徐曉冬，高 云，曲冬穎

1.沈陽市第五人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 沈陽 110023；2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 沈陽 110016

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指女性與同一性伴侶發(fā)生連續(xù)兩次或兩次以上的妊娠失敗[1]，是不孕癥中最重要的問題之一。RSA的發(fā)生可能由遺傳或子宮問題、血栓形成、自身免疫性內(nèi)分泌疾病、感染等引起[2]，但有約50%的RSA患者的發(fā)病機制尚不明確[3]。血管生成是妊娠成功的關(guān)鍵，這一通路的中斷會導(dǎo)致各種不良妊娠結(jié)局，如RSA[4]。血小板源性生長因子BB(platelet derived growth factor BB，PDGF-BB)可通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞增殖來調(diào)節(jié)血管生成[5-6]，在RSA中發(fā)揮重要作用。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是調(diào)節(jié)血管生成的重要因子[7]，在正常妊娠中，iNOS參與排卵、著床、滋養(yǎng)細胞入侵、胚胎發(fā)育等[8]。有研究報道，iNOS因在血管生成中的作用而可能影響RSA[9]。本研究旨在探討RSA患者絨毛組織中PDGF-BB、iNOS的表達水平及其與血管新生的相關(guān)性。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將沈陽市第五人民醫(yī)院自2014年1月至2019年1月收治的200例RSA患者納入B組。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡20～40歲；超過2次自然流產(chǎn)史；夫妻雙方無染色體異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并相關(guān)內(nèi)科疾病。另將同期收治的200例行人工流產(chǎn)的正常早孕患者納入A組。A組平均年齡(32.16±2.21)歲，平均孕周(10.65±1.67)周；B組平均年齡(32.87±2.56)歲，平均孕周(10.23±1.25)周。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性?；颊呒捌浼覍倬炇鹬橥鈺?。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 鼠抗人PDGF-BB單克隆抗體(北京鼎國生物技術(shù)公司)，兔抗iNOS多克隆抗體、兔抗CD105多克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體(美國Abcam公司)，裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)，蛋白Marker、二抗(武漢博士得公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 Western Blot 將絨毛組織裝入EP管，稱重，置于冰上剪碎。按比例加入裂解液、蛋白酶抑制劑，混勻，超聲細胞粉碎儀(JY-882N，寧波新藝生物公司)將管內(nèi)組織打碎，置于4℃裂解30 min后，12 000 r/min、4℃離心30 min，保留上清液。根據(jù)BCA蛋白試劑盒說明書進行具體操作，100℃煮制蛋白5 min使蛋白變性，分裝儲存于-80℃?zhèn)溆?。配制分離膠和濃縮膠，在配制膠的兩端加入蛋白Maker作為標(biāo)記，其余空白孔道中加入樣品，根據(jù)測定的蛋白濃度等質(zhì)量上樣，電泳、跑膠、轉(zhuǎn)膜。清洗后將膜用5% BSA封閉后置于37℃溫箱中1 h，再分別加入iNOS一抗(1∶2 000)、PDGF-BB一抗(1∶1 000)、GAPDH一抗(1∶5 000)，4℃孵育過夜。復(fù)溫后加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，置于37℃溫箱中孵育2 h。PVDF洗膜液中將膜清洗10 min，共3次。采用Bio-Rad Lab軟件進行ECL發(fā)光，拍攝照片進行保存。通過灰度分析計算PDGF-BB、iNOS與對照GAPDH的比值。

1.3.2 免疫組化 4%甲醛溶液固定絨毛組織36 h，石蠟包埋、切片，采用S-P免疫組化兩步法，DAB顯色、脫水、透明和封片。然后對絨毛膜組織中的PDGF-BB、iNOS表達進行分析；CD105標(biāo)記新生血管內(nèi)皮，觀察PDGF-BB、iNOS與微血管密度(microvessel density，MVD)的相關(guān)性。10×40倍顯微鏡下觀察PDGF-BB、iNOS的表達，評分參照Fromowitz綜合計分法[10]，除外陰性均視為陽性，陽性率計算方法參考文獻[11]；MVD計數(shù)方法參考文獻[12]。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者絨毛組織中PDGF-BB和iNOS蛋白表達水平比較 與A組比較，B組絨毛組織中PDGF-BB蛋白表達減少，iNOS蛋白表達增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組患者絨毛組織中PDGF-BB和iNOS蛋白表達水平比較

2.2 兩組患者絨毛組織中PDGF-BB蛋白免疫組化染色結(jié)果比較 B組絨毛組織中PDGF-BB蛋白陽性率低于A組(34.0%比60.5%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 兩組患者絨毛組織中PDGF-BB蛋白免疫組化染色結(jié)果(a.A組；b.B組；400倍)

2.3 兩組患者絨毛組織中iNOS蛋白免疫組化染色結(jié)果比較 B組絨毛組織中iNOS蛋白陽性率高于A組(59.0%比36.0%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 兩組患者絨毛組織中iNOS蛋白免疫組化染色結(jié)果(a.A組；b.B組；400倍)

2.4 兩組患者絨毛組織中MVD比較 B組平均MVD低于A組[(25.77±4.98)比(39.68±5.39)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 PDGF-BB、iNOS與MVD相關(guān)性 A組、B組PDGF-BB與iNOS表達水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.689、-0.815，P<0.05)，PDGF-BB與MVD呈正相關(guān)(r=0.758、0.826，P<0.05)，iNOS與MVD呈負(fù)相關(guān)(r=-0.793、-0.861，P<0.05)。

3 討論

在維持正常妊娠過程中，充足的新生血管是必不可少的[13]。因此，血管調(diào)控因子在妊娠期發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。PDGF-BB是一種促進血管生成的生長因子，可以刺激內(nèi)皮細胞形成新生的血管網(wǎng)絡(luò)，穩(wěn)定血管發(fā)育。PDGF-BB存在于子宮內(nèi)膜的管腔上皮、子宮間質(zhì)、子宮腺體和子宮內(nèi)膜的血管，其表達下降會導(dǎo)致小鼠周細胞數(shù)量減少、滋養(yǎng)細胞減少、血管明顯擴張、水腫，甚至胚胎死亡。PDGF-BB及其血管生成受體參與組織重構(gòu)，并作為炎癥反應(yīng)的傳播者和效應(yīng)器發(fā)揮作用。PDGF-BB還是調(diào)控胚胎著床部位的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞運動因子之一[14]。在有氧環(huán)境中，iNOS被誘導(dǎo)表達，產(chǎn)生過量的一氧化氮與超氧化物發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致過氧亞硝酸鹽的形成，并產(chǎn)生細胞毒性。在病理條件下生成的一氧化氮能夠減少輸卵管運動，引起子宮肌纖維收縮，從而導(dǎo)致流產(chǎn)[15]。有研究報道，PDGF-BB能夠通過誘導(dǎo)ERK1/2激活而抑制iNOS表達[16]。

MVD是衡量血管生成的定量指標(biāo)。CD105作為標(biāo)記血管新生的特異性標(biāo)志物，明顯區(qū)別于泛血管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物的特征是其僅在增殖活躍的血管內(nèi)皮細胞上呈強表達。有研究報道，在妊娠早期胚胎發(fā)育和胎盤處于相對缺氧的環(huán)境中時，缺氧誘導(dǎo)因子-lα被激活，并誘導(dǎo)下游靶基因PDGF-BB轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而參與胎盤滋養(yǎng)細胞浸潤和絨毛血管發(fā)育；而在稽留流產(chǎn)的絨毛組織中，PDGF-BB表達降低，導(dǎo)致絨毛血管結(jié)構(gòu)發(fā)育不良、血管生成受阻、血管數(shù)目減少和形態(tài)異常、血管滲透性增加，使胎兒胎盤單位灌注不足，胚胎缺血缺氧，從而導(dǎo)致流產(chǎn)[11，17]。Nanaev等[18]研究表明，在妊娠豚鼠胎盤血管附近的滋養(yǎng)細胞中有iNOS表達，該細胞可以破壞血管壁，導(dǎo)致血管生成減少，進而引起不良妊娠，導(dǎo)致流產(chǎn)。

綜上所述，RSA患者絨毛組織中PDGF-BB和iNOS的異常表達使胎盤血管新生受限，影響胚胎發(fā)育，導(dǎo)致流產(chǎn)。