馮雪艷,張慧芹,李 幸,范玉香,劉時(shí)文

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy,DR)是一種以炎癥和血管生成途徑為特征的視網(wǎng)膜微血管疾病[1]。它是糖尿病最常見的并發(fā)癥,也是導(dǎo)致成人失明的主要原因之一[2]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),糖尿病引起的視網(wǎng)膜損害與慢性低級(jí)別炎癥狀態(tài)下的相關(guān)通路和介質(zhì)有關(guān),這導(dǎo)致血視網(wǎng)膜屏障的通透性增加,導(dǎo)致缺血事件,驅(qū)動(dòng)血管生成進(jìn)入視網(wǎng)膜[3]。預(yù)計(jì)到2030年全球糖尿病患者總數(shù)將增加至3.66億人,成為全球健康的主要威脅之一。在糖尿病的血管并發(fā)癥方面,35%的糖尿病患者有某種形式的DR,7%的患者有增生性DR(Proliferative DR,PDR),7%的患者有糖尿病黃斑水腫,10%的患者處于視覺威脅階段[4]。因此,尋找有效預(yù)防DR的措施和治療藥物是目前研究的熱點(diǎn)。

芍藥二酮是一種從芍藥根中分離得到的新萜類化合物[5]，其具有抑制人單核細(xì)胞白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、環(huán)氧合酶(CO)、血栓烷A合成酶(TX)和5-脂氧合酶(LO)活性的作用[6]。近幾年有研究發(fā)現(xiàn),芍藥二酮減輕了氧化應(yīng)激和炎癥介導(dǎo)的血管和肝臟疾病[7]，而炎癥在DR發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵的作用[8]。因此,提示芍藥二酮可能對(duì)DR具有治療作用。

本研究旨在探索芍藥二酮對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療效果和可能的作用機(jī)制,尤其是對(duì)視網(wǎng)膜血管炎性和血管通透性的影響，進(jìn)一步為DR的臨床用藥提供更直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠,體重180～220 g,購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠被置于受控環(huán)境(21～23 ℃,12 h光照/12 h黑暗周期,濕度55%～60%)中,以標(biāo)準(zhǔn)的鼠糧和隨意飲水喂養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格遵循國(guó)家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南中所述的方法。

1.1.2 藥品和試劑 芍藥二酮購(gòu)自北京范德生物科技有限責(zé)任公司,需用檸檬酸緩沖液(pH=7.4)進(jìn)行溶解。伊文思藍(lán)染料購(gòu)自北京Solarbio公司,使用前將伊文思藍(lán)染料溶解在生理鹽水中，配制成濃度為45 mg/ml的溶液。戊巴比妥鈉購(gòu)自中國(guó)北京國(guó)藥集團(tuán)股份有限公司。熒光素(AK-FLUOR)購(gòu)自Sigma公司。TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。SYBR Premix EX TaqTMI試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。所有引物均在上海生工合成。一抗NLRP3、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)、白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8,IL-1β)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)、GAPDH抗體購(gòu)自Abcam公司。一抗血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和熒光二抗Alexa Fluor 568購(gòu)自Thermo Fisher 公司。二抗Goat Anti-Rabbit IgG Antibody(H&L)購(gòu)自金斯瑞生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立[9]隨機(jī)選取8周齡的SD大鼠40只進(jìn)行造模,先給予高脂高糖的飼料連續(xù)喂養(yǎng)4周,4周后,大鼠禁食不禁水12 h,稱重并腹腔注射60 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)。STZ給藥48 h后,采集大鼠尾部靜脈血進(jìn)行檢測(cè),血糖超過16.7 mmol/L的大鼠為糖尿病,用于糖尿病大鼠模型。

1.2.2 分組及藥物干預(yù) 將造模成功的大鼠給予芍藥二酮灌胃治療。隨機(jī)分為4組(n=10),分別是模型組,芍藥二酮低(25 mg/kg)、中(50 mg/kg)、高(100 mg/kg)劑量組,另設(shè)對(duì)照組(n=10),同時(shí)給予對(duì)照組和模型組等體積的檸檬酸緩沖液灌胃。每天1次,連續(xù)4周。

1.2.3 組織的收集 末次給藥24 h后,一部分小鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥酸進(jìn)行麻醉處死,取其左右眼的視網(wǎng)膜組織,左眼的視網(wǎng)膜組織保存至-80 ℃,待后續(xù)蛋白質(zhì)的收集;右眼的視網(wǎng)膜組織固定在4%的甲醛溶液中24 h,再進(jìn)行15% EDTA脫鈣處理、酒精梯度(分別為100%、95%和70%)脫水、石蠟包埋、切片(3 μm),保存至4 ℃,待后續(xù)病理觀察使用。

1.2.4 大鼠視網(wǎng)膜組織病理形態(tài)觀察 冰凍切片在蘇木精溶液中染色5 min,用水沖洗。分色過程在鹽酸酒精溶液中進(jìn)行,最后加水終止。在氨水溶液中進(jìn)行發(fā)藍(lán),加水終止發(fā)藍(lán)。切片浸泡在伊紅溶液中5 min,用水沖洗。梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹脂固定封片,光學(xué)顯微鏡下觀察載玻片。測(cè)量全視網(wǎng)膜的厚度(內(nèi)界膜和色素上皮之間)并計(jì)算神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)細(xì)胞的數(shù)量(每100 μm細(xì)胞)。在每個(gè)半球的相鄰位置進(jìn)行3次測(cè)量,9次測(cè)量取平均值。每組記錄3只眼的平均值作為代表值。對(duì)三組的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 大鼠視網(wǎng)膜組織血管通透性測(cè)量[10]采用熒光素檢測(cè)血管造影和伊文思藍(lán)評(píng)價(jià)各組大鼠的血管通透性。熒光素血管造影用托品酰胺眼液擴(kuò)張瞳孔,氯胺酮和甲苯噻嗪深度麻醉大鼠后,腹腔注射150 μl AK-FLUOR(1% W/V)。視網(wǎng)膜血管滲漏用微米級(jí)IV成像。注射染料后5 min內(nèi)拍照。為額外測(cè)量血管滲透量,大鼠通過尾靜脈注射100 μl伊文思藍(lán)染料,2 h后用CO2安樂處死老鼠,剝離眼球并仔細(xì)取出視網(wǎng)膜,放入含有100 μl甲酰胺的離心管中,在55 ℃下培養(yǎng)48 h,然后將離心管轉(zhuǎn)移到96孔板上,測(cè)量610 nm處的吸光度。

1.2.6 免疫熒光組織化學(xué) 將視網(wǎng)膜組織冰凍切片從4 ℃取出進(jìn)行沖洗,再用檸檬酸鈉緩沖液(pH=6.0)進(jìn)行抗原去蔽。用1%牛血清白蛋白(BSA)和5%正常山羊血清在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液中封閉載玻片上的組織切片,用PBS洗滌,與一抗NLRP3孵育2 h,稀釋1∶200。將載玻片洗凈,然后與相應(yīng)的1∶500稀釋的二抗在適當(dāng)?shù)姆忾]液中孵育1 h,室溫置于黑暗中。用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色10 min,再用PBS洗滌,用含有淬滅劑的封片劑進(jìn)行封片。在徠卡共聚焦顯微鏡下拍照,用Image J軟件對(duì)NLRP3熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。每個(gè)視網(wǎng)膜切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野。

1.2.7 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 使用Trizol試劑提取視網(wǎng)膜組織總RNA。使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量,將A260/A280比值為1.8～2.0的RNA用于逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR Green Real-Time PCR Master進(jìn)行qRT-PCR。PCR反應(yīng)條件:50 ℃ 2 min，95 ℃ 15 min,95 ℃ 15 s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán);60 ℃30 s，72 ℃ 30 s。擴(kuò)增是一式3份進(jìn)行。使用2-△△Ct法計(jì)算每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平(使用GAPDH作為內(nèi)參)。所有引物序列如表1。

表1 引物序列

1.2.8 Western blot法檢測(cè) 將保存在-80 ℃的視網(wǎng)膜組織取出放置冰上,用組織勻漿器進(jìn)行研磨,加入RIPA裂解液于4 ℃裂解30 min,然后在4 ℃條件下,以20 000 g離心15 min。采用BCA蛋白濃度法測(cè)定上清的蛋白含量。將樣品與樣品緩沖液(4×sample buffer)煮10 min。使用10%～12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離總蛋白樣本,每泳道上樣10 μl進(jìn)行電泳,然后轉(zhuǎn)膜,再予以下一抗進(jìn)行孵育(4 ℃孵育過夜):Caspase-1、IL-1β、ASC、VEGF、PECAM-1、ICAM-1,再予相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h,用含有Tween 20的Tris緩沖鹽水洗滌印跡,最后用ECL顯影液進(jìn)行顯影并拍片,用Image-J進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有統(tǒng)計(jì)分析均采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行。數(shù)據(jù)以平均標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)表示,兩組之間的比較采用標(biāo)準(zhǔn)雙尾無配對(duì)t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芍藥二酮改善了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜形態(tài) 在光學(xué)顯微鏡下,HE染色顯示,視網(wǎng)膜組織可明顯分為5層,分別是GCL(視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層)、IPL(內(nèi)網(wǎng)狀層)、INL(內(nèi)部核層)、OPL(外網(wǎng)狀層)和ONL(外顆粒層)。對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜表面光滑,GCL、INL和ONL層細(xì)胞排列緊密、整齊有規(guī)律；模型組視網(wǎng)膜內(nèi)界出現(xiàn)明顯水腫,每一層分層異常,細(xì)胞排列疏松且無序,總視網(wǎng)膜厚度和GCL、INL、ONL層細(xì)胞密度顯著低于對(duì)照組;而相對(duì)于模型組,芍藥二酮中劑量組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)界水腫明顯減輕,細(xì)胞排列相對(duì)整齊,總視網(wǎng)膜厚度和GCL、INL、ONL層細(xì)胞密度增多,而芍藥二酮低、高劑量組對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)的改善效果不如中劑量組，見圖1。

圖1 大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色

2.1 芍藥二酮改善了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管通透性 為了研究芍藥二酮對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管通透性的影響,我們檢測(cè)了血管造影并評(píng)價(jià)了各組大鼠的血管通透性。結(jié)果顯示,相比于對(duì)照組,模型組大鼠視網(wǎng)膜微血管滲漏增加;而相對(duì)于模型組,芍藥二酮低、中、高劑量組抑制了大鼠視網(wǎng)膜微血管滲漏,但芍藥二酮低、高劑量組對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管通透性的改善效果不如中劑量組，見圖2。

圖2 大鼠視網(wǎng)膜組織伊文斯藍(lán)染色

2.2 芍藥二酮抑制了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中血管生成介質(zhì)的增加 血管生成介質(zhì)的表達(dá)與血管通透性和血管形成有關(guān)。因此,我們檢測(cè)了各組大鼠視網(wǎng)膜組織中血管生成介質(zhì)PECAM-1、ICAM-1、VEGF的表達(dá)。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組血管生成介質(zhì)PECAM-1、ICAM-1、VEGF的表達(dá)上調(diào);而與模型組相比,芍藥二酮低、中、高劑量組下調(diào)了PECAM-1、ICAM-1、VEGF的表達(dá),其中芍藥二酮中劑量組變化最顯著，見圖3。

圖3 大鼠視網(wǎng)膜組織中血管生成介質(zhì)的蛋白表達(dá)

2.3 芍藥二酮減少了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量 炎癥是DR發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因素,影響血管的形成[8]。因此,我們檢測(cè)了各組大鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP3炎性小體蛋白的表達(dá)。免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,NLRP3炎性小體主要在GCL和IPL層組成性表達(dá)。與對(duì)照組相比,模型組NLRP3陽(yáng)性細(xì)胞增多;而與模型組相比,芍藥二酮低、中、高劑量組NLRP3陽(yáng)性細(xì)胞均減少,芍藥二酮中劑量組NLRP3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著減少，見圖4。

圖4 大鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP3的蛋白表達(dá)

2.4 芍藥二酮抑制了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP3炎性小體的激活 本研究檢測(cè)了各組大鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP3炎性小體激活標(biāo)志物Caspase-1、IL-1β、ASC的表達(dá)。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-1、IL-1β、ASC的表達(dá)上調(diào);而與模型組相比,芍藥二酮低、中、高劑量組Caspase-1、IL-1β、ASC的表達(dá)下調(diào),其中芍藥二酮中劑量組變化最顯著，見圖5。

圖5 大鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP3炎性小體激活標(biāo)志物的蛋白表達(dá)

3 討論

DR是糖尿病最常見的并發(fā)癥,也是全球糖尿病患者視力下降的主要原因[11]。臨床上,DR大致分為早期非增生性DR 和晚期增生性DR,伴有和不伴有糖尿病性黃斑水腫的發(fā)展[12]。DR涉及多個(gè)相互關(guān)聯(lián)的通路,炎癥就是其中之一,它會(huì)對(duì)視網(wǎng)膜的神經(jīng)和血管成分產(chǎn)生不良影響。持續(xù)的炎癥會(huì)引起生化和分子的變化,最終導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜病變的并發(fā)癥和視力下降[13]。DR的病因和病理已經(jīng)被廣泛研究,但其治療的選擇很少。因此,研究治療DR的藥物極其重要。

芍藥二酮是具有較強(qiáng)抑制人體IL-1β活性的一類新型萜類化合物,研究發(fā)現(xiàn),它還是多種酶的抑制劑[5-6]。本研究初步探討了芍藥二酮對(duì)DR的保護(hù)作用及分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn),芍藥二酮可以改善DR模型大鼠的視網(wǎng)膜形態(tài),包括改善了GCL、INL及ONL層分層和細(xì)胞排列紊亂,并抑制了全視網(wǎng)膜厚度和GCL、INL、ONL層細(xì)胞密度的降低;此外,芍藥二酮還改善了DR模型大鼠視網(wǎng)膜血管通透性,降低了視網(wǎng)膜微血管的滲漏,抑制了視網(wǎng)膜新生血管的形成。因此,芍藥二酮對(duì)DR誘發(fā)的視網(wǎng)膜組織損傷具有抑制作用。

本研究探討了芍藥二酮抑制DR大鼠視網(wǎng)膜組織損傷的分子機(jī)制。由于血管通透性和新生血管形成受血管生成介質(zhì)PECAM-1、ICAM-1、VEGF的調(diào)控[14-16]，我們檢測(cè)了DR大鼠視網(wǎng)膜組織中血管生成介質(zhì)的表達(dá),發(fā)現(xiàn)芍藥二酮降低了血管生成介質(zhì)PECAM-1、ICAM-1、VEGF的表達(dá),由此降低了血管滲漏,抑制了視網(wǎng)膜血管的通透性和新生血管形成。此外,有研究報(bào)道,NLRP3炎癥小體相關(guān)的炎癥分子在糖尿病視網(wǎng)膜組織中表達(dá)增強(qiáng),可能有助于糖尿病視網(wǎng)膜病變中新生血管形成[17]。NLRP3炎性小體,是由NLRP3、ASC和Caspase-1組成[18]。NLRP3成分識(shí)別危險(xiǎn)信號(hào),并將蛋白復(fù)合物ASC組裝起來激活Caspase-1,導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子IL-1β蛋白水解分泌,進(jìn)而激活NLRP3炎性小體。最新研究表明,通過調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體的激活，可以改善糖尿病視網(wǎng)膜病變[19]。為此,我們檢測(cè)了大鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP3炎癥小體及其激活標(biāo)志物Caspase-1、IL-1β、ASC的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示,芍藥二酮降低了NLRP3炎癥小體及其激活標(biāo)志物Caspase-1、IL-1β、ASC的表達(dá),進(jìn)而抑制了NLRP3炎癥小體的激活。因此,芍藥二酮抑制DR大鼠視網(wǎng)膜組織GCL細(xì)胞數(shù)量的減少和血管滲漏可能是通過抑制NLRP3炎癥小體激活實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,芍藥二酮改善了DR大鼠的視網(wǎng)膜組織形態(tài)和血管通透性,降低了DR大鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP3炎癥小體激活標(biāo)志物Caspase-1、IL-1β、ASC和血管生成介質(zhì)PECAM-1、ICAM-1、VEGF的表達(dá),可能是通過抑制NLRP3炎癥小體激活實(shí)現(xiàn)。