郭杰，陶蕾，王吉鴻，王瑞雪

(蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程系，甘肅 蘭州，730070)

蕨麻(PotentillaanserinaL.)，薔薇科鵝絨委陵菜植物的塊根，主要分布于東北、華北和西北地區(qū)，遍布于海拔3 000 m以上、輻射強度達45 W/m2的青藏高原地區(qū)，是藏區(qū)人民重要的藥食兩用植物[1]。據(jù)《新華本草綱要》論證青藏高原生長的蕨麻發(fā)育極佳，藥性最佳。在藏文中蕨麻又稱“延壽草”、“仙人果”、“戳瑪”等。其藥性在許多藥學(xué)典籍中均有記載，例如《四部醫(yī)典》、《月王藥診》、《藏藥志》、《中國藏藥》等。中醫(yī)認為蕨麻性甘、溫，具有益補血氣、益胃健脾、兼有止血、止咳之功效，常用于治療缺血、吐血、腹瀉、肝炎、脾胃虛弱等癥[2]。在民間人們除了用其治病，更多的是當(dāng)作養(yǎng)生補血的保健食品?，F(xiàn)今隨著“綠色醫(yī)藥”的概念深入人心，蕨麻作為一種藥食兩用的保健食品，市場需求量日益擴增，經(jīng)濟價值有增無減，但是大部分蕨麻仍以原材料形式發(fā)揮其保健功效，缺乏對其有效成分的深入開發(fā)利用。

隨著近年來生物科技的進步，人們對蕨麻有效成分也進行了一定的研究，發(fā)現(xiàn)多糖、單寧、黃酮、三萜等有效成分均具有一定的生理活性[3]。對蕨麻多糖的藥理研究發(fā)現(xiàn)，其可以顯著提高機體的抗氧化能力并通過提高免疫細胞數(shù)目、增加胸腺和脾臟指數(shù)、抑制血清IL-10和IFN-γ水平保護環(huán)磷酰胺對小鼠免疫系統(tǒng)的損傷[4-6]，具有良好的開發(fā)利用價值。目前，蕨麻多糖的提取方法集中于熱水回流提取法、超聲波提取法和復(fù)合酶提取法，未見雙水相提取技術(shù)應(yīng)用于蕨麻多糖的研究報道[7-8]。而雙水相萃取因具條件溫和、提取高效、操作簡單、活性損失小、無有機溶劑殘留等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于各種蛋白質(zhì)純化和抗生素提取[9-10]。本研究采用乙醇-無機鹽雙水相體系，以克服傳統(tǒng)聚合物雙水相體系成本高、分離時間長、易乳化、難回收等缺點，通過耦合超聲波提高蕨麻多糖的提取率，并初步研究超聲波輔助雙水相提取方法對蕨麻多糖生物活性的影響，以期為蕨麻多糖工業(yè)化提取提供理論技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕨麻，甘肅甘南藏族自治洲，自然晾干，干燥密封保存；無水乙醇、石油醚、苯酚、濃硫酸等(均為分析純)，煙臺市雙雙化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，東京理化器械株式會社；KQ-250DE超聲波清洗機，昆山超聲波儀器有限公司；UV-2700紫外分光光度計，日本島津儀器有限公司；5804R冷凍離心機，艾本德儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蕨麻預(yù)處理

將蕨麻干燥的根，超微粉碎過100目篩，經(jīng)石油醚索氏提取回流脫脂。將脫脂材料浸泡于80%(體積分數(shù))的乙醇，多次換液，除去多酚、游離單糖、氨基酸等小分子。離心收集材料，除去乙醇，干燥備用。

1.3.2 超聲波輔助雙水相提取蕨麻多糖的工藝研究

稱取5.0 g經(jīng)過預(yù)處理的蕨麻粉末于錐形瓶中，加入一定量的乙醇-硫酸銨，待形成雙水相體系后，放入超聲波清洗器中，在一定的超聲波條件下處理一定的時間，離心，收集雙水相萃取的多糖液經(jīng)4 ℃放置過夜，大部分硫酸銨結(jié)晶析出，透析減壓濃縮，將無水乙醇加入多糖液，使其終濃度為80%(質(zhì)量分數(shù)),醇沉24 h，下層沉淀用無水乙醇、丙酮洗滌多次，冷凍干燥后得到蕨麻多糖?？偺呛坑帽椒?硫酸法測定，還原糖用硝基水楊酸法測定，多糖得率按公式(1)計算：

(1)

式中：Y表示多糖得率，%；C1為總糖質(zhì)量濃度，mg/mL；N1為測定時總糖的稀釋倍數(shù)；C0為還原糖質(zhì)量濃度，mg/mL；N0為測定時還原糖的稀釋倍數(shù)；V為提取液母液體積，mL；W為蕨麻原料質(zhì)量，g。

1.3.2.1 單因素試驗

(1)無水乙醇質(zhì)量分數(shù)對蕨麻多糖提取率的影響

準確稱取5 g蕨麻粉末5份，加入的無水乙醇質(zhì)量分數(shù)分別為20%、30%、40%、50%、60%，在硫酸銨質(zhì)量分數(shù)20%，料液比為1∶20，超聲功率200 W，提取時間30 min條件下萃取，每次試驗重復(fù)3次，取平均值計算多糖提取率。

(2)硫酸銨質(zhì)量分數(shù)對蕨麻多糖提取的影響

準確稱取5 g蕨麻粉5份，加入的硫酸銨質(zhì)量分數(shù)分別為10%、15%、20%、25%、30%，在無水乙醇質(zhì)量分數(shù)20%，料液比為1∶50，超聲功率200 W，提取時間60 min條件下萃取，每次試驗重復(fù)3次，取平均值計算多糖提取率。

(3)料液比值對對蕨麻多糖提取的影響

準確稱取1 g蕨麻粉5份，分別設(shè)置料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g∶mL)，在無水乙醇質(zhì)量分數(shù)20%，硫酸銨質(zhì)量分數(shù)為20%，超聲功率200 W，提取時間60 min條件下萃取，每次試驗重復(fù)3次，取平均值計算多糖提取率。

(4)超聲功率對蕨麻多糖提取的影響

準確稱取5 g蕨麻粉5份，分別設(shè)置超聲功率為80、120、160、200、240 W，在無水乙醇質(zhì)量分數(shù)20%，硫酸銨質(zhì)量分數(shù)為20%，料液比為1∶20，提取時間60 min條件下萃取，每次試驗重復(fù)3次，取平均值計算多糖提取率。

1.3.2.2 響應(yīng)面試驗

基于單因素實驗的結(jié)果，確定了無水乙醇質(zhì)量分數(shù)、硫酸銨質(zhì)量分數(shù)、料液比和超聲功率為工藝參數(shù)，以多糖提取率為指標，利用Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理進行實驗設(shè)計，優(yōu)化提取工藝，評價影響多糖得率因素的主效應(yīng)、相互效應(yīng)及因素的二次效應(yīng)關(guān)素，實驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計因素水平Table 1 The levels of variables for the construction of Box-Behnken design (BBD)

試驗數(shù)據(jù)利用完全二次多項式方程進行多元線性回歸擬合，計算多糖提取率和各實驗因素之間的函數(shù)關(guān)系,如公式(2)所示：

(2)

式中：Y為預(yù)測的響應(yīng)值，即多糖提取率；A0是常數(shù)，Ai是線性系數(shù)，Aii是二次方系數(shù)，Aij是交互作用回歸系數(shù)；X和Xi是自變量。

1.3.3 蕨麻多糖的紅外光譜分析

充分干燥的KBr和多糖樣品以100∶1的質(zhì)量比在干燥環(huán)境中，用瑪瑙研缽充分混合研磨，壓片后用Thermo Nicolet iS10紅外光譜儀掃描，掃描范圍：400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)16 次。

1.3.4 蕨麻多糖的單糖組成分析

準確稱取多糖樣品20 mg加入4 mL 4 mol/L三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)，120 ℃氮氣保護酸解10 h，減壓蒸干TFA。酸解結(jié)束后加入10 mg鹽酸羥胺和0.5 mL吡啶中90 ℃反應(yīng)30 min反應(yīng)生成糖肟，反應(yīng)結(jié)束加入0.5 mL乙酸酐90 ℃乙?；磻?yīng)30 min生成糖腈乙酸酯衍生物，減壓蒸干。

氯仿溶解上述反應(yīng)產(chǎn)物后微濾膜過濾，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Thermo Focus GC-Polaris Q MS)上樣。使用氣相色譜柱為TR-5 ms SQC column。升溫條件為：120 ℃保持3 min，以5 ℃/min升溫至250 ℃保持5 min。檢測器溫度：250 ℃；進樣口溫度：250 ℃。載氣為高純氦氣，柱流量為1.0 mL/min，分流比為1∶50。

標準單糖鼠李糖(rhamnose，Rha)、來蘇糖(lyxose，Lyx)、阿拉伯糖(arabinose，Ara)、木糖(xylose，Xyl)、甘露糖(mannose，Man)、葡萄糖(glucose，Glc)以及半乳糖(galactose，Gal)的衍生化方法和色譜條件同上。

1.3.5 蕨麻多糖的體外抗氧化活性

1.3.5.1 超氧陰離子自由基清除活性測定

分別將蕨麻多糖和維生素C配制質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的待測溶液，取1 mL待測溶液依次加入1 mL的557 μmol/L還原性輔酶 Ⅰ二鈉、45 μmol/L吩嗪硫酸甲酯及108 μmol/L氯化硝基四氮唑藍，混合均勻25 ℃反應(yīng)5 min，510 nm處測吸光值，每個樣品重復(fù)3次，按公式(3)計算超氧陰離子自由基清除率：

(3)

式中：Y表示超氧陰離子自由基清除率，%；Ai表示多糖和維生素C溶液510 nm下測得吸光值；A0表示蒸餾水510 nm下測得吸光值。

1.3.5.2 還原力測定

分別將蕨麻多糖和維生素C配制質(zhì)量濃度為0.02、0.06、0.1、0.2、0.6、1、2 mg/mL的待測溶液。取1 mL待測溶液依次加入2.5 mL磷酸緩沖液(pH 6.6)和質(zhì)量分數(shù)1%鐵氰化鉀溶液，混合均勻50 ℃反應(yīng)20 min，加入2.5 mL質(zhì)量分數(shù)10%的三氯乙酸溶液混合均勻，1 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸餾水和質(zhì)量分數(shù)0.1%的氯化鐵溶液混合均勻，靜置10 min，700 nm處測定吸光值，每個樣品重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準差。運用GraphPad Prism 8.0繪制實驗數(shù)據(jù)相關(guān)圖片。采用SPSS 18.0和 Design-Expert 8.0 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析。P<0.05或P<0.01表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 無水乙醇質(zhì)量分數(shù)對蕨麻多糖提取率的影響

無水乙醇質(zhì)量分數(shù)對蕨麻多糖提取率的影響見圖1。當(dāng)無水乙醇質(zhì)量分數(shù)小于30%時，蕨麻多糖提取率隨著無水乙醇質(zhì)量分數(shù)的升高呈現(xiàn)上升趨勢；當(dāng)無水乙醇質(zhì)量分數(shù)超過30%時，蕨麻多糖提取率隨著無水乙醇質(zhì)量分數(shù)的升高呈現(xiàn)下降趨勢，因此，無水乙醇質(zhì)量分數(shù)為30%為最佳提取參數(shù)。

2.1.2 硫酸銨質(zhì)量分數(shù)對蕨麻多糖提取的影響

圖2表示硫酸銨質(zhì)量分數(shù)對蕨麻多糖提取的影響，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分數(shù)在10%～20%時，多糖提取率隨硫酸銨質(zhì)量分數(shù)增大而增加，當(dāng)達到20%時，多糖提取率達到最高，而后，硫酸銨質(zhì)量分數(shù)再增加，多糖提取率降低。這是因為開始時隨硫酸銨用量的增加會增強雙水相的析出作用，提高多糖的提取率，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分數(shù)過高時，共沉淀現(xiàn)象增加，減少鹽相中的多糖含量[11]。因此，硫酸銨質(zhì)量分數(shù)為20%為最佳的提取參數(shù)。

2.1.3 料液比對蕨麻多糖提取的影響

料液比對多糖提取率的影響如圖3所示，料液比為1∶10～1∶20時，多糖提取率隨料液比的升高而增加，此后繼續(xù)增加料液比，多糖提取率不再增高。其主要原因是由于，在一定范圍內(nèi)，溶質(zhì)和溶液的接觸面積隨著料液比的增加而擴大，更有利于多糖的溶出[12]；但料液比超過1∶20之后，細胞內(nèi)外的多糖已經(jīng)達到了溶解平衡，已被充分浸提出來，考慮到提取成本，料液比選擇1∶20作為多糖提取的最佳提取參數(shù)。

2.1.4 超聲功率對蕨麻多糖提取的影響

在無水乙醇質(zhì)量分數(shù)20%，硫酸銨質(zhì)量分數(shù)為20%，料液比為1∶20，提取時間60 min萃取條件下考察超聲功率對蕨麻多糖提取的影響(圖4)。超聲功率為80～200 W時，多糖提取率隨超聲功率的升高而增加，此后繼續(xù)增加超聲功率，多糖提取率增高不明顯，考慮到提取成本，超聲功率為200 W作為多糖提取的最佳提取參數(shù)。

2.2 響應(yīng)面法試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果分析

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用BBD模型對提取參數(shù)進行了優(yōu)化。表2顯示了29個4因素3水平試驗結(jié)果。使用SAS 數(shù)據(jù)分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析，多糖提取率和試驗變量采用得出：

Y=8.90+0.25A+0.21B+0.16C+0.26D-0.31AB+0.065AC-0.25AD-0.50BC-0.27BD+0.18CD-0.52A2-0.51B2-0.69C2-0.095D2

式中：Y為多糖提取率，A為無水乙醇質(zhì)量分數(shù)，B為硫酸銨質(zhì)量分數(shù)，C為料液比，D為超聲功率。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results

表3 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis of regression mode

根據(jù)多元回歸方程做出不同處理因素對蕨麻多糖提取率的影響相應(yīng)三維響應(yīng)面和二維等高線圖，如圖5所示。三維響應(yīng)面闡釋了當(dāng)其他因素保持在零水平不變時，因變量之間的關(guān)系和2個測試變量之間的相互作用[13]，二維等值線圖的形狀反映了變量之間的交互效應(yīng)，圓圖表示試驗參數(shù)相互作用影響不顯著，而橢圓輪廓圖表示試驗參數(shù)相互作用影響顯著[14-15]。圖5-c、圖5-e和圖5-f分別表示無水乙醇質(zhì)量分數(shù)與超聲功率、硫酸銨與超聲功率和料液比與超聲功率的交互作用，從二維等值線圖曲面的變化趨勢分析，超聲功率顯著影響多糖提取率，這一結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

2.2.2 最優(yōu)工藝條件及驗證實驗

利用Design-Expert 8.0軟件分析優(yōu)化蕨麻多糖提取的最佳條件：無水乙醇質(zhì)量分數(shù)為30.92%，硫酸銨質(zhì)量分數(shù)18.74%，料液比為1∶21.75，超聲功率為240 W。最佳條件下蕨麻多糖預(yù)測最高提取率為9.127%。為檢驗預(yù)測結(jié)果的可靠性，兼顧實際操作的便利性，將上述最佳提取條件修正為無水乙醇質(zhì)量分數(shù)為31%，硫酸銨質(zhì)量分數(shù)19%，料液比為1∶22，超聲功率為240 W進行重復(fù)實驗。3次平行試驗實際測得蕨麻多糖提取率為(9.04±0.12)%，經(jīng)苯酚硫酸法檢測多糖含量為(87.13±0.26)%，證實了預(yù)測值和實驗值之間的良好相關(guān)性，表明該模型適用于蕨麻多糖的提取。與傳統(tǒng)水提法提取蕨麻多糖(提取率2.54%)相比，響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助雙水相提取具有更高效的提取效率[16]。

2.3 蕨麻多糖的紅外光譜分析

2.4 蕨麻多糖單糖組成分析

多糖是由各種單糖通過不同的糖苷鍵連接方式連接組成的，單糖的種類和數(shù)量直接影響著多糖的結(jié)構(gòu)和生理活性。圖7-a是單糖標準品氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析圖譜，各色譜峰依照保留時間由小到大依次為：Rha、Lyx、Ara、Xyl、Man、Glc及Gal。蕨麻多糖經(jīng)過完全酸解，制備糖腈衍生物經(jīng)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析后的色譜圖如圖7-b所示。對照標準品的保留時間可知蕨麻多糖含有4種單糖，分別是Rha、Man、Glc和Gal，其摩爾比為1.00∶1.69∶10.61∶2.66。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，多糖活性的影響受到單糖種類的影響，MENG等[22]的研究發(fā)現(xiàn)毛孢屬多糖的生物活性受單糖組成的影響，甘露糖和葡萄糖含量嚴重影響其抗氧化活性，甘露糖含量越高、葡萄糖含量越低，毛孢屬多糖的抗氧化性越好。針對杏鮑茹多糖的研究發(fā)現(xiàn)，半乳糖含量較高的組分其抗氧化效果優(yōu)于其他組分[23]。蕨麻多糖的單糖組成含有甘露糖和半乳糖，推測其具有一定的抗氧化性能。

2.5 蕨麻多糖的體外抗氧化活性

2.5.1 超氧陰離子自由基清除活性測定

超氧陰離子自由基是體內(nèi)產(chǎn)生的一種活性氧，正常情況下，由體內(nèi)過氧化物歧化酶清除。但是過量的超氧陰離子自由基會引起一系列的反應(yīng)損傷體內(nèi)的生物大分子誘發(fā)多種疾病，特別是神經(jīng)退行性疾病、生理性衰老和心血管疾病[24-25]。因此，使用抗氧化劑清除超氧陰離子自由基是減少機體氧化損傷的最有效手段之一，許多研究報道植物多糖具有一定的抗氧化作用[26-27]。

蕨麻多糖對超氧陰離子自由基的清除能力如圖8所示，加入蕨麻多糖處理后可以顯著作用于超氧陰離子自由基，且超氧陰離子自由基清除活性隨蕨麻多糖的濃度升高而增強，但是對超氧陰離子自由基清除活性低于相同濃度下的維生素C處理組。針對不同方法提取的蕨麻多糖對超氧陰離子自由基的清除能力分析，相同的多糖濃度下，超聲波輔助雙水相提取蕨麻多糖(polysaccharides fromPotentillaanserinaL.by ultrasonic-assisted aqueous two-phase，PPS-UAT)超氧陰離子自由基清除能力高于傳統(tǒng)水提法(polysaccharides fromPotentillaanserinaL. by hot water,PPS-HOT)。有研究指出，多糖的提取方式在一定程度上影響其生物活性，針對不同提取方法對油茶餅多糖抗氧化能力的影響發(fā)現(xiàn)超聲波提取的多糖相較于傳統(tǒng)水提法、堿提多糖、酶輔助提取多糖具有更強的抗氧化能力[28]。對牛蒡多糖的研究表明，在超聲波輔助雙水相提取、超聲波提取、熱水提取和酶法提取的牛蒡多糖中，超聲波輔助雙水相提取多糖抗氧化性能最佳[28]。造成這種差異的原因是因為不同的提取方式在一定程度上會改變多糖的結(jié)構(gòu)從而影響其生物活性。許多研究表明，超聲波處理可以降解多糖的糖鏈，降低多糖的分子質(zhì)量。多糖糖分子質(zhì)量越大，體積越大，黏度越高，不利于跨越細胞膜進入體內(nèi)或結(jié)合生物活性位點，發(fā)揮生物學(xué)活性，生物利用率較低[29-32]，在一定程度上降低多糖的分子質(zhì)量有助于提高多糖物質(zhì)的生物活性。

2.5.2 還原力測定

還原力是重要的抗氧化劑活性指標之一，蕨麻多糖的還原力如圖9所示。在質(zhì)量濃度0.02～2 mg/mL時，蕨麻多糖和維生素C的還原力均隨濃度的增大而變強，且相同濃度下維生素C的還原力值高于蕨麻多糖。在相同的多糖濃度下，PPS-UAT提取蕨麻多糖還原力高于PPS-HOT傳統(tǒng)水提法，與蕨麻多糖超氧陰離子清除活性測定結(jié)果一致。針對瑪咖多糖[33]和蟲草多糖[34]的研究顯示，PPS-UAT是一種高效的多糖提取方法。而PPS-UAT應(yīng)用于蟬花多糖的提取研究表明，PPS-UAT效果強于PPS-HOT、微波提取法和酶提取法；PPS-UAT比PPS-HOT蟬花多糖的提取率高1.83倍，且提取的多糖具有更強的抗氧化活性[35]。本次實驗結(jié)果也表明，PPS-UAT是一種保證生物活性更優(yōu)良的多糖提取技術(shù)。

3 結(jié)論

本研究利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助雙水相提取蕨麻多糖的工藝參數(shù)，在無水乙醇質(zhì)量分數(shù)為31%，硫酸銨質(zhì)量分數(shù)19%，料液比為1∶22，超聲功率為240 W的條件下，蕨麻多糖提取率達到(9.04±0.12)%。并比較了超聲波輔助雙水相法與傳統(tǒng)水提法提取的蕨麻多糖抗氧化性能差異，結(jié)果表明蕨麻多糖具備良好的抗氧化性能，并且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，在相同濃度下，超聲波輔助雙水相法提取的蕨麻多糖抗氧化性能優(yōu)于傳統(tǒng)水提法。以上結(jié)論表明超聲波輔助雙水相法是一種可靠高效的多糖提取方法。