白變霞 竇旭峰 劉榮 李蓉 任嘉紅

摘要：黨參[Codonopsis pilosula （Franch.） Nannf.]是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材之一，具有重要的藥用價(jià)值。潞黨參作為山西省的一種重要道地藥材，主要產(chǎn)自山西省長(zhǎng)治地區(qū)。從潞黨參根部?jī)?nèi)部分離出1株內(nèi)生細(xì)菌DS-3菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化指標(biāo)測(cè)定及16S rRNA測(cè)序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定為Pseudomonas corrugate;對(duì)菌株產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)氫氰酸（HCN）、溶磷及固氮能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示該菌株產(chǎn)IAA能力為18.77 μg/mL，產(chǎn)鐵載體能力為68%，對(duì)有機(jī)磷的解磷率為40.2%，同時(shí)還具備一定的固氮與產(chǎn)HCN能力。綜上可見，菌株DS-3具有一定促生能力，該菌株可作為后續(xù)研發(fā)微生物菌肥的菌種資源。

關(guān)鍵詞：潞黨參;內(nèi)生細(xì)菌;鑒定;促生能力

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）12-0196-05

收稿日期：2021-03-05

基金項(xiàng)目：山西省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號(hào)：2019600）。

作者簡(jiǎn)介：白變霞（1987—），女，山西汾陽(yáng)人，博士，講師，主要從事根際有益微生物的研究。E-mail：baibianxia08@126.com。

通信作者：任嘉紅，博士，教授，主要從事微生物學(xué)的相關(guān)教學(xué)與科學(xué)研究。E-mail：renjiahong76@hotmail.com。

黨參作為常用的大宗藥材，藥用時(shí)間較為悠久，因其具有健脾、益氣、補(bǔ)血等補(bǔ)益功效，可作為人參的替用品[1]。根據(jù)產(chǎn)地的不同，黨參可主要?jiǎng)澐譃楫a(chǎn)于甘肅省、四川省西北部、陜西省漢中市一帶的素花黨參，產(chǎn)于四川省、湖北省、陜西省交界的條黨參，產(chǎn)于東北一帶的東黨參，產(chǎn)于山西省長(zhǎng)治市的潞黨參。山西省長(zhǎng)治市為潞黨參的發(fā)源地，該地區(qū)平順縣產(chǎn)的潞黨參被認(rèn)定為我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品[2]。目前，為滿足市場(chǎng)的需求，潞黨參主要通過(guò)人工種植。在人工種植過(guò)程中，藥農(nóng)通過(guò)施用化肥來(lái)提高潞黨參的產(chǎn)量。長(zhǎng)期施用化肥會(huì)導(dǎo)致土壤出現(xiàn)酸化、板結(jié)等現(xiàn)象，影響植株對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收，同時(shí)也影響植株根際土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致減產(chǎn)[3-4]。近年來(lái)，微生物肥料因其能對(duì)植株生長(zhǎng)起到促進(jìn)調(diào)節(jié)作用，同時(shí)安全與環(huán)保，正逐步成為化學(xué)肥料的替代品[5]。

內(nèi)生細(xì)菌能夠通過(guò)植物的根或地上部分（子葉、葉片、花、莖）進(jìn)入植物組織內(nèi)部存活，但是不會(huì)導(dǎo)致宿主植物出現(xiàn)明顯的病害癥狀[6-7]。一些內(nèi)生細(xì)菌能夠與植物建立互利共生關(guān)系，可對(duì)植物產(chǎn)生促生作用，并提高抗逆性，這類內(nèi)生細(xì)菌通常被稱為有益內(nèi)生細(xì)菌[8]。植株在生長(zhǎng)過(guò)程中，土壤通常會(huì)缺乏足夠量的1種或多種養(yǎng)分供植物生長(zhǎng)所需，有益內(nèi)生細(xì)菌可以幫助寄主植物獲得更多的限制性植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括氮、磷、鉀、鐵等[9]。近年來(lái)的研究表明，有益內(nèi)生細(xì)菌分泌的5種類型植物激素[脫落酸、細(xì)胞分裂素、乙烯、赤霉素、吲哚乙酸（IAA）]可加強(qiáng)植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累與代謝[10]。此外，有益內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)生的一些次級(jí)代謝產(chǎn)物如抗生素、鐵載體、水解類酶、揮發(fā)性有機(jī)物等可拮抗植物病原菌，部分還可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性，提升植物的抗病能力，間接地促進(jìn)宿主植物的生長(zhǎng)[11]。綜上可知，植物有益內(nèi)生細(xì)菌能夠有效地定殖于植物體內(nèi)，并對(duì)植物生長(zhǎng)代謝發(fā)揮積極作用，因此具有較大的潛能被開發(fā)為生物菌肥和生物農(nóng)藥[12]。

本研究以前期試驗(yàn)中從潞黨參根內(nèi)部分離得到的1株內(nèi)生菌株DS-3為研究對(duì)象，首先對(duì)其形態(tài)特征、生理指標(biāo)、及16S rRNA序列進(jìn)行分析與鑒定;其次對(duì)該菌株的相關(guān)促生指標(biāo)解磷、固氮、產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)氫氰酸（HCN）等能力進(jìn)行測(cè)定。本研究以期為課題組后續(xù)開發(fā)應(yīng)用于黨參的微生物肥料提供潛力菌株，為推廣微生物菌肥在黨參的人工綠色種植提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源

菌株DS-3為筆者所在課題組于2019年從山西省長(zhǎng)治市平順縣潞黨參根部分離所得，該菌株現(xiàn)保藏于筆者所在實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基、King液體培養(yǎng)基、CAS檢測(cè)平板、MKB培養(yǎng)基、NBRIP培養(yǎng)基、蒙金娜基礎(chǔ)培養(yǎng)基、卵磷脂培養(yǎng)基、Ashby固氮培養(yǎng)基[13]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的鑒定

將活化的菌株DS-3劃線接種于LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[14]對(duì)菌株的菌落形態(tài)及相關(guān)的生理生化特征進(jìn)行觀察與分析。

采用修改的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取菌株的基因組DNA，將其作為模板，經(jīng)細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物FW（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和RV （5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）進(jìn)行 25 μL體系的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將大小約 1 600 bp 的條帶進(jìn)行純化回收，并與pMD-19 T-simple載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM-109感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆送至華大基因完成測(cè)序。將所得測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI與EzTaxon server數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 溶磷能力的測(cè)定

吸取5.0 μL過(guò)夜活化的菌液分別點(diǎn)接于蒙金娜基礎(chǔ)培養(yǎng)基和NBRIP培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)7 d，觀察解磷圈，判斷其是否具有解磷能力。采用鉬銻抗比色法測(cè)定有效磷的含量，計(jì)算菌株的溶磷率[15]。

1.2.3 產(chǎn)IAA能力的測(cè)定

將菌株DS-3接種于LB液體培養(yǎng)基，向其中加入L-色氨酸，終濃度為100 mg/L，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)72 h，對(duì)菌液的D600 nm進(jìn)行測(cè)定后離心菌液（10 000 r/min、10 min），參照Glickmann等的方法測(cè)定上清液中IAA的產(chǎn)量，同時(shí)用IAA標(biāo)準(zhǔn)品繪制其濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，用以計(jì)算樣品中的IAA含量[16]。以未接種菌株的培養(yǎng)基作為對(duì)照，每組處理重復(fù)3次。

1.2.4 產(chǎn)鐵載體能力的測(cè)定

參照Schwyn等的方法[17]，取5 μL菌液點(diǎn)接于CAS 檢測(cè)平板上，30 ℃ 靜置培養(yǎng)72 h，觀察菌落周圍是否產(chǎn)生黃綠色暈圈，如產(chǎn)生，則表示該菌株可分泌產(chǎn)鐵載體，從而對(duì)其產(chǎn)鐵載體能力進(jìn)行定量測(cè)定。將活化好的菌液接種于MKB液體培養(yǎng)基（30 mL）中，30 ℃、180 r/min 培養(yǎng) 24 h，于10 000 r/min、4 ℃離心 15 min，吸取上清液與等量 CAS 染液混勻，常溫條件反應(yīng)1 h，以未接種的 MKB 液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，計(jì)算鐵載體的相對(duì)產(chǎn)量。

1.2.5 產(chǎn)HCN能力的鑒定

過(guò)夜活化后的菌液涂布于含甘氨酸（終濃度4.4 g/L）的PDA固體培養(yǎng)基上，將浸有苦味酸溶液的無(wú)菌濾紙貼于培養(yǎng)皿的皿蓋上，用封口膜將培養(yǎng)皿封住，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，以涂布未接種的培養(yǎng)液作為空白對(duì)照組[18]。通過(guò)觀察空白組與試驗(yàn)組之間無(wú)菌濾紙顏色的變化來(lái)鑒定菌株是否具有產(chǎn)HCN的能力。

1.2.6 固氮能力的鑒定

將過(guò)夜活化的菌株LB液體培養(yǎng)基點(diǎn)接至無(wú)氮固體培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察菌株能否在培養(yǎng)基上存活生長(zhǎng)，若能，則證明該菌具有固氮能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株DS-3的鑒定

菌株在培養(yǎng)基上形成的菌落為邊緣整齊的圓形，表面濕潤(rùn)，有光澤，不透明，顏色為淺黃色。生理生化測(cè)定結(jié)果顯示菌株DS-3為革蘭氏陰性菌（G-）。KOH、接觸酶、需氧性、氧化酶和卵磷脂酶試驗(yàn)均為陽(yáng)性，淀粉水解、吲哚、伏普、纖維素分解及甲基紅試驗(yàn)均為陰性。

菌株DS-3的16S rRNA基因擴(kuò)增條帶經(jīng)電泳鑒定，大小正確，約為1 600 bp。將測(cè)序所得序列在NCBI和EzBioCloud 2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示菌株DS-3 與菌株P(guān)seudomonas corrugata的同源性達(dá)到99.37%。經(jīng)MEGA-X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖1可知，菌株DS-3與模式菌株P(guān). corrugata處于同一分支上，其自展值為94%，說(shuō)明菌株DS-3為P. corrugata的另外一種亞種，與系統(tǒng)發(fā)育樹中這2種菌株不完全相同。結(jié)合該菌株表現(xiàn)出的形態(tài)特征和生理生化試驗(yàn)結(jié)果，將其鑒定為P. corrugata。

2.2 菌株的促生能力

2.2.1 解磷能力

在有機(jī)磷平板上點(diǎn)接菌液培養(yǎng)72 h后，由圖2-A可知，在菌株DS-3的菌落周圍出現(xiàn)了明顯的透明圈，說(shuō)明該菌株具有溶解有機(jī)磷的能力。對(duì)該菌株的解磷能力進(jìn)行定量檢測(cè)，菌株在液體解磷培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，解磷率為40.2%。由此可見，該菌株對(duì)土壤中的有機(jī)磷能發(fā)揮一定的解磷能力。

2.2.2 產(chǎn)IAA能力

采用Salkowski比色法對(duì)菌株產(chǎn)IAA能力進(jìn)行定性定量分析，由圖2-B可知，該菌株可使反應(yīng)液變紅，可見該菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中可分泌IAA。定量結(jié)果表明，該菌株在培養(yǎng)72 h后，IAA的分泌量為18.77 mg/L，可見菌株DS-3具有較強(qiáng)分泌IAA的能力，可能會(huì)對(duì)潞黨參根部的生長(zhǎng)起促生調(diào)節(jié)作用。

2.2.3 產(chǎn)鐵載體能力的鑒定

在CAS平板上點(diǎn)接菌株DS-3靜置培養(yǎng)72 h后，菌落周圍出現(xiàn)明顯的橙色暈圈（圖3-A），說(shuō)明該菌株可合成并向外界環(huán)境中分泌鐵載體，這有利于菌株處于低鐵條件時(shí)從外界有效獲取Fe2+。由圖3-B可知，培養(yǎng)24 h后，上清液中的鐵載體相對(duì)含量可達(dá)68%，且在菌株DS-3培養(yǎng)12 h前，鐵載體的產(chǎn)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)不斷積累，培養(yǎng)12 h后，其產(chǎn)量進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)。可見該菌株具有較強(qiáng)的分泌鐵載體能力。

2.2.4 固氮能力的鑒定

土壤中的氮通常約95%都是以有機(jī)氮的形式存在，不能被植物直接利用[20]。具有固氮能力的細(xì)菌能夠?qū)⒖諝庵械牡獨(dú)膺€原為可被植物直接吸收利用的銨態(tài)氮，從而對(duì)植物生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用[21-22]。將菌株DS-3接種于不含氮源的無(wú)氮培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3 d后，在培養(yǎng)基上可見明顯的菌落（圖4-A），可見該菌株可以固定大氣中的氮源，具備固氮能力，提升土壤中植物可利用的氮含量，從而發(fā)揮促生作用。

2.2.5 產(chǎn)HCN能力的鑒定

HCN能夠通過(guò)阻斷電子傳遞，干擾需氧呼吸作用，從而抑制病原微生物的正常生長(zhǎng)[19]。由圖4-B可以看出，接種菌株DS-3的培養(yǎng)皿中，蘸有苦味酸的濾紙由黃色變?yōu)闇\棕色，說(shuō)明菌株DS-3能夠利用甘氨酸作為底物，將其氧化生成HCN。因此，菌株DS-3可通過(guò)生成HCN來(lái)拮抗黨參根際的病原微生物。

3 結(jié)論與討論

目前，從不同種類植物中分離出的內(nèi)生細(xì)菌種類豐富，已被研究報(bào)道的有假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Eterobacter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、沙雷氏菌屬（Serratia）、不動(dòng)桿菌屬（Acinotobacter）等[23]。這些菌屬通常也會(huì)存在于植物根際土壤中，因此，有學(xué)者認(rèn)為內(nèi)生細(xì)菌可能是植物根際棲息細(xì)菌的一個(gè)亞種群[24]。植物根際促生細(xì)菌（plant growth promoting bacteria，簡(jiǎn)稱PGPB）主要源自內(nèi)生細(xì)菌與根際土壤細(xì)菌，但二者之間的主要區(qū)別是內(nèi)生的PGPB，一旦它們?cè)谥参锝M織中共生，便不會(huì)受到外界土壤環(huán)境變化（溫度、pH值、含水量等）的影響，但是這些變化卻會(huì)影響根際PGPB的功能、增殖以及與寄主植物的結(jié)合等[25]。因此，可推斷內(nèi)生的PGPB對(duì)宿主植物的促生作用更為穩(wěn)定。

本研究從藥用植物潞黨參根部篩選得到的內(nèi)生促生細(xì)菌DS-3，經(jīng)菌落形態(tài)特征、生理生化特征以及16S rRNA基因等進(jìn)行鑒定后，鑒定結(jié)果為P. corrugata。結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道，內(nèi)生的PGPB不僅能夠促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)，提高宿主植物的抗逆性，還能夠使宿主植物對(duì)競(jìng)爭(zhēng)植物產(chǎn)生化感作用[26]。因此本研究對(duì)菌株DS-3的促生特性進(jìn)行了研究，研究結(jié)果表明，該菌株具有溶磷、產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)HCN以及固氮多種促生能力。其中菌株的溶磷與固氮能力能夠直接幫助植株攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，菌株分泌的IAA可以直接調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)，因此這些機(jī)制被認(rèn)為是菌株對(duì)植株的直接促生作用;而通過(guò)分泌鐵載體與病原微生物競(jìng)爭(zhēng)有限的鐵離子，及通過(guò)產(chǎn)生HCN阻斷病原微生物的需氧呼吸，從而對(duì)病原微生物產(chǎn)生拮抗作用而有利于植株生長(zhǎng)的促生機(jī)制被認(rèn)為是對(duì)植株的間接促生作用[23]。因此可推斷菌株P(guān). corrugate DS-3可對(duì)潞黨參發(fā)揮直接與間接促生作用，可作為后續(xù)開發(fā)微生物菌肥的優(yōu)良菌株。Shidore等將水稻根系滲出液作用于其內(nèi)生細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌基因組中與根際競(jìng)爭(zhēng)作用相關(guān)的基因出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，并對(duì)相關(guān)功能基因進(jìn)行了誘導(dǎo)突變，該研究結(jié)果推斷植物根系分泌物可以誘導(dǎo)內(nèi)生細(xì)菌的定殖[27]。綜合課題組前期對(duì)潞黨參根際促生細(xì)菌的分離篩選工作，發(fā)現(xiàn)目前篩選得到的潞黨參根部?jī)?nèi)生細(xì)菌與根際土壤細(xì)菌多為假單胞菌屬。因此，后續(xù)的研究工作一方面將菌株P(guān). corrugate DS-3接種于潞黨參幼苗，對(duì)其接種效應(yīng)進(jìn)行研究，另一方面可探究潞黨參根系分泌物對(duì)菌株P(guān). corrugate DS-3及前期分離的其他假單胞菌株在潞黨參根部及根際定殖的誘導(dǎo)效應(yīng)，為開發(fā)適用于黨參人工種植的微生物菌肥提供研究基礎(chǔ)。

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