趙星 郝祺2)? 倪振華 邱騰

1) (東南大學(xué)物理學(xué)院, 南京 211189)

2) (東南大學(xué)量子信息中心, 南京 211189)

單分子檢測(cè)代表分子檢測(cè)靈敏度的極限, 能夠提供傳統(tǒng)檢測(cè)方式無(wú)法提供的物理信息, 在化學(xué)分析、分子動(dòng)力學(xué)機(jī)理、蛋白質(zhì)解析等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景, 具有重要的科學(xué)研究?jī)r(jià)值.具體而言, 單分子檢測(cè)能對(duì)復(fù)雜體系中的分子進(jìn)行識(shí)別和計(jì)數(shù), 給出分子的分布信息; 也可以對(duì)單個(gè)分子在吸附、反應(yīng)等過(guò)程中的實(shí)時(shí)衍變進(jìn)行追蹤, 研究分子動(dòng)力學(xué)的內(nèi)在機(jī)制.單分子表面增強(qiáng)拉曼散射是單分子檢測(cè)領(lǐng)域最近興起的一門(mén)新方法, 其特色在于具有特異性分子識(shí)別能力, 可以提供分子成鍵變化等動(dòng)態(tài)信息.這種方法適用于研究分子的演化過(guò)程、分子與環(huán)境的電荷相互作用, 從而揭示分子的反應(yīng)途徑、分布狀態(tài)、吸附方式、電荷交換等重要信息.單分子表面增強(qiáng)拉曼散射的概念提出較早, 但是缺乏高效的采集方法和精確的判定依據(jù), 本文將對(duì)采集方法的優(yōu)化進(jìn)行梳理分析, 從非統(tǒng)計(jì)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)兩個(gè)角度對(duì)其進(jìn)行討論, 并重點(diǎn)對(duì)雙分子分析檢測(cè)法做詳細(xì)介紹.另一方面, 由于單分子表面增強(qiáng)拉曼散射研究涉及各種交叉學(xué)科、內(nèi)涵廣泛, 相關(guān)研究需要對(duì)光譜背后的相關(guān)機(jī)制有深刻的理解和認(rèn)識(shí).為此, 本文基于當(dāng)前的相關(guān)研究工作, 從分子漂移、光譜閃爍及展寬等特有現(xiàn)象入手, 分析了單分子表面增強(qiáng)拉曼散射的波動(dòng)特征及其對(duì)應(yīng)的物理機(jī)制, 并對(duì)其應(yīng)用前景做了簡(jiǎn)要探討.

1 單分子SERS的發(fā)展歷程

表面增強(qiáng)拉曼散射(surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)技術(shù)是一種無(wú)損的分子檢測(cè)技術(shù), 它反映了分子鍵振動(dòng)能量和轉(zhuǎn)動(dòng)能量信息,是一種能夠?qū)Ψ肿舆M(jìn)行特異性識(shí)別的“指紋”光譜,被廣泛用于定量分析、傳感檢測(cè)、催化、生物及能源等研究領(lǐng)域[1?11].通常情況下普通分子的拉曼信號(hào)強(qiáng)度很低, 需要通過(guò)貴金屬納米材料對(duì)其進(jìn)行增強(qiáng)來(lái)實(shí)現(xiàn)高靈敏度的分子檢測(cè), 即“表面增強(qiáng)技術(shù)”.“表面增強(qiáng)技術(shù)”通常使用金、銀、銅等貴金屬材料, 這些材料的納米顆粒在激發(fā)光的照射下, 會(huì)在表面產(chǎn)生集體電子振蕩, 即表面等離激元振蕩(surface plasmons resonance, SPR)模式, 該模式可以突破光的衍射極限, 將激發(fā)光轉(zhuǎn)換為束縛于貴金屬材料表面幾個(gè)納米空間的局域電磁場(chǎng)(“熱點(diǎn)”)[12,13].這種局域電磁場(chǎng)強(qiáng)度極高, 可以將入射光能量匯聚在狹小的納米空間之內(nèi), 從而放大附近探針?lè)肿拥睦庾V信號(hào), 即電磁場(chǎng)增強(qiáng)拉曼散射[14].與此同時(shí), 貴金屬材料中被激發(fā)的熱電子與分子的最高占據(jù)軌道(highest occupied molecular orbital, HOMO)和最低未占據(jù)軌道(lower unoccupied molecular orbital, LOMO)之間會(huì)發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移, 導(dǎo)致分子的極化率增加, 形成化學(xué)增強(qiáng)拉曼散射[15?18].由于這兩種增強(qiáng)方式往往同時(shí)存在和產(chǎn)生作用, 被統(tǒng)稱為SERS技術(shù).與傳統(tǒng)的拉曼光譜相比, SERS技術(shù)能夠顯著增強(qiáng)分子的拉曼信號(hào)(高達(dá)1014甚至更大)[15], 從而實(shí)現(xiàn)痕量乃至單分子級(jí)別的分子檢測(cè)[19,20].

單 分 子SERS (single-molecule SERS, SMSERS)是指在光斑內(nèi)處于熱點(diǎn)附近的單個(gè)探針?lè)肿铀l(fā)出的拉曼光譜.與傳統(tǒng)的拉曼光譜相比,SM-SERS不再是大量分子集合信號(hào)的平均, 而是能夠提供分子的空間狀態(tài)和所處環(huán)境的特異性光譜, 因此具有較窄的半高寬和更高的質(zhì)量因子, 如圖1所示[21].SM-SERS能夠反映分子的各異性,從而獲得分子的吸附狀態(tài)、動(dòng)力學(xué)規(guī)律及化學(xué)反應(yīng)演化過(guò)程等重要信息[22], 可以在單分子水平上觀察到納米級(jí)尺度環(huán)境中單個(gè)分子的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)事件, 具有重要的科學(xué)研究?jī)r(jià)值.

圖1 SM-SERS與普通SERS光譜圖的區(qū)別[21]Fig.1.Typical spectra of SM-SERS and traditional SERS[21].

SM-SERS在1997年首先由聶書(shū)明等[23]和Kneipp等[24]提出.他們?cè)阢y膠溶液體系中分別觀察到了超低濃度(10–11mol/L)羅丹明6G (Rhodamine 6G, Rh6G)分 子 和(10–14mol/L)結(jié) 晶 紫(Crystal violet, CV)分子的類SM-SERS信號(hào).這種方法認(rèn)為超低的分子濃度(亞納摩級(jí))實(shí)現(xiàn)的光譜學(xué)測(cè)量可近似地認(rèn)為是單分子測(cè)量, 是早期SMSERS研究的主要方法[25?28].基于這種方法, 徐紅星院士[26]對(duì)聚合的銀納米顆粒體系進(jìn)行研究, 發(fā)現(xiàn)SM-SERS僅存在于由兩個(gè)或多個(gè)金屬納米顆粒構(gòu)成的體系中, 而在單個(gè)金屬顆粒上難以實(shí)現(xiàn),因此提出金屬納米間隙之間的超強(qiáng)局域電磁場(chǎng)是實(shí)現(xiàn)SM-SERS的必要條件.這類方法, 我們稱之為超低濃度檢測(cè)法, 使用起來(lái)相對(duì)比較簡(jiǎn)單方便,但是在對(duì)SM-SERS的認(rèn)定上存在一定瑕疵, 因?yàn)榉肿釉诘蜐舛?單分子水平)體系中服從泊松分布,SM-SERS光譜的獲取存在很大的隨機(jī)性, 因此檢測(cè)效率較低且難以區(qū)分單分子光譜與多分子光譜[22].針對(duì)以上問(wèn)題, Le Ru等[29]在2006年提出雙分子分析技術(shù)用于SM-SERS檢測(cè), 從統(tǒng)計(jì)學(xué)的角度有效地區(qū)分了單分子光譜與多分子光譜.這種方法現(xiàn)在被普遍認(rèn)為是獲得SM-SERS光譜的標(biāo)準(zhǔn)方法, 我們將在后文中對(duì)此進(jìn)行詳細(xì)介紹.

隨著納米技術(shù)和生物科技的發(fā)展, 研究人員也開(kāi)始在更多的體系中進(jìn)行SM-SERS研究, 例如在SPR材料表面引入帶有單個(gè)染料分子的DNA用于構(gòu)造“間隙”結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)具有高確定度的SMSERS檢測(cè)[30,31], 如圖2(a)所示, 或者將拉曼光譜儀與掃描探針顯微鏡等表征儀器結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)具有極高空間分辨率和單分子級(jí)別靈敏度的針尖增強(qiáng)拉曼散射光譜(tip-enhanced Raman spectroscopy,TERS)[32], 并用于SM-SERS檢測(cè)等相關(guān)工作[33?38].在先前研究工作中TERS成像的空間分辨率大約只局限于3—15 nm[39], 這種較低分辨率不足以解析和研究單個(gè)分子的物理化學(xué)信息.2013年中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)的董振超教授團(tuán)隊(duì)[33]利用掃描隧道顯微鏡并結(jié)合高強(qiáng)局域電磁場(chǎng)的針尖基底觀察到了亞納米級(jí)(空間分辨率為0.5 nm)單個(gè)靶分子不同振動(dòng)模式的TERS成像, 如圖2(b)和2(c)所示.該工作在國(guó)際上首次實(shí)現(xiàn)亞納米級(jí)高分辨率單個(gè)分子的拉曼光譜成像, 使得研究單個(gè)分子在亞納米空間中的分布狀態(tài)及其物理化學(xué)信息成為可能.隨后該研究團(tuán)隊(duì)利用這項(xiàng)技術(shù)在亞納米級(jí)分別研究了相鄰分子間的區(qū)分(如圖2(d)所示), 以及相干分子間激子耦合的成像觀察, 這些工作為研究分子間的相互作用、能量轉(zhuǎn)移、分子吸附取向(如圖2(e)所示)、DNA測(cè)序(如圖2(f)所示)及蛋白質(zhì)檢測(cè)等提供了單分子水平的分析方法[34?38].

圖2 (a) DNA在修飾的金@銀納米粒子殼層結(jié)構(gòu)之間構(gòu)造“間隙”結(jié)構(gòu)用于SM-SERS檢測(cè)[30]; (b)掃描隧道顯微鏡控制的TERS的示意圖, 其中Vb是偏置電壓, It是隧道電流[33]; (c)高分辨靶分子TERS光譜與圖像[33]; (d)相鄰分子間的TERS成像(上)及沿圖中軌跡線進(jìn)行十次連續(xù)TERS測(cè)量的相應(yīng)光譜演化(下)[34]; (e)分子亞納米分辨率STM圖像(左)以及單個(gè)分子偶極矩模擬計(jì)算圖(右)[36]; (f) DNA單鏈片段的TERS圖像[38]Fig.2.(a) The Gap structure constructed by DNA modified gold@silver nanoparticles for SM SERS detection[30]; (b) schematic diagram of TERS controlled by scanning tunneling microscope, where Vb is the sampling bias voltage and It is the tunnel current[33];(c) high-resolution TERS spectrums and images of target molecules[33]; (d) TERS imaging between adjacent molecules (up) and the corresponding spectral evolution of ten consecutive TERS measurements along the trajectory in the left image (down)[34]; (e) molecular sub-nanometer resolution STM image (left) and single molecule dipole moment simulation calculation diagram (right)[36];(f) TERS image of DNA single-stranded fragments[38].

在上述的研究中, 除了討論如何獲取SM-SERS信號(hào)之外, 研究人員還發(fā)現(xiàn)SM-SERS信號(hào)隨時(shí)間波動(dòng)等不同于普通SERS光譜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 并認(rèn)為信號(hào)波動(dòng)現(xiàn)象是驗(yàn)證SM-SERS的實(shí)驗(yàn)證據(jù)之一,然而在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)在多分子或其他體系中也存在該現(xiàn)象[22,40].雖然光譜信號(hào)波動(dòng)不是一種嚴(yán)格證明SM-SERS的方法, 但是SM-SERS中的光譜波動(dòng)卻能夠提供分子細(xì)微的SERS光譜, 并揭示出分子在“熱點(diǎn)”區(qū)域的分布狀態(tài)及在襯底表面的吸附方式等微觀系統(tǒng)中的行為特征, 具有重要的研究意義.當(dāng)前SM-SERS的發(fā)展仍處于初級(jí)階段,如何獲取可靠穩(wěn)定的SM-SERS光譜, 以及理解SMSERS光譜波動(dòng)背后的理論機(jī)制是目前研究的核心方向.基于此, 本文將針對(duì)用統(tǒng)計(jì)學(xué)和非統(tǒng)計(jì)學(xué)方法獲取SM-SERS的技術(shù)進(jìn)行介紹, 并對(duì)SM-SERS光譜的特性及可能的理論機(jī)理進(jìn)行闡述和分析.最后, 本文就目前的研究工作提出了SM-SERS面臨的挑戰(zhàn)及未來(lái)努力的方向, 希望能為今后SMSERS研究工作的開(kāi)展起到一個(gè)拋磚引玉的作用.

2 單分子SERS光譜的采集

上文已經(jīng)提到, 使用超低濃度檢測(cè)法的非統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來(lái)獲取單分子光譜事件是獲取SM-SERS信號(hào)一種常見(jiàn)且簡(jiǎn)易的方法.該方法一方面稀釋靶分子濃度以保證在平均意義上的探測(cè)體積內(nèi)存在一個(gè)甚至更少的分子, 另一方面需要優(yōu)化基底的結(jié)構(gòu)、形貌, 以及選擇合適的激發(fā)波長(zhǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)高增強(qiáng)因子(enhancement factor, EF)的SERS增強(qiáng).聶書(shū)明等[23]和Kneipp等[24]認(rèn)為較低的分子濃度和1014以上的增強(qiáng)因子(enhancement factor, EF)是獲得SM-SERS信號(hào)的關(guān)鍵.一般認(rèn)為, SERS的EF來(lái)源于電磁增強(qiáng)和化學(xué)增強(qiáng)兩部分[41].但除了上述兩種主要的增強(qiáng)機(jī)制外, 分子與基底接觸后, 與自由態(tài)分子相比, 其軌道能級(jí)發(fā)生雜化.當(dāng)激發(fā)光的光子能量與分子HOMO和LOMO軌道之間的能級(jí)差匹配時(shí), 形成共振增強(qiáng)拉曼散射(resonance-enhanced Raman spectroscopy, RERS).該現(xiàn)象也是SERS中必須要考慮到的增強(qiáng)因素, 特別是在SM-SERS研究中, 這種增強(qiáng)的貢獻(xiàn)是不容忽略的.雖然RERS只能提供大約102—106倍的增強(qiáng)效果[22], 并且從理論上來(lái)說(shuō)其較低的EF很難單獨(dú)用于采集SM-SERS信號(hào), 但是它與電磁場(chǎng)和化學(xué)增強(qiáng)的協(xié)同作用有助進(jìn)一步提高靶分子的拉曼信號(hào), 從而使SM-SERS信號(hào)采集更加穩(wěn)健可靠.基于此, Habuchi等[42]利用488 nm激光在銀膠體系中觀察到了單分子級(jí)別綠色熒光蛋白分子的拉曼信號(hào).除了局域電磁場(chǎng)的貢獻(xiàn)之外, 作者認(rèn)為RERS也有助于SM-SERS檢測(cè).在后續(xù)的研究中Blackie等[43]發(fā)現(xiàn)不同散射截面探針?lè)肿訉?shí)現(xiàn)SM-SERS需要的EF有較大區(qū)別.對(duì)于散射截面比較大的共振探針?lè)肿?10–27—10–28cm2/sr), 考慮到化學(xué)增強(qiáng)和RERS的貢獻(xiàn), “熱點(diǎn)”處的電磁場(chǎng)增強(qiáng)EF需達(dá)到108以上, 如圖3所示; 對(duì)于散k射截面比較小的非共振分子(10–29—10–30cm2/sr)而言, 電磁增強(qiáng)EF至少在1010以上才能獲得SMSERS信號(hào)[43].

圖3 不同散射截面分子實(shí)現(xiàn)SM-SERS檢測(cè)所要滿足的電磁增強(qiáng)EF[43]Fig.3.Electromagnetic enhancement EF value of molecules with different cross sections required for SM-SERS detection[43].

這種使用超低濃度檢測(cè)方法被廣泛運(yùn)用于早期SM-SERS的采集以及研究催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)中反應(yīng)物分子之間的相互作用及化學(xué)反應(yīng)的本質(zhì).例如: Zhang等[44]利用金納米顆粒二聚體觀察到了4-硝基苯硫酚(4-Nitrothiophenol, 4-NTP)的光裂解現(xiàn)象, 揭示了硫酚分子的生成反應(yīng)途徑, 如圖4(a)所示, 為后續(xù)研究單分子4-NTP催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支撐; 廈門(mén)大學(xué)李劍峰團(tuán)隊(duì)[45]在納米腔中研究了單個(gè)羅丹明B異硫氰酸酯分子的催化反應(yīng)過(guò)程, 如圖4(b)所示, 該研究利用光譜閃爍等SM-SERS特性將SERS信號(hào)與分子的熒光聯(lián)系起來(lái), 揭示了納米甚至亞納米級(jí)別的微觀系統(tǒng)中單個(gè)分子的化學(xué)反應(yīng)行為與宏觀反應(yīng)的區(qū)別.

圖4 SM-SERS技術(shù)用于監(jiān)測(cè)原位催化反應(yīng)過(guò)程 (a) 單個(gè)4-NTP分子通過(guò)原位催化反應(yīng)生成硫酚分子的SERS光譜圖[44];(b)單分子羅丹明B異硫氰酸酯經(jīng)歷不同光照時(shí)間催化生成不同物質(zhì)所對(duì)應(yīng)的光譜圖[45]Fig.4.Monitoring in situ catalytic reaction via SM-SERS: (a) SERS spectra of Thiophenol generated by single-molecule 4-NTP via in situ catalytic reaction[44]; (b) SERS Spectra of Rhodamine B isothiocyanate catalyzed by single-molecule rhodamine B under different illumination time[45].

上述工作大多近似地認(rèn)為在低濃度條件下可以獲得SM-SERS信號(hào), 并認(rèn)為其觀察到的SERS光譜波動(dòng)現(xiàn)象可以作為確認(rèn)SM-SERS的實(shí)驗(yàn)依據(jù).然而在低濃度條件下, 分子落在熱點(diǎn)區(qū)域內(nèi)的概率非常低, 因此有大量的區(qū)域無(wú)法觀察到任何信號(hào), 導(dǎo)致SERS信號(hào)有很大的隨機(jī)性.另外, 通過(guò)光譜波動(dòng)確定SM-SERS事件也不嚴(yán)謹(jǐn), 因?yàn)樵诙喾肿邮录蛘咂渌录幸部梢杂^察到類似現(xiàn)象[46,47].綜合而言, 這類方法無(wú)法嚴(yán)格甄別單分子光譜和少分子光譜的區(qū)別, 由此得到的物理機(jī)制難免有一定瑕疵; 但這類方法為研究單分子或少分子體系SERS提供了一種簡(jiǎn)捷的途徑, 特別是在動(dòng)態(tài)化學(xué)反應(yīng)檢測(cè)中能夠給予快速的信號(hào)反饋, 為分析和尋找反應(yīng)中間產(chǎn)物提供了有效方法.

另一種獲取SM-SERS的方法主要從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度出發(fā)來(lái)確保獲得的光譜為單分子光譜.Le Ru等[48]發(fā)現(xiàn), 處于高濃度探針?lè)肿尤芤褐械慕饘偌{米結(jié)構(gòu)表面吸附的分子數(shù)目服從高斯分布, 而超低濃度探針?lè)肿迎h(huán)境中與金屬結(jié)合的分子數(shù)目服從泊松分布.對(duì)泊松分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行科學(xué)分析要求SERS事件之間的強(qiáng)度變化小于2倍, 并且還要采集10000組以上有效數(shù)據(jù), 這使得嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腟M-SERS很難實(shí)現(xiàn)[22].為此Le Ru[29]等提出使用雙分子分析測(cè)量法: 同時(shí)對(duì)兩種不同的分子進(jìn)行SERS檢測(cè), 并在結(jié)果中尋找只有單個(gè)分子光譜的獨(dú)立事件.在高濃度樣品中由于存在大量的分子, SERS信號(hào)原則上應(yīng)該是兩種分析物的混合光譜.然而在單分子水平中, 熱點(diǎn)區(qū)域內(nèi)只有少量分子存在,測(cè)量獲取的SERS光譜會(huì)出現(xiàn)只有單個(gè)分析物SERS光譜的獨(dú)立事件.但是從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度來(lái)講, 利用雙分子分析測(cè)量法獲得SM-SERS信號(hào)選用的樣品濃度較高時(shí), 獲得SERS光譜為單分子事件的概率更高.這是因?yàn)椴杉庾V時(shí)會(huì)出現(xiàn)混合及純A(或純B)光譜事件, 混合光譜顯然為多個(gè)分子(一個(gè)以上的分子)事件, 而純A(或純B)光譜事件可能源于兩種情況: 1)檢測(cè)區(qū)域內(nèi)所有分子都是同一種分子; 2)或者檢測(cè)區(qū)域內(nèi)有單個(gè)分子位于熱點(diǎn)區(qū)域, 掩蓋了其他分子的SERS光譜, 即我們所需要的單分子光譜.在分子濃度相對(duì)較高的情況下檢測(cè)區(qū)域包含的靶分子數(shù)目會(huì)增多(假設(shè)有N個(gè)),檢測(cè)區(qū)域內(nèi)N個(gè)分子為同一種分子(純A或純B分子)的概率為(1/2)N, 因此該信號(hào)為單個(gè)分子光譜的概率為1–(1/2)N.在N較高時(shí), 此概率接近于1, 因此可以大概率確定獲得的純A(或純B)光譜是單分子事件.這種方法從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)刈C實(shí)了SM-SERS的存在, 并被廣泛的使用.Mao等[49]通過(guò)物理沉積的手段獲得銀納米顆粒-金納米碗復(fù)合襯底, 通過(guò)模擬計(jì)算發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)具有強(qiáng)大的電磁場(chǎng)增強(qiáng)效果.基于雙分子分析方法在該基底表面成功獲得SM-SERS信號(hào).實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在采集了大量光譜后經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)計(jì)算發(fā)現(xiàn)單個(gè)Rh6G分子事件與單個(gè)CV分子事件比例接近相同, 如圖5(a)所示.該結(jié)果與先前Etchegoin等[50]報(bào)道的單分子靈敏度比率相匹配.另一種與之類似的方法使用含有某種同位素的相同分子來(lái)代替兩個(gè)不同分子進(jìn)行檢測(cè), 從而保證了兩種分子具有完全相同的化學(xué)結(jié)合能和拉曼散射截面, 可以更準(zhǔn)確地判斷SMSERS事件[51], 如圖5(b)所示.雙分子分析方法雖然沒(méi)有從實(shí)驗(yàn)角度解決“熱點(diǎn)”不均勻分布及靶分子在“熱點(diǎn)”中有效吸附的問(wèn)題, 但是從測(cè)量方法和統(tǒng)計(jì)學(xué)角度給出了獲取SM-SERS光譜的科學(xué)方法, 更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)刈C實(shí)了SERS的單分子檢測(cè)能力.

圖5 雙分析物測(cè)量法獲取SM-SERS (a) Rh6G事件、CV事件和混合事件的SERS光譜圖(左)及三種事件的統(tǒng)計(jì)直方圖(右)[49]; (b)不同同位素標(biāo)記Rh6G后獲得的三種不同獨(dú)立事件SERS光譜(左)及三種事件發(fā)生次數(shù)統(tǒng)計(jì)圖(右邊)[51]Fig.5.Typical SM-SERS spectra in bi-analyte measurements: (a) SERS spectra of an Rh6G event, CV event and mixed event(left), and statistical histograms of the three events (right)[49]; (b) SERS spectra of three different independent events (left), and statistics of the three events (right) by labelling Rh6G with different isotopes[51].

雙分子分析方法從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度給出了獲取SM-SERS的方法, 然而在實(shí)驗(yàn)中使用了較高的分子濃度, 導(dǎo)致大量分子吸附在無(wú)效區(qū)域, 無(wú)法充分發(fā)揮SERS的高靈敏度的優(yōu)勢(shì).因此SERS技術(shù)需要進(jìn)一步對(duì)材料進(jìn)行設(shè)計(jì)和優(yōu)化, 降低對(duì)分子濃度的需求, 使SERS的檢測(cè)限能夠被真正地提高.對(duì)此相關(guān)學(xué)者提出了兩類不同的解決方案, 第一類方案先將分子分散在固體基底表面, 然后在分子位置構(gòu)建“熱點(diǎn)”進(jìn)行探測(cè), 這樣能夠保證待測(cè)分子處于有效“熱點(diǎn)”區(qū)域, 從而獲得SM-SERS光譜.其中代表性技術(shù)為T(mén)ERS[33,34], 納米腔體增強(qiáng)拉曼散射[52]及廈門(mén)大學(xué)的田中群院士團(tuán)隊(duì)[53]提出的殼層隔絕納米顆粒增強(qiáng)拉曼散射.此類技術(shù)具有納米級(jí)甚至亞納米級(jí)別的空間分辨率, 增強(qiáng)能力較高,可以探測(cè)拉曼活性較低的分子, 適用于針對(duì)特定分子進(jìn)行原位研究.而第二類工作的思路與上述方法相反, 先設(shè)計(jì)材料的“熱點(diǎn)”結(jié)構(gòu), 然后再將單個(gè)目標(biāo)分子誘導(dǎo)至“熱點(diǎn)”區(qū)域.常見(jiàn)的方法是利用表面改性、DNA生物技術(shù)等方法對(duì)熱點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行修飾,然后將待測(cè)分子吸附或固定到“熱點(diǎn)”位置[30,54], 該方法不需要用到雙分子測(cè)量方法以及復(fù)雜的檢測(cè)設(shè)備, 在實(shí)用性和經(jīng)濟(jì)性方面具有優(yōu)勢(shì), 其技術(shù)特點(diǎn)有利于發(fā)揮SM-SERS特異性檢測(cè)的優(yōu)勢(shì), 進(jìn)一步拓寬SERS在DNA組裝[55]、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析[56]及多相催化[57]等領(lǐng)域的應(yīng)用.

3 單分子SERS的光譜特性與機(jī)理分析

早期研究階段, 科研人員在尋找單分子光譜過(guò)程中將SERS信號(hào)的劇烈波動(dòng)視為SM-SERS的特征.光譜波動(dòng)包括: 分子的漂移, 光譜的閃爍, 以及特定振動(dòng)模式的相對(duì)強(qiáng)度變化等.后來(lái)經(jīng)過(guò)研究證實(shí)在多分子或其他環(huán)境中也會(huì)出現(xiàn)類似的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象[47].雖然這種獲得SM-SERS的方法缺少科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)性, 但是光譜波動(dòng)也確是SM-SERS的一種特征性行為.研究SM-SERS光譜波動(dòng)能夠從微觀的角度去理解單分子的物理化學(xué)性質(zhì), SERS的增強(qiáng)機(jī)理及光譜本身的一些現(xiàn)象, 使研究者能夠清楚地認(rèn)識(shí)到化學(xué)反應(yīng)的本質(zhì)以及分子在微觀系統(tǒng)中的行為特性.在本節(jié)中我們將從分子的漂移[58,59]、光譜強(qiáng)度的閃爍[60,61]及光譜展寬[21,62]等方面[63,64]討論SM-SERS的光譜波動(dòng), 并結(jié)合相關(guān)研究報(bào)道對(duì)其中的物理機(jī)制做詳細(xì)地分析.

3.1 分子漂移

在SM-SERS研究中, 分子漂移指探針?lè)肿釉跓狳c(diǎn)附近內(nèi)外做無(wú)規(guī)則運(yùn)動(dòng)[65], 其主要原因可能是由于熱效應(yīng), 以及分子與襯底表面之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移所導(dǎo)致[59,66,67], 而SERS中的電磁場(chǎng)增強(qiáng)是導(dǎo)致SERS光譜隨空間和時(shí)間變化的主要原因[22,68].如6圖所示的二聚體結(jié)構(gòu), 根據(jù)電磁場(chǎng)耦合理論二聚體納米結(jié)構(gòu)在外場(chǎng)Eλ的作用下, 間隙中會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的局域電磁場(chǎng)Eloc(“熱點(diǎn)”), 而且隨著間隙的減小(間隙不小于0.5 nm)Eloc增強(qiáng)[69].考慮到單個(gè)分子在“熱點(diǎn)”附近內(nèi)外做無(wú)規(guī)則運(yùn)動(dòng)以及相應(yīng)光學(xué)理論, SM-SERS的信號(hào)ISM-SERS可以表示為[70]

其中,ωR和ω0分別表示單個(gè)分子偶極子的振蕩頻率以及激發(fā)光的頻率,α′表示拉曼張量,G(Ω)是拉曼張量α′經(jīng)變換后的旋轉(zhuǎn)矩陣,Ω是探針?lè)肿拥娜∠?rm表示分子與“熱點(diǎn)”中心處O(電磁場(chǎng)最強(qiáng)的區(qū)域)的距離.為了更好的理解分子漂移產(chǎn)生的SERS強(qiáng)度波動(dòng), 我們用圖6來(lái)解釋這一原因.當(dāng)單個(gè)分子吸附在熱點(diǎn)區(qū)域內(nèi), 分子發(fā)生橫向漂移(rm變化)使分子位置發(fā)生幾個(gè)納米的變化從而導(dǎo)致分子SERS強(qiáng)度發(fā)生幾個(gè)量級(jí)的變化.

圖6 單個(gè)分子在熱點(diǎn)區(qū)域內(nèi)發(fā)生漂移示意圖, 其中Eλ是入射光的電場(chǎng), K ′ 表示波矢, O是“熱點(diǎn)”中心Fig.6.The schematic diagram of the diffusion of a singlemolecule in the hot spot area.Where Eλ is the electric field of the incident light, K ′ is the wave vector and O is the"hot spots" center.

Stranahan等[58]結(jié)合超分辨成像技術(shù)在銀二聚體中繪制出SERS質(zhì)心的二維分布圖以及每個(gè)質(zhì)心位置處的平均SERS強(qiáng)度.研究人員發(fā)現(xiàn)質(zhì)心的運(yùn)動(dòng)是金屬表面單分子發(fā)生橫向漂移所導(dǎo)致的,并證明了單個(gè)Rh6G分子隨著時(shí)間的變化在熱點(diǎn)內(nèi)外發(fā)生漂移, 如圖7所示.隨后該課題組利用SM-SERS同位素標(biāo)記的分析物超分辨率成像揭示了SERS發(fā)射質(zhì)心和相應(yīng)強(qiáng)度之間的空間關(guān)系, 并以此說(shuō)明了納米顆粒表面上的分子運(yùn)動(dòng)行為[71].該實(shí)驗(yàn)結(jié)果有助于追蹤單個(gè)分子在SERS活性納米顆粒表面上的運(yùn)動(dòng), 并且能夠繪制出圖像說(shuō)明納米顆粒是如何實(shí)現(xiàn)局域電磁場(chǎng)增強(qiáng)的.此外, 吸附在熱點(diǎn)附近分子的取向Ω發(fā)生變化(定向漂移)也會(huì)影響光譜的波動(dòng).因?yàn)榉肿拥奈椒绞娇赡苁瞧教伞A斜或垂直于金屬表面, 在這種情況下分子的偶極矩方向可能會(huì)表現(xiàn)出與熱點(diǎn)中電磁場(chǎng)的極化方向不一致的情況, 這種差異在SM-SERS光譜中可以明顯被觀察到.Marshall等[72]基于實(shí)驗(yàn)測(cè)量和模擬計(jì)算證明該研究中所制備的銀納米球腔體具有SM-SERS檢測(cè)能力, 并發(fā)現(xiàn)來(lái)自納米間隙的SM-SERS信號(hào)強(qiáng)烈依賴于分子取向.在單分子體系中, 分析物的隨機(jī)取向不再是許多分子的平均,因此必須考慮分子拉曼活性偶極矩相對(duì)于增強(qiáng)電場(chǎng)極化的方向.結(jié)合密度函數(shù)理論計(jì)算結(jié)果與光譜實(shí)驗(yàn), 作者確定了等離激元納米間隙中分子的取向分布情況, 如圖8所示.這種在單分子水平上對(duì)分子取向的研究和確認(rèn)對(duì)于分子電子器件方面的研究具有重要借鑒意義.該研究團(tuán)隊(duì)隨后繼續(xù)在這一納米系統(tǒng)中研究了單分子級(jí)別共軛聚合物分子的取向分布情況[73].結(jié)合理論計(jì)算和SM-SERS光譜數(shù)據(jù)得出共軛聚合物分子鏈相對(duì)于金屬表面更容易呈現(xiàn)平行吸附模式.該實(shí)驗(yàn)為理解共軛聚合物在金屬表面的取向分布, 優(yōu)化共軛聚合物器件(如: 有機(jī)發(fā)光二極管等電子器件)提供了可靠的實(shí)驗(yàn)支撐.

圖7 單個(gè)分子漂移行為的探究[58] (a) SERS質(zhì)心位置在二維空間中出現(xiàn)的次數(shù)(右邊色條代表事件次數(shù)); (b) 在每個(gè)質(zhì)心位置測(cè)得的平均SERS強(qiáng)度, 其中納米粒子發(fā)射質(zhì)心設(shè)置為(0, 0); (c) SRER質(zhì)心的位置和強(qiáng)度隨時(shí)間發(fā)生變化, 這表明單個(gè)探針?lè)肿釉跓狳c(diǎn)附近發(fā)生漂移Fig.7.Study on the diffusion behavior of a single molecule[58]: (a) The number the SERS centroid position that appears in two-dimensional space during the detection (the right color bar represents the number of events); (b) the average SERS intensity measured at each centroid, where the emission centroid of nanoparticles is set to (0, 0); (c) the intensity and position of SERS centroid change with time, which indicates that single molecule wanders around the hot spots.

圖8 SM-SERS中分子不同取向?qū)庾V產(chǎn)生波動(dòng)影響[72] (a) 銀納米腔體結(jié)構(gòu)示意圖; (b) 光譜1—3表示納米間隙中不同取向分子的SM-SERS信號(hào), 光譜4表示高濃度普通SERS光譜; (c) Rh6G分子的結(jié)構(gòu)以及不同場(chǎng)方向在分子α-γ和α-β平面上的投影Fig.8.The effects of molecular orientations on spectrum fluctuations in SM-SERS[72]: (a) Schematic diagram of silver nanocavity structure; (b) spectrum 1–3 is SM-SERS signals of molecules with different orientations in the nan-gap, and spectrum 4 is the SERS spectrum of high concentration molecules; (c) the chemical structure of Rh6G molecule and the projection of different field directions on the α-γ and α-β planes of this molecule.

SM-SERS的另一個(gè)重要應(yīng)用在于對(duì)催化反應(yīng)內(nèi)在機(jī)理的研究, 催化反應(yīng)涉及復(fù)雜的反應(yīng)步驟和多樣的中間產(chǎn)物, 實(shí)驗(yàn)中往往只能觀察到最終產(chǎn)物或幾種重要的中間產(chǎn)物, 而對(duì)大多數(shù)的中間過(guò)程無(wú)法進(jìn)行系統(tǒng)地研究.SM-SERS技術(shù)可以對(duì)化學(xué)反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè), 能夠?qū)Ψ磻?yīng)過(guò)程的中間產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及反應(yīng)步驟進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析, 有助于研究人員從微觀狀態(tài)研究和認(rèn)識(shí)化學(xué)反應(yīng)的本質(zhì).但是在實(shí)際操作中, 對(duì)于給定的SM-SERS軌跡中的單個(gè)事件, 研究人員無(wú)法確定該事件是由化學(xué)反應(yīng)引起的還是因?yàn)閱蝹€(gè)分子發(fā)生漂移或者其他非反應(yīng)過(guò)程所導(dǎo)致.基于此, Choi等[65]通過(guò)在“銀納米球-金膜”結(jié)構(gòu)的納米間隙中吸附4-NTP分子對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行了研究, 如圖9所示.在波長(zhǎng)為633 nm的激發(fā)條件下, 作者觀察到了隨時(shí)間變化并且具有階躍特征的SERS光譜, 并認(rèn)為這些光譜的階躍信號(hào)對(duì)應(yīng)于單個(gè)分子在熱點(diǎn)處發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)事件.由于單個(gè)分子在熱點(diǎn)中發(fā)生漂移時(shí)只涉及物理變化而與化學(xué)反應(yīng)無(wú)關(guān), 因此光譜的階躍頻率f與分子的衰減速率常數(shù)kNBT之間不存在線性關(guān)系.然而, 作者在該實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)4-NTP分子的衰減速率常數(shù)kNBT與光譜的階躍頻率f呈明顯的線性依賴關(guān)系, 如圖9(d)所示.因此, 作者認(rèn)為實(shí)驗(yàn)中觀察到的光譜波動(dòng)現(xiàn)象是由化學(xué)反應(yīng)所導(dǎo)致, 從而排除了分子發(fā)生漂移的可能性.

圖9 (a)“銀納米球-金膜”納米腔體結(jié)構(gòu)用于SERS測(cè)量及納米腔暗場(chǎng)散射光譜[65]; (b) 催化反應(yīng)生成中間產(chǎn)物的間歇性光譜特征軌跡[65]; (c) 在開(kāi)(紅)和關(guān)(藍(lán))期間從圖9(b)中取樣的SERS光譜, 兩者光譜的差異(橙)及其協(xié)方差矩陣VX = 1364 cm–1分量(綠).在1160, 1314, 1364 cm–1處出現(xiàn)間歇性SERS峰歸因于中間產(chǎn)物羥胺基苯硫醇分子的拉曼峰[65]; (d)光譜的上升沿階躍頻率fup(左)和下降沿階躍頻率fdown(右)與4-NTP分子的衰減速率常數(shù)kNBT之間的關(guān)系[65]Fig.9.(a) The “silver nanosphere-gold film” nanocavity structure in SERS measurement[65] (This figure contains chemical structures of NBT and DMAB molecules, as well as the dark field scattering spectrum of a single nanostructure cavity); (b) the trace of the intermittent spectral characteristics of intermediates generated by catalytic reaction[65]; (c) SERS spectra sampled from Fig.9(b)during on (red) and off (blue), the differences between the two spectra (orange) and the VX = 1364 cm–1 component (green) of the covariance matrix.The intermittent SERS peaks at 1160, 1314 and 1364 cm–1 are attributed to the Raman peaks of the intermediate product hydroxyl aminobenzenethiol[65]; (d) the relationship between the spectral step-up frequency fup (left) and step-down frequency fdown (right) and the decay rate constant kNBT of 4-NTP molecule[65].

基于上面的討論分析, 我們總結(jié)出在SM-SERS中分子的漂移分為兩種情況: 橫向與定向.對(duì)于橫向漂移而言, 由于分子在熱點(diǎn)內(nèi)外做無(wú)規(guī)則隨機(jī)運(yùn)動(dòng), 分子經(jīng)歷了不同強(qiáng)度的局域電磁場(chǎng)使得SERS強(qiáng)度發(fā)生變化.在定向的漂移中, 分子在金屬表面的吸附方式不同造成分子的取向與局域電磁場(chǎng)極化方向存在差異, 導(dǎo)致拉曼峰的相對(duì)強(qiáng)度發(fā)生變化.在SM-SERS信號(hào)采集實(shí)驗(yàn)中, 這兩種漂移方式有可能是同時(shí)存在的, 并且隨著光譜采集時(shí)間的推移, 我們也會(huì)從光譜數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)分子在某些波數(shù)處的拉曼峰強(qiáng)會(huì)出現(xiàn)類似“強(qiáng)-弱”交替的循環(huán)現(xiàn)象, 這就是接下來(lái)要討論的SM-SERS中的“閃爍”現(xiàn)象.

3.2 光譜閃爍

一般在采集SM-SERS光譜時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)探針的拉曼信號(hào)在某個(gè)波數(shù)處發(fā)生波動(dòng), 該現(xiàn)象被稱為閃爍, 它是SM-SERS中光譜信號(hào)發(fā)生“開(kāi)-關(guān)”循環(huán)并且可以持續(xù)幾毫秒甚至幾分鐘的一種實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象.通常認(rèn)為分子發(fā)生漂移是SM-SERS發(fā)生閃爍的根本來(lái)源.當(dāng)金屬納米結(jié)構(gòu)的形貌、顆粒之間的間距及激發(fā)波長(zhǎng)等外在實(shí)驗(yàn)條件確定后, 襯底的熱點(diǎn)強(qiáng)度和分布不會(huì)發(fā)生明顯地變化, 但是處在熱點(diǎn)中的單個(gè)分子會(huì)在熱點(diǎn)內(nèi)外產(chǎn)生漂移, 導(dǎo)致該單個(gè)分子經(jīng)歷不同強(qiáng)度的電磁場(chǎng)(幾個(gè)數(shù)量級(jí)的變化)[22],這是SM-SERS中閃爍現(xiàn)象的根本原因.隨著SMSERS研究進(jìn)一步的深入, 有研究表明溫度升高產(chǎn)生的熱效應(yīng)[74?77]、電荷轉(zhuǎn)移[61,67]及其他因素[61,78]也是誘導(dǎo)單分子閃爍的原因.下面將對(duì)SM-SERS閃爍背后的基本理論和相關(guān)工作做具體討論.

單分子光譜波動(dòng)的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象一直存在.在光譜測(cè)量過(guò)程中, 不管是拉曼信號(hào)還是熒光光譜信號(hào)都會(huì)出現(xiàn)這樣的情況.為了更清晰地揭示該現(xiàn)象背后的物理機(jī)制, Haran工作組[78]在銀納米晶體上吸附Rh6G分子, 并在532 nm光源的激發(fā)下觀察到了單個(gè)Rh6G分子在數(shù)秒級(jí)的時(shí)間尺度上發(fā)生了閃爍現(xiàn)象, 如圖10所示.作者研究了不同條件下單個(gè)Rh6G分子的SERS光譜動(dòng)力學(xué), 并進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析.研究發(fā)現(xiàn), 單個(gè)Rh6G分子的SERS信號(hào)隨時(shí)間波動(dòng)的尺度取決于激光的功率(非光熱)和電解質(zhì)的濃度.隨著激光功率的提高, 光譜波動(dòng)尺度增大.作者認(rèn)為其主要原因是由金屬與吸附分子之間的電荷轉(zhuǎn)移所導(dǎo)致的.此外, 另一種解釋是由于分子在金屬表面運(yùn)動(dòng)所致.而這種運(yùn)動(dòng)可能是源于單個(gè)分子與金屬表面發(fā)生了“脫吸-再吸附”的現(xiàn)象.然而, 隨著膠體中鹽溶液濃度的增加, 膠體顆粒周圍雙層的靜電勢(shì)發(fā)生變化, 影響金屬表面的局域功函數(shù)(局域電荷密度), 從而導(dǎo)致SM-SERS的光譜波動(dòng)被強(qiáng)烈抑制.該工作為后續(xù)研究SMSERS中的閃爍現(xiàn)象提供了理論依據(jù).

圖10 SM-SERS的閃爍現(xiàn)象[78]: 單個(gè)Rh6G分子SERS信號(hào)隨時(shí)間變化的軌跡圖, 其中在波數(shù)614 cm–1和774 cm–1處發(fā)生明顯的光譜波動(dòng)Fig.10.The Blinking phenomenon in SM-SERS [78]: The time-dependent trajectories of SERS signal of a single Rh6G molecule.Obvious spectral fluctuations are observed at 614 cm–1 and 774 cm–1.

Maruyama等[76]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了溫度升高產(chǎn)生的熱活化效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致SERS光譜產(chǎn)生閃爍現(xiàn)象.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SM-SERS光譜閃爍現(xiàn)象與溫度有關(guān).當(dāng)溫度變化時(shí), 研究者觀察到了拉曼光譜閃爍現(xiàn)象的發(fā)生-抑制-復(fù)現(xiàn).考慮到熱效應(yīng)可能對(duì)金屬納米顆粒形貌有影響, 作者通過(guò)改變激光功率及在高溫環(huán)境中退火1 h后, 發(fā)現(xiàn)金屬的形貌沒(méi)有發(fā)生明顯的變化, 排除了局域電場(chǎng)變化對(duì)探針?lè)肿有盘?hào)的影響.因此, 作者認(rèn)為溫度升高產(chǎn)生的熱效應(yīng)導(dǎo)致單分子拉曼信號(hào)發(fā)生閃爍現(xiàn)象.這可能是由于Ag表面等離激元熱效應(yīng)提供了足夠大的熱能克服了分子的擴(kuò)散勢(shì)壘, 使得分子能夠在金屬表面發(fā)生漂移.隨后聶書(shū)明課題組[61]也研究了SM-SERS中閃爍的現(xiàn)象, 提出閃爍是由單個(gè)分子在納米顆粒表面上的熱活化擴(kuò)散引起的, 并認(rèn)為激光的功率、波長(zhǎng)、光誘導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)移及表面活性位的結(jié)構(gòu)弛豫可能是導(dǎo)致閃爍的原因.最近, Lindquist[79]等通過(guò)快速成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)金屬納米結(jié)構(gòu)表面的原子擴(kuò)散引起熱點(diǎn)變化也是導(dǎo)致SM-SERS發(fā)生閃爍現(xiàn)象的一個(gè)原因.研究人員利用一種捕獲率為800000幀/s并且空間分辨率為7 nm的成像技術(shù)對(duì)銀納米殼層表面單個(gè)分子的拉曼光譜進(jìn)行探測(cè), 如圖11所示.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在金屬表面被化學(xué)鍵固定的分子的SERS光譜信號(hào)以一定的速度在發(fā)生波動(dòng).作者通過(guò)進(jìn)一步的觀察和研究推斷出金屬表面銀原子的重構(gòu)驅(qū)動(dòng)熱點(diǎn)產(chǎn)生移動(dòng)是導(dǎo)致SERS波動(dòng)的原因, 其模擬分析結(jié)果與推斷結(jié)論幾乎一致.

圖11 高速SERS信號(hào)采集和超分辨率成像[79] (a) SM-SERS放大后的兩個(gè)波動(dòng)圖, 每個(gè)持續(xù)約0.3 ms, 相距61 ms; (b)光電探測(cè)器上接收到兩個(gè)易于區(qū)分的光譜波動(dòng)事件成像; (c)在納米粒子的空間位置上繪制的三個(gè)光譜波動(dòng)軌跡Fig.11.High-speed SERS acquisition and super-resolution SERS imaging[79]: (a) Each of two amplified wave patterns of SM-SER spectra lasted for about 0.3 ms and separated by 61 ms; (b) images of spectral fluctuation events; (a) three spectral wave trajectories on the spatial position of nanoparticles.

通過(guò)上述典型的研究報(bào)道可以將SM-SERS發(fā)生閃爍的原因歸結(jié)如下: 1)由于熱效應(yīng)導(dǎo)致熱點(diǎn)附近的單個(gè)分子發(fā)生漂移擴(kuò)散; 2)分子與金屬表面存在電荷轉(zhuǎn)移; 3)在溶液體系中由于分子做無(wú)規(guī)則運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致分子在納米結(jié)構(gòu)表面發(fā)生脫吸和再吸附的過(guò)程; 4)染料分子發(fā)生光漂白; 5)熱點(diǎn)擴(kuò)散.雖然與閃爍相關(guān)的研究工作較多, 但是該研究仍是一個(gè)有爭(zhēng)議的話題.目前大多數(shù)研究只是通過(guò)實(shí)驗(yàn)定性地分析了閃爍的原因, 因此仍然需要做進(jìn)一步工作從實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象背后的物理機(jī)制來(lái)分析該現(xiàn)象.在采集SM-SERS光譜時(shí), 分子的閃爍是我們要注意的一個(gè)現(xiàn)象.因?yàn)橥ㄟ^(guò)SM-SERS光譜研究單分子化學(xué)反應(yīng)過(guò)程需要區(qū)分到底是反應(yīng)導(dǎo)致的光譜發(fā)生波動(dòng)還是發(fā)生了閃爍現(xiàn)象, 這就要求我們選擇合適的激光功率和波長(zhǎng)、溫度及適宜的環(huán)境體系等來(lái)避免閃爍現(xiàn)象對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響.

3.3 光譜頻移與展寬

在拉曼光譜中可以觀察到均勻展寬和非均勻展寬的現(xiàn)象, 前者源于分子內(nèi)的非諧相互作用, 這是單分子振動(dòng)的一個(gè)基本特性, 而后者則代表了分子在樣品中不同位置中的變化[21].在收集SM-SERS光譜時(shí), 研究者發(fā)現(xiàn)這些單個(gè)分子的光譜擬合成平均光譜后, 光譜呈現(xiàn)出不對(duì)稱的洛倫茲曲線, 這種現(xiàn)象叫做SM-SERS光譜的不均勻展寬現(xiàn)象.另外, 隨著溫度的升高SM-SERS光譜的譜寬表現(xiàn)出增大趨勢(shì), 該現(xiàn)象稱之為SM-SERS光譜的均勻展寬.在SM-SERS中, 分子間的相互作用及分子與周圍環(huán)境的相互作用都會(huì)導(dǎo)致光譜出現(xiàn)展寬現(xiàn)象.

Etchegoion等[62]在低溫環(huán)境下, 利用高分辨光柵(2400 mm–1)觀察了尼羅藍(lán)分子和羅丹明800分子分別在590 cm–1和2226 cm–1處的不均勻展寬現(xiàn)象, 如圖12(a)和12(b)所示.作者擬合了大量的單分子光譜后發(fā)現(xiàn), 與正常的多分子光譜相比, 擬合的平均光譜呈現(xiàn)出不對(duì)稱分布的現(xiàn)象.作者認(rèn)為不均勻的展寬是由于分子間的相互作用或分子在底物上的相互作用引起的, 并且單個(gè)分子光譜之間拉曼峰的頻率差異是導(dǎo)致非均勻展寬的主要原因.此外, 作者從分子與基底的相互作用,同位素效應(yīng), 還有儀器方面解釋和討論了單分子光譜頻率發(fā)生移動(dòng)的可能來(lái)源.研究結(jié)果表明同位素位效應(yīng)、光譜儀響應(yīng)不完全是頻率漂移的主要原因.對(duì)同一分子不同峰的不均勻展寬進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析將有助于揭示和理解分子與周圍環(huán)境相互作用的具體行為細(xì)節(jié).隨后該課題組[21]又研究了溫度變化對(duì)單個(gè)尼羅藍(lán)分子拉曼增強(qiáng)光譜在590 cm–1處的均勻展寬現(xiàn)象的影響.隨著溫度的升高單分子光譜的半高寬發(fā)生均勻展寬現(xiàn)象(半高寬大約從0.9 cm–1增加到2.7 cm–1附近), 如圖12(c).作者認(rèn)為隨著溫度升高光譜出現(xiàn)均勻加寬的現(xiàn)象是由于分子與基底銀聲子發(fā)生非簡(jiǎn)諧耦合所導(dǎo)致.研究SM-SERS的光譜展寬現(xiàn)象, 有助于進(jìn)一步了解分子與其周圍環(huán)境的相互作用(分子之間或分子與基底之間)及溫度等外在因素對(duì)分子自身行為的影響.

圖12 SM-SERS光譜的展寬現(xiàn)象 (a)單個(gè)尼羅藍(lán)染料分子在590 cm–1能量振動(dòng)處的不均勻展寬現(xiàn)象[62]; (b)單個(gè)羅丹明800分子在2226 cm–1能量振動(dòng)處的不均勻展寬現(xiàn)象[62]; (c) SM-SERS事件中單個(gè)尼羅藍(lán)分子在590 cm–1處光譜的半高寬(Γ)與溫度(T)之間的關(guān)系, 表明隨著溫度T升高SM-SERS光譜發(fā)生均勻展寬[21]Fig.12.Broadening of SM-SERS spectrum: (a) Inhomogeneous broadening of a single Nile Blue dye molecule at 590 cm–1 energy vibration[62]; (b) inhomogeneous broadening of a single Rhodamine 800 molecule at 2226 cm–1 energy vibration[62]; (c) the relationship between the FWHM (Γ) of a single Nile Blue molecule indifferent SM-SERS events at 590 cm–1 with increasing temperature T. The result indicates that the SM-SERS spectrum broadens uniformly with the increase of temperature (T)[21].

3.4 小 結(jié)

拉曼光譜信號(hào)波動(dòng)現(xiàn)象是SM-SERS光譜最明顯且重要的特征.雖然研究人員當(dāng)前已經(jīng)從溫度、激發(fā)條件、電荷轉(zhuǎn)移等影響因素分析了SMSERS光譜波動(dòng)的原因, 但是如果要深究其背后的理論機(jī)制及相關(guān)的應(yīng)用仍然需要做進(jìn)一步的工作.目前對(duì)該系統(tǒng)的研究和理解尚不夠全面, 而單分子納米級(jí)別的系統(tǒng)中是一個(gè)復(fù)雜的狀態(tài), 并且影響光譜波動(dòng)的因素還可能與分子本身及分子所處的環(huán)境有關(guān), 如: SM-SERS的振動(dòng)涌出現(xiàn)象及高壓環(huán)境誘導(dǎo)SM-SERS峰位發(fā)生藍(lán)移現(xiàn)象等[64,80,81].因此, 在SM-SERS光譜波動(dòng)的研究中需要盡可能設(shè)計(jì)合理巧妙的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)排除其他因素的干擾.目前已經(jīng)有報(bào)道通過(guò)在金屬表面構(gòu)造超薄的殼層來(lái)避免電荷轉(zhuǎn)移對(duì)光譜波動(dòng)的影響[53]; 而且研究人員利用物理、化學(xué)及生物等手段制備出的超靈敏檢測(cè)基底已滿足SM-SERS的檢測(cè)靈敏度, 但是如何對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行精確地操控使靶分子能夠有效吸附到“熱點(diǎn)”區(qū)域并減弱或者排除單個(gè)分子光譜波動(dòng)對(duì)分子動(dòng)力學(xué)研究的干擾影響, 仍然有待進(jìn)一步的討論和分析.

4 總結(jié)與展望

本文重點(diǎn)研究和探討了SM-SERS的信號(hào)的獲取方法, 以及SM-SERS的光譜波動(dòng)特性和相關(guān)機(jī)理.SM-SERS的優(yōu)勢(shì)在于其對(duì)分子及亞分子化學(xué)鍵的特異性識(shí)別能力, 這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)被初步應(yīng)用于監(jiān)測(cè)催化反應(yīng)過(guò)程[44,45,57,82]及生物分子測(cè)序[55,56,83,84]等領(lǐng)域.此外, SM-SERS對(duì)化學(xué)鍵特異性識(shí)別的能力也使得研究分子與周圍環(huán)境的電荷相互作用成為可能, 這被應(yīng)用于確定分子的吸附構(gòu)型、吸附取向分布[36]; 研究分子在光激發(fā)作用下的解吸附過(guò)程[67]; 觀察分子與基底之間的電荷轉(zhuǎn)移等[85].另一方面, 隨著表征儀器不斷的發(fā)展, 近年來(lái)研究者人員在SM-SERS檢測(cè)中結(jié)合TERS技術(shù)能夠在單分子水平中區(qū)分結(jié)構(gòu)相似的待檢測(cè)分子, 其亞納米級(jí)別的空間分辨率可以顯示出單個(gè)分子的分布狀態(tài)、振動(dòng)模式及吸附方式等重要信息, 該技術(shù)有望被推廣到單分子成像研究領(lǐng)域[33?38,86?88].

然而, SM-SERS在信號(hào)采集和數(shù)據(jù)處理方面需要更加可靠的技術(shù)和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆椒? 除了本文已提到的部分, 還需要注意: 1)在SM-SERS光譜收集實(shí)驗(yàn)中, 激發(fā)條件、溫度、光柵分辨率及光譜儀中CCD的曝光時(shí)間等因素會(huì)導(dǎo)致光譜波動(dòng)或影響光譜采集效果.所以在研究分子動(dòng)力學(xué)的過(guò)程中, 需要考慮并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法排除這些因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響.2)雙分子分析方法假設(shè)每個(gè)納米間隙之間形成的“熱點(diǎn)”都會(huì)提供等效的增強(qiáng)因子.而實(shí)際上納米顆粒之間的間隙以及形貌難以完全統(tǒng)一, 這種假設(shè)在實(shí)驗(yàn)中很難實(shí)現(xiàn).因此, 需要建立更加完善和健全的統(tǒng)計(jì)方法使SM-SERS檢測(cè)更具有科學(xué)合理性.3)分子總是處于變化且復(fù)雜的狀態(tài), 揭示單個(gè)分子的自身行為, 以及與周圍環(huán)境的相互作用時(shí)要考慮到瑞利散射和量子效應(yīng)等其他的物理效應(yīng)[19].4)在TERS技術(shù)中, 如何能夠穩(wěn)定、有效地制備出具有幾個(gè)金屬原子組成的超高局域電磁場(chǎng)分布并實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè)的針尖仍然是一個(gè)挑戰(zhàn).

本文從SM-SERS的內(nèi)涵, SM-SERS信號(hào)的獲取及SM-SERS的光譜特征等方面進(jìn)行了初步的探討.由于SM-SERS技術(shù)能夠提供極高的靈敏度及單個(gè)分子在待測(cè)環(huán)境中的行為特征, 因此該技術(shù)有望用于單分子表征分析等相關(guān)領(lǐng)域.希望本文能夠引起讀者的興趣和對(duì)本領(lǐng)域的關(guān)注, 在機(jī)理分析和實(shí)驗(yàn)構(gòu)筑等層面上進(jìn)一步拓展和豐富SMSERS的相關(guān)研究.