牛威，宋揚，信紅月，張蕊，沈健，郭蓮怡，杜霞霞

(1.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院；2.錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

在消化系統(tǒng)的惡性腫瘤當中，胃癌是最常見的一種，近年來，我國的胃癌患者數(shù)量逐年上升，呈顯著上升趨勢，死亡率也極高[1-2]。當前在對實體腫瘤的治療過程中，免疫治療取得了突破性的成果，其中最有代表性的就是PD-1/PD-L1抑制劑單克隆抗體藥物[3]。目前，美國食品藥品監(jiān)督局已經(jīng)批準將PD-L1單克隆抗體藥物阿特珠單抗(atezolizumab)用于治療泌尿系統(tǒng)腫瘤[4]。盡管已經(jīng)有研究證明PD-1/PD-L1單克隆抗體在腫瘤治療中具有一定的有效率，但效率略低。因此尋求一種能夠與其聯(lián)合治療腫瘤的方法是非常必要的。而目前已有研究表明，腸道菌群平衡在維持機體正常的免疫調(diào)節(jié)和粘膜屏障等功能方面均發(fā)揮著非常重要的作用，益生菌是維持腸道菌群平衡的重要組成細菌，雙歧桿菌作為非常經(jīng)典的益生菌，在促進人體的消化吸收和免疫應答的調(diào)節(jié)當中發(fā)揮著非常重要的作用[5]。已經(jīng)有多項研究證實，雙歧桿菌不但可以幫助緩解潰瘍性結腸炎、抑制結腸癌的發(fā)生發(fā)展[6-7]，還可以調(diào)節(jié)胃癌術后患者的腸道菌群平衡，在預防化療副作用中也有一定的效果。本文旨在于進一步探究PD-1/PD-L1單克隆抗體與雙歧桿菌聯(lián)合后治療胃癌患者的療效，為臨床對于胃癌的治療和相關藥物的研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

人中分化胃腺癌細胞株SGC-7901購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑

PBS緩沖液(北京索萊寶公司)、HE染色試劑盒(北京索萊寶公司)、免疫組化試劑盒(福州邁新生物技術有限公司)、PrimeScript TM RT reagent Kit with g DNA Eraser(TaKaRa)、RNA提取試劑盒(北京天根生物技術有限公司)、PD-1/CD279 Antibody(武漢三鷹生物技術有限公司)、PD-L1/CD274 Antibody(武漢三鷹生物技術有限公司)、CD8Antibody(武漢三鷹生物技術有限公司)、IgG抗體-HRP(武漢三鷹生物技術有限公司)、DMEM高糖培養(yǎng)基(Thermo)、1640培養(yǎng)基(Thermo)、優(yōu)質(zhì)胎牛血清(Thermo)、PVDF 膜(Thermo)、BCA 蛋白定量試劑盒(Thermo)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(Thermo)、ECL發(fā)光檢測試劑盒(Thermo)。

1.1.3 主要實驗儀器與耗材

酶標儀(美國EXL800)、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)、轉(zhuǎn)膜儀(美國Thermo公司)、垂直板電泳儀(美國Thermo公司)、電泳電源(美國Thermo公司)、高速離心機(上海一恒)、ABI7000熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)、光學顯微鏡(日本Olympus公司)、磁力攪拌器(德國IKA公司)、恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司)、制冰機(意大利Scotsman公司)、超凈工作臺(美國BioX科技有限公司)、CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo)、水浴鍋(上海一恒)。

1.2 方法

1.2.1 Western Blot

(1)蛋白質(zhì)的提取：將裂解液置于室溫融化并加體積1%的 PMSF，加入相應體積的樣本，然后置于冰上繼續(xù)靜置 5 min，冷凍低溫離心機，4 ℃，12 000 rpm，離心10 min，取上清于新1.5 EP管中，上清液為蛋白質(zhì)抽提物；(2)蛋白質(zhì)定量：將 0.5 μg/μL的BSA 蛋白標準液按照操作說明每孔分別為 0、1、2、4、8、12、16、20 μL，每孔用磷酸鹽緩沖液補至體積為20 μL，制備蛋白質(zhì)樣本：取待測蛋白樣本1 μL，用磷酸鹽緩沖液補至體積為20 μL，實驗每孔BCA 工作液體積為 200 μL，按照A∶B 液體積比 50∶1，每孔中加入配制好工作液，37 ℃反應 20 min，提前啟動預熱15 min酶標儀，讀取波長 570 nm 處結果，記錄數(shù)據(jù)，繪制標準曲線，通過回歸方程計算，按標準蛋白濃度及對應吸光值然后乘以稀釋倍數(shù)，得到樣本的蛋白濃度；(3)SDS-PAGE：按照說明書配膠范圍和目的蛋白分子量大小，選取 5%的濃縮膠，9%、15%的分離膠進行配制。首先配制分離膠，加入10%過硫酸鈉、TEMED 混勻后，沿一側玻璃板灌入并用水封閉上層，分離膠凝聚穩(wěn)定后，棄掉上層液體，加入10%過硫酸鈉、TEMED，沿一側玻璃板灌入配制好的濃縮膠，插入梳子，等待 30 min 左右，即可使用，用PBS將樣品稀釋后，加入5×Loading Buffer 并用EP管密封，煮沸8 min。其中上樣體積為20 μL，蛋白上樣量為40 μg，將配好的電泳液倒入電泳槽，應每孔上樣20 μL，Marker蛋白第1孔加5 μL，連通電極，注意正負極一一相對，電壓60～80 V，恒定2.5 h；(4)轉(zhuǎn)膜：將配置好的轉(zhuǎn)膜液放入4 ℃冰箱預冷，在電泳結束前，用預冷的先配制好的轉(zhuǎn)膜液充分浸潤轉(zhuǎn)膜用的濾紙、海綿等，PVDF膜用無水甲醇激活后，用DDW清洗5 min 浸入轉(zhuǎn)膜液中，充分浸潤，電泳結束后取出玻璃板，小心注意保證膠的完整性，切掉全部濃縮膠以及分離膠的底部，將剩余膠在轉(zhuǎn)膜液中浸泡 10 min，開始轉(zhuǎn)膜，80 V，1.5 h；(5)封閉：配置1×TBST緩沖液和5%脫脂奶粉(TBST稀釋)；取出PVDF膜，用TBST緩沖液搖床清洗5 min，一共3次，將PVDF膜浸入5%脫脂奶粉溶液中，搖床孵育1 h；(6)孵育一抗：將抗體按照1∶1000稀釋，稀釋液為1×TBST 緩沖液，將PVDF膜放入小盒中，加入稀釋抗體工作液，置4 ℃孵育過夜；(7)孵育二抗：用無菌鑷子取出孵育的 PVDF 膜，用 1×TBST 搖床清洗 5 min，一共清洗 3次；二抗稀釋倍數(shù)為1∶5000，1×TBST 稀釋；將PVDF膜放入小盒中，加入二抗稀釋抗體工作液，37 ℃孵育1 h；(8)ECL 底物發(fā)光：取出 PVDF 膜，TBST 清洗 5 min，一共 6次，ECL 發(fā)光試劑盒顯色，Image J軟件分析灰度值，進行統(tǒng)計分析。

1.2.2 熒光定量PCR

1.2.2.1 提取總RNA

2.5 健康指導 向患者闡述與疾病相關的知識，提高對曼氏裂頭蚴感染危害性的認識，說明食物除應具備的營養(yǎng)要素外，還應保證其衛(wèi)生安全，防止有害因素引起的食源性疾病。首先，養(yǎng)成良好的個人衛(wèi)生習慣，做到飯前便后要洗手，注意手的衛(wèi)生是飲食安全的第一步。其次，養(yǎng)成良好的飲食衛(wèi)生習慣，不吃不潔食物，不飲用生水等，防止病從口入。生、熟食要分開處理，烹調(diào)食物時，要充分煮熟，保持餐具清潔衛(wèi)生。

(1)首先對操作臺和相應設備進行無菌無酶處理，將等質(zhì)量組織塊的放入研缽中，快速充分研磨到組織充分變?yōu)榉勰?，將上述充分研磨過后的、粉末狀的腫瘤組織轉(zhuǎn)移至裝 EP 管中，EP管中已經(jīng)裝好Buffer RL裂解液，隨后吹打至完全溶解；(2)將EP管放入4 ℃離心機中內(nèi)，10 000 rpm離心10 min。移上清液到容積為1.5 mL的RNase Tube中；(3)將gDNA 去除核酸純化柱在4 ℃的狀態(tài)下進行12 000 rpm離心60 s，之后棄去gDNA 去除核酸純化柱，保留濾液；(4)向收集管中加入相同體積的70%乙醇，混勻后，立即將混合液全部轉(zhuǎn)移到RNA核酸純化柱中；(5)同時將RNA梳酸純化柱和收集管進行4 ℃、12 000 rpm離心1 min，棄掉濾液，吸取500 μL的緩沖液RWA(buffer RWA)于RNA核酸純化柱中，4 ℃下12 000 rpm離心35 s，棄濾液；(6)吸取600 μL的緩沖液RWB至RNA核酸純化柱中，4 ℃下12 000 rpm離心30 s，棄掉濾液，此步驟需重復2次；(7)將RNA核酸純化物放在收集管中，4 ℃下12 000 rpm離心2 min，棄掉濾液，將RNA核酸純化柱放在核糖核酸酶空白收集管(RNase free collection tube)上，向內(nèi)滴加50 μL的無酶水，室溫下反應5 min；(8)應用紫外線分光光度計測量RNA的濃度和OD值。

1.2.2.2 DNA逆轉(zhuǎn)錄反應

去c除基因組DNA反應：配制反應液，加入適量濃度的mRNA。依據(jù)所加RNA濃度推算出要加入的無酶水的體積，確保反應總體積是10.0 μL。將反應液放入42 ℃下反應2 min，見表1。

逆轉(zhuǎn)錄反應：配制混合液，吸取10.0 uL工作液至EP管內(nèi)，EP管中已裝有上步反應所制得的反應液，兩者混合后，最終得到反應體系的混合液總體積應為20.0 μL 。將上述混合液均勻混合后，放置于普通PCR儀上，保證反應條件為：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，進行逆轉(zhuǎn)錄反應。待cDNA的成功合成后，進行下一步實驗，見表2。

表2 逆轉(zhuǎn)錄反應混合液

1.2.2.3 設計與合成引物

在美國國家生物技術信息中心上檢索到人PD-1、PD-L1和內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因序列后，由北京華大生物公司設計合成，見表3。

表3 引物序列

配置反應液：配制反應液，根據(jù)預實驗確定引物濃度，通過調(diào)整無酶水的用量來保證反應體系的總體積為20.0 μL，見表4。

表4 PCR反應混合液

進行反應：(1)預變性：95 ℃、30 s、1 cycle；(2)PCR反應：95 ℃、5 s，60 ℃、30 s、35 cycles；(3)熔解反應：95 ℃、5 s，60 ℃、1 min、95 ℃、1 cycle；(4)降溫：50 ℃、30 s、1 cycle。

1.2.3 成瘤實驗

選取4周齡白變種實驗室(BALB/C)裸鼠20只，體重為18～20 g，飼養(yǎng)級別為SPF級，自由飲水飲食。分為 SGC7901胃癌細胞皮下成瘤模型組、PD-L1單克隆抗體干預胃癌模型組、雙歧桿菌灌服胃癌模型組、PD-L1單克隆抗體聯(lián)合雙歧桿菌干預及灌服胃癌模型組。

SGC7901胃癌細胞皮下成瘤模型組：將人胃癌細胞株SGC7901消化后，調(diào)整細胞濃度為2×107個/毫升；采用皮下注射的方式給模型組小鼠注射0.2 mL細胞懸液；PD-L1單克隆抗體干預胃癌模型組：分別在皮下成瘤后0、2、4、6天為該組小鼠腹腔注射抗PD-L1 200微克/只；雙歧桿菌灌服胃癌模型組：在皮下注射成瘤10 d前，為每只鼠進行雙歧桿菌菌液灌胃處理，劑量為1×109CFU/d；建模成功后繼續(xù)每天進行灌胃處理；PD-L1單克隆抗體聯(lián)合雙歧桿菌干預及灌服胃癌模型組：分別于皮下成瘤后0、2、4、6天為小鼠行腹腔注射抗PD-L1 200微克/只。同時為該組小鼠每天進行雙歧桿菌菌液1×109CFU/d灌胃處理。

各組小鼠于第21天時脫頸處死，取出腫瘤組織，稱重、計算腫瘤體積。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 PD-1和 PD-L1在各組小鼠中蛋白水平的檢測

使用免疫印跡法對上述各組鼠腫瘤組織中PD-1和PD-L1蛋白質(zhì)的表達水平進行檢測，與皮下成瘤模型組比較，3個治療組鼠腫瘤組織中PD-1和PD-L1的蛋白質(zhì)的表達均降低(P<0.05)。其中PD-L1單克隆抗體聯(lián)合雙歧桿菌組腫瘤組織中的 PD-1和PD-L1的表達量降低最明顯，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。而兩個單獨治療組的腫瘤組織中PD-1和PD-L1的表達水平不存在明顯差異，見圖1。

2.2 PD-1和PD-L1在各組小鼠中基因水平的檢測

對3個治療組鼠腫瘤組織中PD-1mRNA和 PD-L1mRNA的表達量進行檢測，發(fā)現(xiàn)：與模型組對比，3個不同治療組腫瘤組織PD-1mRNA和PD-L1mRNA的表達水平均低于模型組(P<0.05)。其中PD-L1單克隆抗體聯(lián)合雙歧桿菌組腫瘤組織中PD-1mRNA和PD-L1mRNA的表達量最低，統(tǒng)計學差異明顯(P<0.05)。而兩個單獨治療組的腫瘤組織中PD-1mRNA和 PD-L1mRNA的表達量無明顯差異，見圖2。

*代表與PD-L1單克隆抗體+雙歧桿菌+模型組進行比較；ns代表單獨給藥組組間比較；*P<0.05

2.3 PD-L1單克隆抗體聯(lián)合雙歧桿菌對小鼠腫瘤增殖的影響

PD-L1單克隆抗體聯(lián)合雙歧桿菌組中小鼠成瘤的體積最小、重量最輕(P<0.05)；二者單獨應用，也同樣在一定程度上抑制了腫瘤的增殖，但沒有聯(lián)合應用的抑制效果明顯，見圖3。

圖3 PD-L1 單抗聯(lián)合雙歧桿菌對小鼠腫瘤增殖的影響

3 討 論

癌是臨床上高發(fā)的惡性腫瘤之一，具有持續(xù)的擴散和侵襲能力。全世界每年大約有幾十萬人死于胃癌[8]。近年來，胃癌在我國的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，對胃癌患者進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，PD-L1在Ⅱ期和Ⅲ期的胃癌患者中均呈現(xiàn)高表達現(xiàn)象[9-10]。在腫瘤浸潤性樹突細胞、淋巴細胞、巨噬細胞中均呈現(xiàn)高表達現(xiàn)象，而與腫瘤相關的微環(huán)境也可誘導腫瘤細胞表達PD-L1[11-13]。PD-L1與腫瘤的免疫與發(fā)生關系非常密切，因此阻斷PD-L1/PD-L1 對胃癌的發(fā)生發(fā)展至關重要[14-16]。雙歧桿菌的細胞壁中含有完整肽聚糖(whole peptidoglycan，WPG)具有一定的抗腫瘤的作用[17]。有研究結果表明，WPG通過上調(diào)結腸癌HT-29細胞中促凋亡基因，下調(diào)抗凋亡基因，發(fā)揮細胞毒作用[18]。WPG具有促進腫瘤殺傷性效應分子分泌，增強巨噬細胞的活力和吞噬能力、促進B細胞分泌抗體等功能。

綜上所述，本實驗采用體內(nèi)實驗，首先應用胃癌細胞株進行鼠皮下成瘤實驗，然后應用PD-L1單克隆抗體和雙歧桿菌分別及共同干預及灌服成瘤小鼠，試驗后發(fā)現(xiàn)：單獨應用PD-L1單克隆抗體可以對胃癌產(chǎn)生一定的療效，聯(lián)合雙歧桿菌后能夠顯著降低成瘤率、腫瘤體積和腫瘤重量，并在蛋白質(zhì)和基因水平降低了腫瘤組織中PD-1和PD-L1的表達，效果更明顯。

胃癌的免疫治療已成為繼手術、化療后新的治療手段，本研究通過PD-L1單克隆抗體和雙歧桿菌聯(lián)合應用于小鼠胃癌模型，發(fā)現(xiàn)可以增加小鼠胃癌的治療效果，以后會逐步過渡到臨床實驗，為胃癌臨床治療提供理論依據(jù)，為延長胃癌患者的生命提供新的視角。