[1.遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院骨科，廣東 珠海519100；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，廣東 廣州510080]

長(zhǎng)期高劑量使用激素導(dǎo)致的股骨頭缺血性壞死稱為激素性股骨頭缺血性壞死(steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH)，其致殘率較高，是骨科常見的難治癥之一。目前，SANFH主要治療手段包括髖關(guān)節(jié)牽引制動(dòng)、中藥治療、鈣劑治療等，但都缺乏確切療效。脂肪組織遍布于哺乳動(dòng)物全身，不僅維持能量代謝，而且有內(nèi)分泌作用，給組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了新的研究方向。其中干細(xì)胞工程將脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)用于骨關(guān)節(jié)炎、糖尿病、心臟病、乳房切除后和面部創(chuàng)傷后修復(fù)中的軟組織再生和重建[1]，也有研究提出ADSCs可用于修復(fù)缺血壞死的股骨頭，幫助其重建骨小梁等結(jié)構(gòu)[2]，讓SANFH患者看到了治療的新曙光。有觀點(diǎn)認(rèn)為，ADSCs在一些組織損傷的治療過(guò)程中主要依賴其旁分泌功能作用[3]，而目前對(duì)于ADSCs旁分泌因子的研究主要集中于心肌梗死、皮膚軟組織修復(fù)及抗衰老等方面,國(guó)內(nèi)外尚未見ADSCs治療SANFH的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究擬建立兔SANFH模型，評(píng)價(jià)ADSCs旁分泌因子治療兔SANFH的療效。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：63只體質(zhì)量2～3 kg的SPF級(jí)雌性家兔，由四川大學(xué)華西醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(川)2014-0013。主要儀器：血液流變分析儀(LG-R-80A，北京世帝科學(xué)儀器有限公司)、signal excite HD-1.5 Twin-speed MRI掃描儀(GE，美國(guó))、顯微鏡(Leica DM3000，Leica，德國(guó))。主要試劑：4%多聚甲醛固定液(生產(chǎn)批號(hào)：20190103，銀川市偉博鑫生物科技有限公司)、甲基強(qiáng)的松龍琥珀酸鈉(生產(chǎn)批號(hào)：20190723，普強(qiáng)蘇州制藥有限公司)、注射用普魯卡因青霉素(生產(chǎn)批號(hào)：A1900417，華北制藥集團(tuán)先泰藥業(yè)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與動(dòng)物造模[4]隨機(jī)取42只家兔，采用馬血清聯(lián)合甲基強(qiáng)的松龍琥珀酸鈉建立SANFH模型：取馬血清(10 mL/kg)于兔耳緣靜脈注射，3周后重復(fù)注射1次；重復(fù)注射馬血清2周后在兔腹腔內(nèi)注射甲基強(qiáng)的松龍琥珀酸鈉(45 mg/kg)，每天1次，連續(xù)3 d。注射激素期間同時(shí)肌肉注射青霉素10萬(wàn)單位預(yù)防感染，每天1次，連續(xù)7 d。通過(guò)電子計(jì)算機(jī)X射線斷層掃描機(jī)行雙側(cè)股骨頭斷層掃描成像，骨小梁大量空骨陷窩形成或存在核固縮骨細(xì)胞，且骨小梁周圍骨髓組織發(fā)生壞死則可定義為骨壞死，提示造模成功。造模完成后將42只家兔隨機(jī)分為模型組和干預(yù)組，每組21只，其中干預(yù)組在家兔的股骨頭關(guān)節(jié)腔注射ADSCs旁分泌因子100 μL，制作方法：取2×106個(gè)ADSCs細(xì)胞混懸于1 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)中，取0.1 mL PBS與0.1 mL透明質(zhì)酸以1∶1的比例混合制成；模型組家兔在股骨頭關(guān)節(jié)腔注射等量生理鹽水。其余21只家兔設(shè)為對(duì)照組，每次均在兔耳緣靜脈和腹腔內(nèi)注射等量的生理鹽水，同時(shí)預(yù)防性肌肉注射青霉素預(yù)防感染，每天1次，連用7 d。

1.2.2 家兔ADSCs制備[5]無(wú)菌條件下取各組家兔頸背部脂肪組織約3 g，去除血管及淺筋膜等組織后用PBS反復(fù)沖冼，剪碎至糊狀，置于37 ℃恒溫振蕩水浴搖床中，并注入濃度為0.1%的Ⅰ型膠原酶0.2 mL。使用等體積完全培養(yǎng)基中和，離心，棄上清,沉淀，重懸，80目尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾后接種于培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。5 d后換液，吹去紅細(xì)胞。待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)孔面積的60%，使用0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行原代傳代。最終將細(xì)胞制成2×106/mL的ADSCs條件培養(yǎng)液備用。

1.2.3 血液流變學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 在治療前及治療4周后，于禁食12 h后在家兔耳緣靜脈采血5 mL，使用血液流變分析儀測(cè)定家兔全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和紅細(xì)胞壓積等血液流變學(xué)指標(biāo)。

1.2.4 血清軟骨生長(zhǎng)相關(guān)因子檢測(cè) 取2 mL血樣，于4 ℃以1 500 r/min離心5 min，取上清，放射免疫法測(cè)定樣本骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的含量。

1.2.5 MRI最大灌注參數(shù)檢測(cè) 在治療前及治療4周后，以3%戊巴比妥鈉麻醉家兔，使之仰臥于磁共振平臺(tái)上，髖關(guān)節(jié)充分外展，將表面線圈固定于雙側(cè)髖關(guān)節(jié)外側(cè)體表，對(duì)雙側(cè)髖關(guān)節(jié)進(jìn)行動(dòng)態(tài)增強(qiáng)核磁掃描。采用T1加權(quán)的超快梯度回波，在125 s內(nèi)獲得256張動(dòng)態(tài)圖像。預(yù)掃描15 s取得基線數(shù)值后，使用自動(dòng)高壓注射儀以0.5 mL/s的速度和0.5 mmol/kg的劑量通過(guò)耳緣靜脈注射Gd-DTPA和6 mL生理鹽水。選擇股骨頭位置作為感興趣區(qū)測(cè)定信號(hào)強(qiáng)度。基線信號(hào)強(qiáng)度定義為前15 s獲得的圖像信號(hào)強(qiáng)度平均值，最大信號(hào)強(qiáng)度定義為125 s測(cè)定時(shí)間內(nèi)的峰值。灌注參數(shù)最大信號(hào)增強(qiáng)=(最大信號(hào)強(qiáng)度-基線信號(hào)強(qiáng)度)/基線信號(hào)強(qiáng)度×100%，將雙側(cè)股骨頭最大信號(hào)增強(qiáng)的平均值作為每只家兔灌注參數(shù)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.2.6 HE染色觀察病理形態(tài) 完成上述所有檢測(cè)后，處死家兔，取雙側(cè)股骨頭標(biāo)本，10%多聚甲醛固定24 h，快速脫鈣液脫鈣16 h，常規(guī)石蠟包埋切片后行HE染色，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察骨組織、骨髓組織、骨小梁及髓內(nèi)脂肪組織的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 家兔股骨頭病理切片結(jié)果

對(duì)照組家兔的股骨頭標(biāo)本中可見骨小梁排列整齊、致密飽滿，有成骨細(xì)胞附著，骨細(xì)胞清晰可見，骨細(xì)胞核位于中央，髓腔內(nèi)造血細(xì)胞豐富(圖1a)。模型組家兔的股骨頭標(biāo)本中可見骨小梁周圍成骨細(xì)胞缺失，形成大量空骨陷窩，血管內(nèi)血栓形成；骨細(xì)胞核固縮、壞死，骨髓腔內(nèi)出血，造血細(xì)胞壞死(圖1b)。干預(yù)組家兔的股骨頭標(biāo)本中骨細(xì)胞核固縮不明顯，骨陷窩較對(duì)照組略增加部分，部分細(xì)胞核周圍可見空暈形成(圖1c)。

a:對(duì)照組；b：模型組；c：干預(yù)組圖1 家兔股骨頭切片

2.2 家兔MRI最大灌注參數(shù)比較

治療前，3組MRI最大灌注參數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=341.625，P<0.05)，且干預(yù)組和模型組均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，干預(yù)組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.437)。治療后，3組MRI最大灌注參數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=89.761，P<0.05)，且對(duì)照組和干預(yù)組均顯著高于模型組(P<0.05)，干預(yù)組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.331)。治療后，對(duì)照組MRI最大灌注參數(shù)與治療前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)組和模型組MRI最大灌注參數(shù)均較治療前顯著升高(P<0.05)，見圖2。

*：與本組治療前比較，P<0.05圖2 家兔最大灌注參數(shù)比較

2.3 治療后家兔血液流變學(xué)指標(biāo)比較

治療前，干預(yù)組和模型組各血液流變學(xué)指標(biāo)均高于對(duì)照組(P<0.05)；但干預(yù)組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與治療前比較，治療后干預(yù)組各血液流變學(xué)指標(biāo)均顯著下降(P<0.05)，對(duì)照組和模型組與治療前比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后，3組各血液流變學(xué)指標(biāo)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且模型組均高于對(duì)照組和干預(yù)組(P<0.05)，干預(yù)組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 家兔血液流變學(xué)指標(biāo)比較

2.4 家兔血清BMP-2和TGF-β水平

治療前，對(duì)照組BMP-2和TGF-β含量高于模型組和干預(yù)組(P<0.05)，模型組和干預(yù)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與治療前比較，治療后干預(yù)組BMP-2和TGF-β水平均顯著升高(P<0.05)，模型組和對(duì)照組BMP-2和TGF-β水平無(wú)明顯變化(P>0.05)。治療后，模型組BMP-2和TGF-β水平低于干預(yù)組與對(duì)照組(P<0.05)，但干預(yù)組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 家兔血清BMP-2和TGF-β水平

3 討論

一項(xiàng)研究表明，高劑量皮質(zhì)類固醇(強(qiáng)的松類>20 mg·kg-1·d-1)的使用與股骨頭壞死之間存在顯著相關(guān)性[6]，而其長(zhǎng)期使用是導(dǎo)致非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的主要原因[7]，這可能是由于長(zhǎng)期使用高劑量糖皮質(zhì)激素可直接或間接導(dǎo)致凝血障礙，使血液處于高凝狀態(tài)，顯著降低股骨頭和股骨頸血流量[8]，隨后出現(xiàn)血流不暢、缺血，最終導(dǎo)致缺血性股骨頭壞死。研究表明，ADSCs可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱等多種細(xì)胞，補(bǔ)充替代老化、缺損的組織細(xì)胞；還可通過(guò)旁分泌功能合成及分泌多種細(xì)胞因子、多肽類、氣體分子等活性成分，提高受損細(xì)胞的生命力和抗凋亡能力。但也有研究認(rèn)為，ADSCs在一些組織損傷的治療過(guò)程中主要依賴旁分泌功能，因而ADSCs的旁分泌功能成為了目前研究的熱點(diǎn)[9]。本研究通過(guò)建立兔SANFH模型，探討ADSCs旁分泌因子治療兔SANFH的療效。

通過(guò)MRI觀察家兔股骨頭組織內(nèi)部血流的灌注情況，可以評(píng)估組織血液灌注狀態(tài)[10]。Kolb等[11]和Momii等[12]使用MRI評(píng)估壞死股骨頭的血運(yùn)重建，認(rèn)為通過(guò)MRI可了解股骨頭血流灌注情況，評(píng)估股骨頭狀態(tài)。本研究運(yùn)用MRI評(píng)估家兔股骨頭血液灌注情況，結(jié)果顯示，干預(yù)組和模型組治療后MRI最大灌注參數(shù)均顯著上升，且干預(yù)組治療后MRI最大灌注參數(shù)顯著高于模型組，而治療后干預(yù)組和對(duì)照組最大灌注參數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明ADSCs可改善SANFH家兔股骨頭的血液灌注情況，且經(jīng)ADSCs旁分泌因子干預(yù)的家兔恢復(fù)情況顯著優(yōu)于模型組，可達(dá)到對(duì)照組水平，即與正常家兔無(wú)異。微循環(huán)中血液黏度主要受紅細(xì)胞可變性和血漿黏度的影響[13]，紅細(xì)胞可變性下降可使微循環(huán)阻力增加、血液流動(dòng)減慢，從而增加血液黏度。血液黏度的增加在血循環(huán)中表現(xiàn)為血流速度減慢、紅細(xì)胞相互聚集，進(jìn)而導(dǎo)致股骨頭血液灌注量降低，使骨細(xì)胞處于缺血、缺氧狀態(tài)，股骨頭血供明顯減少，最終導(dǎo)致股骨頭缺血性壞死。Drescher等[14]的研究表明，高劑量甲基強(qiáng)的松龍輸注會(huì)導(dǎo)致豬的股骨頭血液流變學(xué)改變，血流量減少，血漿高凝，最終導(dǎo)致股骨頭壞死的發(fā)生。Chen等[15]的研究表明，促紅細(xì)胞生成素可通過(guò)抑制成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的凋亡及增加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，對(duì)糖皮質(zhì)激素引起的股骨頭壞死起到顯著的保護(hù)作用。Worrall等[16]的研究則認(rèn)為血紅蛋白紅細(xì)胞壓積比率對(duì)兒童股骨頭壞死有較好的預(yù)測(cè)性。本研究結(jié)果顯示，治療后對(duì)照組和干預(yù)組高切、中切和低切全血黏度均顯著低于模型組，且血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和紅細(xì)胞壓積也顯著低于模型組，這表明經(jīng)ADSCs旁分泌因子干預(yù)的家兔股骨頭血液流動(dòng)性顯著優(yōu)于模型組。BMP-2可以補(bǔ)充分化成骨祖細(xì)胞的間充質(zhì)細(xì)胞，刺激骨祖細(xì)胞分化為骨系細(xì)胞[17]。TGF-β是一類細(xì)胞生長(zhǎng)分化調(diào)節(jié)蛋白，能夠促進(jìn)骨膜中成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞增生，促使骨細(xì)胞膠原及基質(zhì)蛋白的合成和鈣化，減少破骨細(xì)胞的形成，抑制骨吸收[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，治療后干預(yù)組BMP-2和TGF-β顯著升高，且干預(yù)組顯著高于模型組，這表明干預(yù)組股骨頭壞死部位得到了修復(fù)，經(jīng)ADSCs旁分泌因子干預(yù)可以促進(jìn)股骨頭的修復(fù)。

綜上，ADSCs旁分泌因子可以有效改善SANFH家兔組織的血液灌注和血液流變學(xué)參數(shù)，對(duì)SANFH有積極的治療效果。但本研究為小樣本單中心動(dòng)物研究，研究時(shí)間較短，尚需大樣本量、遠(yuǎn)期動(dòng)物模型以及臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。