許衛(wèi)國，全江濤，周娟，張智林，廖揚(yáng)，陳蕊

分化型甲狀腺癌是甲狀腺癌最常見的類型，約占甲狀腺癌的95%，雖然其惡性程度不高，病死率較低，但術(shù)后易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1］。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是分化型甲狀腺癌患者術(shù)后局部復(fù)發(fā)的重要因素，對于存在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，行頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)已成為臨床共識，但易引起甲狀旁腺損傷、喉返神經(jīng)損傷等術(shù)后并發(fā)癥，因此對于術(shù)前檢查頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的患者是否行預(yù)防性淋巴結(jié)清掃仍存在爭議［2］。早期準(zhǔn)確地判斷分化型甲狀腺癌患者是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有利于臨床制定治療方案。超聲是臨床診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移最常用的影像學(xué)檢查手段，但其診斷價(jià)值還有待進(jìn)一步的提高［3］。近年來微小RNA（miRNA，miR）與惡性腫瘤的關(guān)系成為臨床研究的熱點(diǎn)，miR-155 是一種與甲狀腺癌密切相關(guān)的miRNA。相關(guān)研究顯示其在甲狀腺乳頭狀癌患者血清中呈異常高表達(dá)，且可用于診斷鑒別甲狀腺良、惡性病變［4］。目前大量研究證明，miRNA 等生物標(biāo)志物在診斷惡性腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移領(lǐng)域有一定的應(yīng)用價(jià)值［5-6］。鑒于此，本研究應(yīng)用miR-155聯(lián)合超聲對分化型甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值進(jìn)行分析，以期為臨床診斷提供新的備選生物標(biāo)志物。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2018 年6 月—2020 年4 月在解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院接受治療的分化型甲狀腺癌患者112例作為甲狀腺癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)臨床病理證實(shí)為分化型甲狀腺癌［7］。（2）入組前未接受任何形式的抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤者。（2）分化型甲狀腺癌復(fù)發(fā)者。（3）合并有心、肝、腎功能障礙者。（4）存在血液疾病、免疫系統(tǒng)疾病者。112 例患者中男 30 例，女 82 例，平均年齡（54.81±6.35）歲，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62 例，其中單純中央?yún)^(qū)轉(zhuǎn)移19 例，中央?yún)^(qū)及側(cè)頸轉(zhuǎn)移43 例，無跳躍性轉(zhuǎn)移病例。TNM 分期采用美國癌癥聯(lián)合委員會第8版甲狀腺癌分期系統(tǒng)。另選取同期收治的結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者30例作為良性對照組，其中男10例，女20 例，年齡（54.98±6.52）歲。2 組患者的性別（χ2=0.501）、年齡（t=0.130）比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究已通過我院倫理委員會的審批（批準(zhǔn)號：2018042），患者及其家屬對本研究內(nèi)容均知情同意。

1.2 超聲檢查及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移判定 采用Pihilips IU22 彩色多普勒超聲進(jìn)行檢查，探頭頻率為5～12 MHz。根據(jù)文獻(xiàn)以及臨床經(jīng)驗(yàn)觀察以下超聲征象［8-9］：（1）淋巴結(jié)門結(jié)構(gòu)消失。（2）淋巴結(jié)長短徑比＜2。（3）淋巴結(jié)邊界不清。（4）淋巴結(jié)內(nèi)團(tuán)狀高回聲。（5）淋巴結(jié)出現(xiàn)明顯融合。（6）淋巴結(jié)內(nèi)出現(xiàn)微鈣化或液化。（7）淋巴結(jié)門樣血流信號。（8）皮質(zhì)不均勻增厚。以上超聲征象中若出現(xiàn)2 個(gè)及以上則判定為存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

1.3 血清及組織中miR-155 檢測 患者入院時(shí)抽取空腹靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min后分離血清?；颊呤中g(shù)切除的癌組織以及良性病變組織剪碎后加入液氮研磨。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測血清及組織中miR-155 的相對表達(dá)量。組織或血清中加入Trizol 裂解液（美國Invitrogen公司）提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Fermentas公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。內(nèi)參U6 上游引物5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，下游引物 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'，miR-155 上游引物5'-ACGCTCAGTTAATGCTAATCGTGATA-3'，下游引物5'-ATTCCATGTTGTCCACTGTCTCTG -3'。反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-155的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料經(jīng)檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（ROC）曲線分析miR-155和超聲對分化型甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2 組患者血清及組織中miR-155的相對表達(dá)情況 甲狀腺癌組的血清及組織中miR-155的相對表達(dá)量均明顯高于良性對照組（P＜0.01），見表1。

Tab.1 Expression of miR-155 in serum and tissues of patients with differentiated thyroid cancer and benign control group表1 甲狀腺癌組及良性對照組患者血清及組織中miR-155的表達(dá)情況 （±s）

Tab.1 Expression of miR-155 in serum and tissues of patients with differentiated thyroid cancer and benign control group表1 甲狀腺癌組及良性對照組患者血清及組織中miR-155的表達(dá)情況 （±s）

＊＊P＜0.01

組別n血清miR-155組織miR-155良性對照組301.02±0.411.68±0.74甲狀腺癌組1123.35±1.134.06±1.28 t 11.075＊＊9.741＊＊

2.2 分化型甲狀腺癌患者血清及組織中miR-155的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 不同性別、年齡、癌灶數(shù)量的分化型甲狀腺癌患者血清及組織中miR-155的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑＞2 cm、TNM 分期Ⅲ+Ⅳ期的患者的血清及組織中miR-155的相對表達(dá)量分別高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑≤2 cm、TNM 分期Ⅰ+Ⅱ期的患者（均P＜0.05），見表2。

Tab.2 Relationship between the expression of miR-155 in serum and tissue and clinicopathological parameters in patients with differentiated thyroid cancer表2 分化型甲狀腺癌患者血清及組織中miR-155的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

臨床病n血清t組織t理參數(shù)miR-155miR-155性別男303.19±0.980.9063.87±1.030.901女823.41±1.194.13±1.45年齡＜55歲473.46±1.220.8914.24±1.541.276≥55歲653.27±1.033.93±1.03淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無65 20 32..96 33± ±10..38 4 75.924＊＊4 3..81 13± ±10..59 6 36.710＊＊癌灶數(shù)量多發(fā)413.59±1.261.6864.30±1.541.576單發(fā)713.21±1.083.92±1.01腫瘤直徑＞ ≤22 cc mm 28 66 33..72 53± ±11..20 7 72.077＊4 3..59 80± ±10..49 1 72.798＊＊TNM分期ⅠⅢ++ⅡⅣ期期73 66 34..00 33± ±01..93 1 84.568＊＊3 5..51 62± ±01..95 7 96.412＊＊

2.3 超聲以及血清miR-155 對分化型甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值 以術(shù)后病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分析超聲以及血清miR-155對分化型甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值。ROC 結(jié)果顯示，超聲以及血清miR-155對分化型甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有一定的診斷價(jià)值，但漏診率和誤診率均超過10%；聯(lián)合應(yīng)用則可提升診斷價(jià)值，漏診率和誤診率能夠降至10%以下。見圖1、表3。

Fig.1 ROC curve of ultrasound and serum miR-155 in diagnosing lymph node metastasis of differentiated thyroid cancer圖1 超聲以及血清miR-155診斷分化型甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

3 討論

近年來甲狀腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，尤其以分化型甲狀腺癌中的乳頭狀甲狀腺癌最為顯著［10］。雖然在早期經(jīng)過合理治療后甲狀腺癌患者的10 年生存率可達(dá)到80%～90%，但每年的死亡病例數(shù)仍然居高不下。如何更好地改善患者預(yù)后成為臨床需要進(jìn)一步解決的問題。頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況將直接影響到甲狀腺癌患者治療策略的選擇，同時(shí)也是患者術(shù)后復(fù)發(fā)以及預(yù)后不良的重要因素，因此淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況評估一直是術(shù)前病情分析的重點(diǎn)。超聲是目前臨床評估甲狀腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移最常用的方法，其可通過超聲征象對患者的病情進(jìn)行分析，如淋巴結(jié)門結(jié)構(gòu)消失、皮質(zhì)不均勻增厚、淋巴結(jié)的邊界不規(guī)則或模糊、微鈣化等。但是，憑借以上超聲征象診斷各有局限性，如淋巴結(jié)門結(jié)構(gòu)消失的敏感度極高，但特異度差；微鈣化的特異度高，但敏感度一般［11］。另一方面，分化型甲狀腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移區(qū)域主要為頸中央?yún)^(qū)和頸側(cè)區(qū)，由于頭頸部解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，鎖骨、氣管等結(jié)構(gòu)會對超聲掃描造成一定的影響，且部分患者存在甲狀腺的彌漫性病變，也會對超聲結(jié)果的判斷造成一定干擾［12］。本研究結(jié)果也顯示，超聲診斷分化型甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有較高的漏診率和誤診率，分別為16.13%和16.00%，因此選取合適的生物標(biāo)志物輔助超聲診斷，對準(zhǔn)確評估病情、改善患者預(yù)后有重要的意義。

Tab.3 Diagnostic value of ultrasound and serum miR-155 in lymph node metastasis of differentiated thyroid cancer表3 超聲以及血清miR-155對分化型甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值

miR-155是一種炎癥相關(guān)的miRNA，在肺癌［13］、胃癌［14］、膠質(zhì)瘤［15］等多種惡性腫瘤中發(fā)揮促癌的作用。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌組患者的血清及組織中miR-155 的相對表達(dá)量均明顯高于良性對照組，且分化型甲狀腺癌患者血清及組織中miR-155的相對表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、TNM 分期有關(guān)。這與Geng 等［16］研究結(jié)果一致，提示miR-155在甲狀腺癌呈高表達(dá)，且其高表達(dá)與腫瘤的惡性進(jìn)展有關(guān)。絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（MAPK/ERK）信號通路是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲的關(guān)鍵通路。吳兆書等［17］發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-155可通過激活MAPK/ERK 信號通路促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。還有相關(guān)基礎(chǔ)研究顯示，miR-155可通過激活Wnt/β-catenin信號通路和上調(diào)人錯(cuò)配修復(fù)蛋白mutL同系物1（hMLH1）的表達(dá)而調(diào)控甲狀腺癌的進(jìn)展［18-19］。由此可推測，miR-155 在分化型甲狀腺癌中發(fā)揮著促癌的作用，其可能通過調(diào)節(jié)多個(gè)信號通路以及相關(guān)蛋白影響腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移，進(jìn)而影響淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

miRNA 具有穩(wěn)定表達(dá)、易檢測等特點(diǎn)，是目前研究較多的生物標(biāo)志物類型，可作為傳統(tǒng)診斷手段的有效補(bǔ)充［20］。臨床組織樣本獲取需要手術(shù)或有創(chuàng)檢查，不適宜作為術(shù)前評估病情的手段，因此本研究僅分析了血清miR-155對分化型甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值。ROC分析發(fā)現(xiàn)，超聲以及血清miR-155對分化型甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有一定的診斷價(jià)值，但漏診率和誤診率均超過10%。而兩者聯(lián)合應(yīng)用后使得診斷價(jià)值得到了進(jìn)一步的提升，漏診率和誤診率也降至10%以下。

綜上所述，分化型甲狀腺癌患者血清及組織中miR-155 的表達(dá)均異常升高，且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性進(jìn)展有關(guān)。檢測血清miR-155的水平可用于輔助超聲診斷分化型甲狀腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，miR-155 可作為診斷分化型甲狀腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的備選生物標(biāo)志物。然而，本研究尚存在不足之處，如納入病例數(shù)較少，未分析miR-155與患者預(yù)后以及復(fù)發(fā)情況的關(guān)系等，這些將在后續(xù)的研究中不斷完善。