mm3小的組織碎塊，消化酶重懸轉移至15 mL的離心管，固定于37℃培養(yǎng)箱中消化0.5～3 h。在500×g、4℃離心5 min，棄去上清。沉淀用完全培養(yǎng)基重懸，100μm的濾膜過濾后300×g、4℃離心5 min。細胞沉淀用F培養(yǎng)基重懸后鋪板在含有飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)板中，于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 原代細胞免疫熒光鑒定 將105的細胞接種在含有細胞爬片的24孔板中，第二天細胞貼壁后用PBS沖洗兩次，洗去培養(yǎng)基和漂浮的死細胞后用4%的多聚甲醛室溫固定30 min。PBS沖洗兩次后加入0.5%的Triton-X-100，室溫使其通透15 min，再用PBS沖洗兩次；用5%的BSA室溫封閉30 min，一抗分別為CK7、NapsinA、TTF-1和Ki67，按照1∶200的稀釋比加入，4°C過夜孵育。PBS沖洗3次，每次3～5 min，二抗1∶500稀釋，室溫孵育1 h后PBS洗3次，充分洗去抗體殘留。復染細胞核DAPI，以1∶1 000稀釋后常溫孵育10 min以后PBS漂洗3次，每次5 min。滴加抗淬滅劑，封片，熒光顯微鏡鏡檢。

1.2.3 原代肺癌細胞的三維培養(yǎng)及藥物敏感性測試模型構建 將分離得到的原代肺癌細胞與海藻酸鈉溶液均勻混合(每毫升海藻酸鈉溶液中加入106個細胞)；利用銳孔擠壓法(將混合液吸入1 mL的無菌注射器中)控制力度均勻滴入100 mmol/L的CaCl2溶液中，鈣化30 min使之形成粒徑均一的凝膠微球；生理鹽水清洗兩次，培養(yǎng)基再清洗一次，將包埋癌細胞的海藻酸鈣凝膠微球轉移至培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，使之形成三維細胞團；轉移相同個數的細胞團至96孔板中，分別加藥處理48 h和72 h。

1.2.4 CCK8法檢測細胞毒性 每孔加入10%的CCK8新鮮培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標儀檢測450 nm處的OD值。

2 結果

2.1 腫瘤組織收集及病理鑒定 收取的組織標本石蠟切片病理判定結果為浸潤性肺腺癌，腺泡型(約50%)+實體型(約40%)+乳頭型(約10%)，免疫組化結果顯示CK(+)，NapsinA(+)，TTF-1(+)。

2.2 原代肺癌細胞平面生長情況 分離得到的腫瘤細胞與飼養(yǎng)層細胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)3～7 d換液，在顯微鏡下可觀察到明顯的細胞克隆，腫瘤細胞貼壁聚集，緊密排列，成鵝卵石鋪路石狀，見圖1A；在共培養(yǎng)體系中，清晰可見島狀細胞團，并被飼養(yǎng)層細胞緊密包裹生長，飼養(yǎng)層細胞呈梭形狀，與上皮細胞可明顯區(qū)分，見圖1B。

圖1 原代肺癌細胞生長形態(tài)

2.3 免疫熒光鑒定 培養(yǎng)的細胞用免疫熒光法進行鑒定，如圖2所示，免疫熒光結果顯示CK7為強陽性，NapsinA和TTF-1均為陽性表達，Ki67細胞增殖為強陽性。免疫熒光抗體表達結果與患者腫瘤組織的病理結果一致，提示培養(yǎng)的原代細胞為肺腺癌腫瘤細胞。

圖2 原代肺癌細胞免疫熒光鑒定

2.4 原代肺癌細胞在三維培養(yǎng)體系中的培養(yǎng) 海藻酸鈉溶液與細胞混合，滴進氯化鈣溶液中會形成海藻酸鈣凝膠微球，微球講細胞包裹形成一個三維體系，可以讓細胞在立體三維空間中持續(xù)生長，圖3A為一個海藻酸鈣凝膠微球，該微球大小均一，形態(tài)完整；圖3B是單個凝膠微球中細胞的生長狀態(tài)，單個細胞在微球中會形成小的細胞團，細胞團懸浮生長，形成了一個封閉的三維環(huán)境。

2.5 原代肺癌細胞在三維培養(yǎng)體系中的藥物敏感性檢測 肺腺癌的臨床化療藥物主要包括順鉑、卡鉑、培美曲塞和鹽酸吉西他濱等，通過CCK8法檢測肺腺癌原代細胞在該三維體系中的抑制率，如圖4所示，藥物作用時間為48 h時，藥物抑制率為卡鉑＞吉西他濱＞順鉑＞培美曲塞；藥物作用時間為72 h時，順鉑＞卡鉑＞吉西他濱＞培美曲塞。此株原代細胞對培美曲塞的敏感性相對較低，對順鉑、卡鉑及吉西他濱的敏感性相差不大，在臨床上可選擇聯合用藥以提高對病情的控制程度。

圖3 原代細胞肺癌細胞的三維培養(yǎng)

圖4 不同化療藥物對肺癌原代細胞的抑制率

3 討論

肺癌是我國在世界范圍內發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[8]。臨床醫(yī)生對于肺癌的化療用藥多限于經驗給藥，這種用藥模式會造成患者出現多重耐藥、不良反應、效果欠佳等后果。有研究表明，有藥敏實驗結果指導的臨床治療效果要明顯優(yōu)于無藥敏實驗指導的治療[9]。因此建立一種更接近體內的成熟的體外藥篩模型，是非常重要的。在體外細胞培養(yǎng)的研究中，研究者主要是在堅硬的塑料或玻璃表面進行2D培養(yǎng)，主要是因為2D培養(yǎng)簡單、方便和有高效的細胞增殖速度[10]。2D培養(yǎng)的細胞模型會與細胞真實的生存環(huán)境和生長方式有很大的不同，與3D培養(yǎng)相比，可以發(fā)現有明顯的生物學變化，包括免疫系統激活、防御反應、細胞黏附和組織發(fā)育[11-13]。因此，3D系統特別是3D細胞培養(yǎng)體系在生物學上具有非常重要的意義，比如更經濟高效的新藥開發(fā)、癌癥患者體外藥敏實驗及發(fā)育生物學和細胞分化機制的基礎研究[10]。

目前三維培養(yǎng)主要有：三維成球培養(yǎng)(靜止性懸浮成球培養(yǎng)[14]、滴滴懸掛培養(yǎng)[15]、機械運動式培養(yǎng)[16])凝膠包埋培養(yǎng)(膠原[17]、藻酸鹽[18]、Matrigel[19])、三維組織工程支架培養(yǎng)[4，20]。水凝膠是親水聚合物交聯在一起的一種三維網絡，可以吸收大量的生物液體和水而膨脹，同時可以保持自己的網絡結構，就像一個活體組織一樣具有高水容量、滲透力和一致性[21]。在生物醫(yī)學領域中，水凝膠在藥物輸送載體、創(chuàng)面材料和3D打印中的巨大應用潛力和價值已得到證實[21]。

本實驗研究首先用與飼養(yǎng)層細胞共培養(yǎng)的2D培養(yǎng)體系在體外迅速獲得大量的原代肺癌細胞，然后利用海藻酸鈉水凝膠在3D培養(yǎng)體系方面的應用，將得到的原代肺癌細胞與海藻酸鈉混合培養(yǎng)形成穩(wěn)定的海藻酸鈣凝膠微球，初步構建了一個基于原代培養(yǎng)的3D腫瘤藥篩模型，并用此模型進行了化療藥物篩選的初步試驗。實驗結果顯示該3D模型形成的細胞微球大小均一，形態(tài)完整，細胞生長狀態(tài)良好；與其他的3D模型相比，該模型在藥物篩選時可以通過準確地控制細胞球數量來統一細胞量進行藥物敏感性實驗，四種化療藥物處理結果提示，該細胞對順鉑、卡鉑及吉西他濱的敏感性比培美曲塞的敏感性高。綜上所述，該三維模型的建立，方法簡單，易于操作，成功率高，可為臨床上體外藥物篩選提供一定的基礎。