徐瑾，周文波，武倫，方大正

(錦州醫(yī)科大學國藥東風總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地；湖北醫(yī)藥學院附屬國藥東風總醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是一種內分泌系統(tǒng)腫瘤，約占甲狀腺癌病人的90%以上，是最常見的分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid carcinoma，DTC)類型[1-2]。目前甲狀腺癌主要是通過體檢或者有癥狀時被發(fā)現(xiàn)，以手術治療為主[3]。該病程進展緩慢，但仍然有部分患者被發(fā)現(xiàn)時已出現(xiàn)遠處轉移，失去了最佳治療時機預后較差。

研究發(fā)現(xiàn)，RCN2可正向調控腫瘤細胞的生長和侵襲轉移[4]，如乳腺癌、結直腸癌、肝癌等中均有報道[5]，作為一種鈣離子結合蛋白，特異性定位于內質網[6](endoplasmic reticulum，ER，也被稱為ERC-55)中，約由1900個堿基的mRNA編碼而成，參與細胞分化和內分泌調節(jié)等作用。目前已知哺乳動物體內RCN有3種，研究發(fā)現(xiàn)，RCN-2在單純乳腺癌組織中表達明顯升高[6]，在乳腺癌合并甲狀腺癌組織中表達下降[7]，這提示RCN2與甲狀腺癌相關，但是其在甲狀腺癌中表達作用研究較少。因此，本研究通過檢測RCN2在甲狀腺乳頭狀癌組織和癌旁組織中的表達情況，并分析其異常表達的臨床意義，為甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展機制提供一定的理論依據(jù)，為臨床提供潛在的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料

收集2018年11月至2020年1月就診于國藥東風總醫(yī)院甲狀腺外科經手術切除的65例甲狀腺乳頭狀腺癌組織和配對的癌旁組織(距離腫瘤≥1 cm)，然后立即將新鮮組織樣本儲存于-80 ℃冰箱。入選標準：經超聲、喉鏡、腫瘤標志物、穿刺細胞學以及病理學檢查等確診為甲狀腺乳頭狀腺癌。排除標準：術前未經放療和化療以及免疫治療；合并有其他惡性腫瘤、動脈粥樣硬化等[8]疾病。手術前均告知患者并簽署知情同意書，并獲得本醫(yī)院倫理委員會批準。

患者包括<45歲者12例，≥45歲者53例；男22例，女43例，年齡26～73歲，平均年齡(47.55±10.96)歲；腫瘤直徑<1 cm者48例，≥1 cm者17例；腫瘤單發(fā)的有38例，多發(fā)的27例；病理分期Ⅰ～Ⅱ期者49例，Ⅲ～Ⅳ期者16例；頸部淋巴結轉移者20例，無淋巴結轉移者45例。

1.1.2 主要試劑

一抗：RCN2 Rabbit Polyclonal antibody，批號：10193-2-AP，100 μL；二抗：HRP-Goat Anti-rabbit IgG，批號：ANT020，50 μL；內參：GAPDH Polyclonal Antibody，批號：YM3215，100 μg；ECL顯色試劑盒，批號：WBKLS100，100 mL均購于安特捷生物技術有限公司。全蛋白提取試劑盒購于凱基生物技術有限公司，批號：KGP250，50tests；BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)購于上海翊圣生物科技有限公司，批號：20201ES76，500T；電泳儀型號：MINIVEPS2A200；凝膠成像系統(tǒng)型號：UPVINC。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色法

術中采集所有患者的部分甲狀腺癌組織及癌旁正常組織標本，在病理科醫(yī)生的配合下進行免疫組織化學染色，具體操作如下：用濃度為10%的福爾馬林溶液固定標本，經脫水、石蠟包埋，將蠟塊標本行3 μm厚度連續(xù)切片；烤片2 h，用二甲苯進行2次變性，各5 min；將載玻片轉移至100%、95%、80%、60%的酒精和雙蒸水各5 min；將載玻片放置在裝有檸檬酸的容器中，進行熱修復，后使其在室溫下冷卻；用PBS沖洗3個3 min，使用H2O2于室溫條件下孵育10 min；用PBS沖洗3個3 min；將一抗稀釋(濃度在1∶1000)滴加在載玻片上，4 ℃孵育過夜；用PBS沖洗3個3 min；加二抗(TBST稀釋，濃度1∶1000)后于常溫條件下孵育30 min；用PBS沖洗3個3 min，在室溫下用顯色劑(DAB)顯色8 min，用mayor’s蘇木素復染5 min，用清水沖洗2～3次；分別用60%、80%、95%、和100%的酒精脫水，封片。陰性對照為使用PBS溶液(濃度為0.01 mol/L)替代一抗，陽性對照選用已知的陽性標本切片。

結果判斷:RCN2蛋白主要定位于細胞質，免疫組化中以細胞質黃染為陽性。根據(jù)陽性細胞百分比和染色強度進行評分，由2位病理專業(yè)醫(yī)師進行雙盲獨立評分，隨機觀察5個視野，計算陽性細胞百分比評分：0分，0～9%；1分，10%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，76%～100%。染色強度評分：0分，無染色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，深棕色。計算陽性細胞百分比評分與染色強度評分的乘積，最終免疫評分得分在0～12之間，總得分為4個等級：0為陰性(-)，1～4為弱陽性(+)，5～8為陽性(++)，9～12為強陽性，根據(jù)免疫組織化學評分結果將患者分為高低表達兩組，其中≤4分為低表達，>4分為高表達組。

1.2.2 蛋白質印跡法

術中采集所有患者的部分甲狀腺癌組織及癌旁正常組織標本，具體操作如下：取相同質量的癌和癌旁組織，剪成碎末，按照全蛋白提取試劑盒的要求配液、混合、研磨，注意低溫操作，將組織勻漿液轉移到1.5 mL預冷的離心管中，離心12 000 g，4 ℃離心5 min，取上清液即為全蛋白提取物。蛋白定量(Bradford法、BCA法)，分裝保存于-80 ℃，避免反復凍融。上樣前加入5× SDS上樣緩沖液，量為分裝蛋白樣品的1/4，混勻，100 ℃加熱5 min，冷卻后可放置冰上保存待用或放入-80 ℃保存。驗漏、制膠、上樣，第1個槽加入5 μL marker用來指示蛋白條帶所對應的分子量大小，隨后按照癌、癌旁的順序，每個槽的蛋白質量保證在30 μg，電泳50 V、3 h左右，轉膜200 mA、1.5 h，轉膜后TBST洗2次，一次5 min，牛奶封閉1 h，封閉后加一抗和內參GAPDH(2 μL的一抗配2 mL牛奶，0.4 μL內參配2 mL牛奶)，4°過夜，TBST洗3次，每次10 min，孵二抗(1 μL二抗配10 mLTBST)，1 h后用TBST洗3次，分別10、10、15 min，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像；通過Image J分析灰度值，并利用GraphPad Prism 8對實驗數(shù)據(jù)進行繪圖。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 免疫組織化學染色法

65例甲狀腺乳頭狀癌患者中，RCN2蛋白在癌組織中的高表達率為69.23%(45/65)，明顯高于癌旁正常組織的18.46%(12/65)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=34.023，P<0.001)，RCN2使用免疫組織化學法在癌組織與癌旁組織中的典型表達，見圖1。

a.HE染色100倍顯微鏡下的癌組織；b.HE染色100倍顯微鏡下的癌旁組織；c.免疫組化200倍顯微鏡下的癌組織，以細胞質黃染為陽性；d.免疫組化200倍顯微鏡下的癌旁組織

2.2 蛋白質印跡法

65例甲狀腺乳頭狀癌患者中，RCN2在癌組織中的表達明顯高于癌旁組織(RCN2的分子量是55KD，GAPDH的分子量是36KD)，差異有統(tǒng)計學意義(t=27.665，P<0.001)，見圖2、圖3。

圖2 RCN2蛋白表達條帶

圖3 RCN2蛋白的灰度比值

2.3 RCN2表達與PTC臨床病理因素

RCN2表達與PTC臨床病理因素之間的聯(lián)系，見表1。

表1 RCN2表達與PTC臨床病理因素之間的聯(lián)系

3 討 論

近些年來，隨著醫(yī)療水平的提高，人們對體檢越來越重視，高分辨率超聲(US)的運用使得甲狀腺結節(jié)的隨機檢出率高達76%[9]。資料顯示惡性結節(jié)超聲體征：縱橫比A/T>1，形態(tài)不規(guī)則，邊界不清，無聲暈，內部回聲較復雜，微鈣化，中央型血流分布[10]，且病理結果也證實甲狀腺癌居多，其中PTC的比例最大。據(jù)統(tǒng)計，2018年全球新增甲狀腺癌病例567 233例[11]，雖然PTC預后和總生存時間明顯得到改善[12]。但仍然有部分患者因病灶較小且隱匿，很難在早期被發(fā)現(xiàn)，常出現(xiàn)淋巴結轉移甚至遠處轉移致總體生存率較低[13]。因此探索PTC發(fā)生發(fā)展機制，尋找新的生物靶標尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，作為同一家族RCN中的RCN1蛋白，在結直腸癌[14]、乳腺癌[15]中均高表達，調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，有望成為其潛在的生物標志物；RCN3蛋白在肺癌發(fā)生、侵襲調控中也扮演了重要角色，可作為肺癌的生物標記物[16]。RCN2是與鈣離子結合的蛋白，存在于細胞內液中，參與細胞內的信號轉導[17]，在PTC中表達情況怎樣，是否參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，與患者病理特點之間的關系如何，能否成為調控甲狀腺乳頭狀癌生物學行為的關鍵蛋白和治療靶點，是本研究的主要目的。

本研究結果顯示，在甲狀腺乳頭狀癌組織中RCN2蛋白的表達水平高于癌旁組織，提示在癌細胞中RCN2存在異常表達，且這種高表達可能與疾病的發(fā)生、發(fā)展存在著某種因果聯(lián)系。研究也發(fā)現(xiàn)，RCN2在結直腸癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，是EGFR-ERK信號通路正向調控因子，與PEAK1協(xié)同通過激活EGFR-ERK信號通路實現(xiàn)結直腸癌侵襲遷移[18]；肝細胞癌的研究中也發(fā)現(xiàn)其在癌組織中的表達明顯增加，在信號機制上，RCN2與表皮生長因子受體(EGFR)相互作用，通過調節(jié)EGFR-ERK通路來激活肝癌的生長與侵襲[19]。由此推測，RCN2可能通過調節(jié)EGFR-ERK通路潛在地促進腫瘤細胞增殖和生長，介導腫瘤的進展。

病理特征相關性研究中發(fā)現(xiàn)，病人年齡≥45歲，腫瘤直徑≥1 cm，和腫瘤數(shù)量≥2個、臨床分期Ⅲ和Ⅳ期、有淋巴結轉移的患者癌組織中RCN2表達水平也越高，表明了RCN2與甲狀腺腫瘤惡化進展程度的正相關性。美國癌癥聯(lián)合會將年齡>45歲作為甲狀腺癌患者淋巴結轉移及術后復發(fā)的危險因素[20]。按照國際抗癌聯(lián)盟提出的TNM分期法，淋巴轉移，TNMⅢ、Ⅳ期預后較差；多灶性甲狀腺癌也被稱為不良預后的危險因素[21]。此外，已報道結直腸癌中RCN2蛋白陽性表達也提示預后較差[18]2299-2303，由此推測RCN2 可能促進了腫瘤的增殖、轉移，影響著患者的預后，可成為甲狀腺惡性腫瘤的診斷與預后評判遴選的指標之一。

綜上所述，本實驗研究中發(fā)現(xiàn)RCN2在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達較癌旁明顯升高，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預后密切相關，其可為甲狀腺乳頭狀癌的生物學標志以及潛在治療靶點提供科學依據(jù)，但單一標志物無法對甲狀腺癌的診斷和預后做出準確判斷，臨床醫(yī)師在甲狀腺癌診斷、及預后評估中需全方位考慮。本實驗不足之處在于研究對象數(shù)量相對不足，病理特征相關因素、數(shù)據(jù)相對較少，未跟蹤患者預后，這些在后期將繼續(xù)研究。