劉陳立 董宇軒 郭 旋

1(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院中國科學(xué)院定量工程生物學(xué)重點實驗室 深圳 518055)

2(中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

1 引 言

回顧腫瘤細(xì)菌療法走過的百年歷程，從最早外科醫(yī)生的偶然發(fā)現(xiàn)(患者感染病原菌后腫瘤生長得到抑制)[1]，到 William B. Coley 醫(yī)生開發(fā)細(xì)菌制劑 Coley’s Toxins 用于腫瘤治療[2]，再到近二十年研究者通過基因工程改造細(xì)菌來提高腫瘤治療效果，細(xì)菌療法在腫瘤治療中一直扮演著重要角色。近年來，隨著合成生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，研究者也在思考如何進(jìn)一步優(yōu)化腫瘤細(xì)菌療法，為腫瘤治療提供更多樣化、更有效安全的策略[3]。

腫瘤細(xì)菌療法依賴自然界中細(xì)菌的毒力、自主運動能力以及對腫瘤的趨向性和侵襲能力等特征，使細(xì)菌具有調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境、誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)的能力[4]。目前研究者依據(jù)細(xì)菌生物生理功能的不同，為治療腫瘤提供了不同的干預(yù)策略[5]。此外，細(xì)菌基因組簡單，易于進(jìn)行工程改造，這也進(jìn)一步提高了細(xì)菌對環(huán)境感應(yīng)、特異靶向和智能遞送藥物等能力[6]。上述特點賦予細(xì)菌為許多難治性、轉(zhuǎn)移性癌癥類型提供更好的解決方案的能力，加速了腫瘤細(xì)菌治療藥物在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研發(fā)進(jìn)程和未來臨床應(yīng)用成功轉(zhuǎn)化的可能性[7]。

本文從腫瘤細(xì)菌療法面向臨床試驗的角度出發(fā)，歸納總結(jié)了梭狀芽孢桿菌(Clostridiumsp.)、單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、沙門氏菌(Salmonellasp.)和大腸桿菌(Escherichia coli)等不同種屬細(xì)菌在臨床試驗中的代表性研究進(jìn)展和面臨的瓶頸問題。重點介紹了合成生物學(xué)利用細(xì)菌作為模塊化工程平臺，設(shè)計微妙而復(fù)雜的基因線路，在提高細(xì)菌療法有效性和改善臨床生物安全性等方面的應(yīng)用，從而彌補(bǔ)目前腫瘤細(xì)菌療法在臨床測試中的不足，助力細(xì)菌療法突破瓶頸，推動臨床試驗進(jìn)展。

2 腫瘤細(xì)菌療法在臨床測試中的范例

2.1 梭狀芽孢桿菌

梭狀芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性菌，是最大的原核生物屬之一，由于芽孢形態(tài)呈圓形或卵圓形，使菌體膨大呈梭狀，所以被稱為梭狀芽孢桿菌[8]。梭狀芽孢桿菌是專性厭氧菌，因此，賦予了其在氧氣匱乏的實體腫瘤壞死區(qū)域定植的能力[9]。此外，梭菌芽孢的萌發(fā)是由多種因素導(dǎo)致的，包括營養(yǎng)物質(zhì)、酶、液體靜壓力或陽離子表面活性劑等[10]，使其形成具有代謝活性的細(xì)菌細(xì)胞。

目前已有多株梭狀芽孢桿菌被報道應(yīng)用于治療腫瘤，包括溶組織梭狀芽胞桿菌(C. histolyticum)[11]、破傷風(fēng)梭菌(C. tetani)[12]、溶瘤梭菌(C. sporogenes)[13]和丙酮丁醇梭桿菌(C. acetobutylicum)[14]等。梭狀芽孢桿菌在腫瘤治療中的應(yīng)用歷史可以追溯到 1813 年，外科醫(yī)生 Vautier 首先觀察到腫瘤患者在感染梭狀芽孢桿菌后患上氣性壞疽，但患者體內(nèi)的腫瘤竟然消退了[15]。1935 年，Connell[1]首次使用來自溶組織梭狀芽胞桿菌的細(xì)菌培養(yǎng)液干預(yù)治療了 30 例癌癥患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤病情在部分患者上有所緩解。1947 年，Parker 等[16]首次將溶組織梭狀芽胞桿菌用于治療荷瘤小鼠，結(jié)果顯示靜脈注射細(xì)菌激發(fā)小鼠全身性免疫反應(yīng)能在短期內(nèi)延長小鼠壽命，但腫瘤并沒有完全消退。1955 年，Malmgren 和 Flanigan[17]通過探究破傷風(fēng)梭菌在小鼠各個組織器官和瘤內(nèi)的定植數(shù)量，進(jìn)一步證明了梭狀芽孢桿菌對實體瘤的特異定植能力。在對小鼠注射高濃度劑量的破傷風(fēng)梭菌孢子的 48 h內(nèi)，只有在實體瘤內(nèi)檢測到了破傷風(fēng)梭菌，這說明了細(xì)菌孢子在實體瘤內(nèi)定植的特異性。以上研究均表明，梭狀芽孢桿菌具備腫瘤治療的潛力。

但由于梭狀芽孢桿菌的天然毒力過強(qiáng)，其在腫瘤治療中的應(yīng)用也受到一定限制。對此，Dang等[18]對包含雙歧桿菌(Bifidobacterium)、乳酸菌(Lactobacillus)和梭狀芽孢桿菌在內(nèi)的 26 種不同菌株評估了其在實體瘤厭氧區(qū)的特異定植能力。通過將細(xì)菌或梭菌孢子靜脈注射入 B16 黑色素瘤荷瘤小鼠后，發(fā)現(xiàn)一株諾維氏梭菌(C. novyi)表現(xiàn)出優(yōu)異的定植能力。Dang 等[18]通過對該菌株加熱誘導(dǎo)，在 400 多個細(xì)菌菌落中篩選到缺失致死性毒素基因的減毒株C. novyi-NT，從而降低了梭狀芽孢桿菌在靜脈注射后造成的全身毒性。減毒株C. novyi-NT的孢子僅在小鼠實體瘤的血管匱乏區(qū)域(厭氧區(qū))出芽萌發(fā)，并破壞周圍的腫瘤細(xì)胞。另外，Dang 等[18]還開發(fā)了一種聯(lián)合溶菌療法(Combination Bacteriolytic Therapy，COBALT)，通過將C. novyi-NT孢子與常規(guī)化療藥物聯(lián)合使用，顯著延長了抗腫瘤作用的持續(xù)時間。這種細(xì)菌聯(lián)合其他療法的治療策略不僅突破了常規(guī)化療藥物無法深入遞送到血管匱乏的實體瘤內(nèi)部的瓶頸，也開創(chuàng)了聯(lián)合細(xì)菌治療腫瘤的先河。

雖然目前對梭狀芽孢桿菌治療腫瘤的機(jī)制尚未清晰，但有研究表明梭菌產(chǎn)生的諸如胞嘧啶脫氨酶、硝基還原酶以及磷脂酶、溶血素和脂肪酶等破壞腫瘤細(xì)胞的毒素可能在腫瘤治療中發(fā)揮了積極作用[19]。另外，也有研究報道梭菌孢子可以在腫瘤細(xì)胞中萌發(fā)，誘導(dǎo)表達(dá)針對在腫瘤發(fā)展中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子——缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)[20]和不同細(xì)胞因子如 TNF-α[21]、IL-2[22]和 IL-12[23]，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖或轉(zhuǎn)移[18]。

值得關(guān)注的是，減毒株C. novyi-NT在 2019年完成了 1 期臨床測試(NCT01924689)。測試中，對 24 例過往接受過化療或放療等常規(guī)方法且沒有治療效果的晚期實體腫瘤患者，接受單次瘤內(nèi)注射 6 個遞增劑量的C. novyi-NT的細(xì)菌孢子(1×104～3×106個/kg)，以確定劑量限制毒性(DLT)和最大耐受劑量。結(jié)果顯示在 24 名患者中，單次腫瘤內(nèi)注射C. novyi-NT后，10 名患者(42%)的瘤內(nèi)檢測到細(xì)菌孢子出芽萌發(fā)，并導(dǎo)致腫瘤病灶減小[24]。

2.2 單核細(xì)胞增生性李斯特菌

單核細(xì)胞增生性李斯特菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性胞內(nèi)桿狀菌。李斯特菌感染會導(dǎo)致患者產(chǎn)生多種癥狀，包括腸胃炎、腦膜炎和腦炎[25]。但一般來說，人類免疫系統(tǒng)具有強(qiáng)大的先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，能夠有效控制李斯特菌感染。因此，由李斯特菌造成的極其嚴(yán)重的感染通常僅發(fā)生于老年人、孕婦或免疫功能低下的患者[26]。隨著對單核細(xì)胞增生性李斯特菌侵染細(xì)胞并激發(fā)強(qiáng)烈細(xì)胞免疫應(yīng)答特性的深入研究，研究者也在考慮利用細(xì)菌的免疫原性來開發(fā)腫瘤疫苗[26]。

相比于其他細(xì)菌載體可能會被中和抗體抑制而失去作用，單核細(xì)胞增生性李斯特菌感染僅會觸發(fā)適度的體液反應(yīng)，這使其能多次使用來有效增強(qiáng)患者的 T 細(xì)胞反應(yīng)[19]。值得關(guān)注的是，單核細(xì)胞增生性李斯特菌是激活細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的有效刺激因子[27]。1962 年，Mackaness[28]報道了小鼠暴露于亞致死劑量的李斯特菌后，會產(chǎn)生時間持久、獨立于抗體的免疫反應(yīng)，這保護(hù)了未來致命劑量的李斯特菌的感染?；谶@些實驗數(shù)據(jù)和理論成果，研究者們開始探索通過開發(fā)李斯特菌疫苗載體，誘導(dǎo)激活細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答來清除外源抗原。Schafer 等[29]在 1992年首次報道了通過改造李斯特菌載體表達(dá)大腸桿菌的 β-半乳糖苷酶抗原來作為腫瘤靶向藥物，誘導(dǎo) BALB/c 小鼠的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞反應(yīng)。自從這個開創(chuàng)性的工作成果發(fā)表后，近 30 年來，基于李斯特菌治療各種癌癥的研究被廣泛報道。

感染過程中，單核細(xì)胞增生性李斯特菌會侵入腸上皮細(xì)胞，隨后細(xì)菌進(jìn)一步遷移到脾臟、肝臟等正常組織器官，并被抗原呈遞細(xì)胞(Antigen-Presenting Cells，APC)吞噬，激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，表現(xiàn)如促炎細(xì)胞因子表達(dá)增高、李斯特菌特異性激活 CD4＋T 細(xì)胞應(yīng)答和 MHC I 類分子向CD8＋T 細(xì)胞分泌蛋白抗原等[26]。但李斯特菌會通過產(chǎn)生穿孔素(Listeriolysin，LLO)和肌動蛋白裝配誘導(dǎo)蛋白(Actin Assemble Inducingprotein，ActA)在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散存活[30]。

截至 2014 年，多項李斯特菌腫瘤疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗。第一個推向臨床試驗的是應(yīng)用于治療晚期宮頸癌的重組減毒活菌疫苗Lm-LLO-E7[31]。Lm-LLO-E7 是將人乳頭瘤病毒 HPV-16 E7 抗原融合到李斯特菌穿孔素蛋白Listeriolysin O 的非溶血片段，再由李斯特菌分泌表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤抗原的免疫原性。在這項 1 期臨床試驗中，對 15 例既往治療過的轉(zhuǎn)移性、難治性或復(fù)發(fā)性的晚期浸潤性宮頸癌患者進(jìn)行了Lm-LLO-E7 的安全性評估?；颊呓邮?3 個劑量水平的Lm-LLO-E7 (1×109CFU、3.3×109CFU 和1×1010CFU)靜脈滴注，3 周后第二次注射。在接受治療之后，所有患者均表現(xiàn)出不良反應(yīng)，包括流感樣綜合征和低血壓等臨床癥狀。到研究實驗結(jié)束，2 例患者死亡、5 例病情有發(fā)展、7 例病情穩(wěn)定、1 例符合部分應(yīng)答標(biāo)準(zhǔn)，該研究首次表明，減毒活疫苗對晚期浸潤性宮頸癌患者是安全的，且對腫瘤有一定抑制作用[31]。

另外兩個比較有代表性的李斯特菌疫苗分別是 CRS-207 和 ADXS11-001。其中，CRS-207 是在敲除了兩個毒力基因actA和內(nèi)化蛋白B (Internalin B)的基礎(chǔ)上，表達(dá)人源間皮素的減毒株。這兩個毒力基因的缺失降低了細(xì)菌在細(xì)胞間的擴(kuò)散能力和對非吞噬細(xì)胞的侵襲能力。研究表明，與野生型單核細(xì)胞增生性李斯特菌相比，CRS-207 的定植水平降低了 1 000 倍[32]。在對CRS-207 的安全性臨床測試中，17 名間皮瘤、肺癌、胰腺癌或卵巢癌受試者接受 CRS-207 的 4 個遞增劑量(1×108CFU、3×108CFU、1×109CFU、1×1010CFU)后，患者耐受性良好，并在血清細(xì)胞因子或趨化因子水平觀察到了患者機(jī)體免疫系統(tǒng)的激活。在 17 名受試者中，37% 的受試者生存期達(dá)到 15 個月，證明了該疫苗的生物安全性和治療腫瘤的潛力(NCT00585845)。另外，研究者也對 CRS-207 聯(lián)合培美曲塞/順鉑化療的治療有效性做了臨床評估。共計 60 例不可手術(shù)切除的惡性胸膜間皮瘤患者接受了 2 次 1×109CFU的 CRS-207 靜脈滴注并聯(lián)合化療。結(jié)果表明，35 例可評估的患者中，89% (31/35)患者的病情得到控制，1 例完全緩解(3%)，19 例部分緩解(54%)，10 例病情穩(wěn)定(29%)。證明 CRS-207 聯(lián)合化療可顯著改變局部腫瘤微環(huán)境，激活機(jī)體免疫細(xì)胞殺傷腫瘤(NCT01675765)[33]。

2.3 沙門氏菌

沙門氏菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陰性胞內(nèi)桿狀菌。沙門氏菌能夠在有氧條件下利用氧氣或者在無氧條件下利用其他電子受體或以發(fā)酵的方式產(chǎn)生腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine Triphosphate，ATP)，維持自身生理生長。沙門氏菌擁有諸多優(yōu)良特性，使其成為腫瘤治療中的模式微生物，包括依賴其鞭毛的自主運動能力、便于基因改造、天然的細(xì)菌毒力等[37]。

由于在臨床上使用沙門氏菌具有高感染風(fēng)險，所以如何平衡細(xì)菌過強(qiáng)的毒性和治療效力是研究者急需攻克的難題。目前研究者對沙門氏菌進(jìn)行了多方面的基因工程改造。已報道的改造主要集中于降低細(xì)菌天然毒力、提高細(xì)菌腫瘤定植能力和降低細(xì)菌逃逸免疫系統(tǒng)監(jiān)控的風(fēng)險等，如鼠傷寒沙門氏菌菌株 VNP20009[38]、A1-R[39]和ΔppGpp (SHJ2037)[40]等。

其中，VNP20009 是基于野生型鼠傷寒沙門氏菌 ATCC 14028 底盤，通過基因工程改造的方式敲除了msbb基因，使細(xì)菌喪失了將脂質(zhì)?；癁閮?nèi)毒素的能力，從而減少了內(nèi)毒素的產(chǎn)生，降低了細(xì)菌毒性。另外，通過敲除參與嘌呤代謝相關(guān)基因purI，使細(xì)菌的增殖只能依賴于外源性的腺嘌呤，避免了細(xì)菌逃逸風(fēng)險[20]。鼠傷寒沙門氏菌菌株 A1-R 是在結(jié)腸癌小鼠模型中篩選得到的亮氨酸和精氨酸缺陷株，其在實體瘤壞死區(qū)有較強(qiáng)的定植能力[41]，并對前列腺癌[42]、乳腺癌[43]和宮頸癌[44]等都有很好的療效。ΔppGpp(SHJ2037)是relA和spoT雙基因突變菌株，relA和spoT的缺失導(dǎo)致了細(xì)菌不能合成 ppGpp，從而喪失了細(xì)菌對哺乳動物細(xì)胞的侵襲能力。有文章報道 ΔppGpp (SHJ2037)在小鼠結(jié)腸癌模型中具有良好的靶向能力，并改造其表達(dá)細(xì)胞毒性蛋白(Cytolysin A)，在小鼠原位瘤模型和肺轉(zhuǎn)移瘤模型中表現(xiàn)出良好的治療效果[45]。

在上述菌株中，VNP20009 是首例推向腫瘤治療臨床測試的沙門氏菌菌株。據(jù)報道，VNP20009 在 1 期安全性臨床測試中，對 24 名轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者和 1 名轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌患者靜脈注射 106～109CFU/m2的 VNP20009；結(jié)果表明，患者的最大耐受劑量為 3×108CFU/m2，在接受 109CFU/m2的注射劑量后，患者出現(xiàn)嚴(yán)重的劑量限制毒性，表現(xiàn)為血小板減少、貧血、持續(xù)性菌血癥、高膽紅素血癥、腹瀉、嘔吐、惡心、堿性磷酸酶升高和低磷酸鹽血癥等。雖然 VNP20009 在臨床測試中表現(xiàn)出良好的腫瘤定植能力，但并沒有觀察到病灶減小。因此，VNP20009 由于在臨床實驗中不具備有效的腫瘤治療效果而止步于 1 期[46]。

2.4 益生菌——大腸桿菌 Nissle 1917

大腸桿菌菌株 Nissle 1917(Escherichia colistrain Nissle 1917，EcN)由外科醫(yī)生 Alfred Nissle于 1917 年在第一次世界大戰(zhàn)期間從一名德國士兵的糞便中分離出來。之后，Alfred Nissle 發(fā)現(xiàn)該菌株對不同致病性大腸桿菌具有強(qiáng)烈的拮抗活性[47]。

EcN 作為腸道益生菌具有許多優(yōu)良的特性，賦予了其應(yīng)用于腫瘤治療的良好前景。首先，EcN 具有生物安全性、對免疫系統(tǒng)敏感[48]，不產(chǎn)生任何與致病性大腸桿菌相關(guān)的腸毒素或細(xì)胞毒素[49]。同時，EcN 膜上的血清敏感性脂多糖可確保該菌株能快速地被機(jī)體清除，且對患者沒有嚴(yán)重的免疫毒性副作用[50]。而 EcN 作為兼性厭氧菌，同樣具備良好的實體瘤定植能力[6]。

近年來，越來越多的報道表明 EcN 能夠作為細(xì)菌藥劑治療腫瘤。例如，Zhang 等[51]報道了改造 EcN 組成型表達(dá)天青蛋白以抑制腫瘤的研究。在該研究中，患有原位 B16 黑色素瘤或 4T1 乳腺腫瘤的 BALB/c 小鼠以每只 2×107CFU 的劑量靜脈注射 EcN，天青蛋白的釋放和由此產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)有效地抑制了腫瘤的生長和肺轉(zhuǎn)移，并且細(xì)菌沒有表現(xiàn)出顯著的毒性。另外，He 等[52]通過氧氣依賴性啟動子控制 EcN 在實體瘤內(nèi)特異性表達(dá)血管生成抑制劑 Tum-5。結(jié)果表明，在靜脈注射的 14 天內(nèi)，表達(dá) Tum-5 的 EcN 能在攜帶B16 黑素瘤的 C57BL/6 小鼠中定植，并且腫瘤生長和血管生成被成功抑制。此外，該課題組還將能夠表達(dá)抗癌蛋白 p53 的治療模塊加入到表達(dá)Tum-5 的 EcN 中，賦予了 EcN 在小鼠原位肝癌腫瘤模型上更顯著的抑制作用[6]。

目前，EcN 在腫瘤治療臨床測試上走得最遠(yuǎn)的是美國 Synlogic 公司研發(fā)的 SYNB1891。SYNB1891 是以大腸桿菌 Nissle 1917 為細(xì)菌底盤，利用其在腫瘤內(nèi)的特異性定植能力，通過合成生物學(xué)改造，賦予 EcN 在瘤內(nèi)特異性表達(dá)STING 激動劑環(huán)二磷酸腺苷。STING 激動劑可以激活抗原呈遞細(xì)胞呈遞腫瘤抗原，從而激活抗腫瘤免疫反應(yīng)[53]。SYNB1891 對晚期轉(zhuǎn)移性實體瘤和淋巴瘤患者(NCT04167137)的 1 期臨床實驗表現(xiàn)出良好的安全性；同時，患者在接受SYNB1891 干預(yù)后，顯示出 STING 通路激活，以及相關(guān)干擾素刺激基因、趨化因子、細(xì)胞因子和 T 細(xì)胞應(yīng)答等上調(diào)；另外，2 名轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和轉(zhuǎn)移性小細(xì)胞肺癌治療的患者接受治療后，腫瘤也得到了持久穩(wěn)定的控制[54]。這一臨床測試結(jié)果證明了 SYNB1891 的安全性和腫瘤治療的有效性，同時也有望彌補(bǔ)免疫療法對大部分患者沒有良好響應(yīng)的缺陷。

2.5 卡介苗

卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)是由來自法國巴斯德研究所的 Charles Calmette 和Camille Guérin 根據(jù)減毒的牛型結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)懸液制成的活細(xì)菌制劑。他們通過將牛型結(jié)核分枝桿菌在含有膽汁的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)來實現(xiàn)分岐桿菌的減毒，并在傳代超過 1 000 次后獲得了供臨床使用的減毒菌株[55]。

起初，卡介苗的作用是為了治療哮喘性支氣管炎及預(yù)防結(jié)核病和結(jié)核性腦膜炎[56]，直到 1959 年，卡介苗首次用于癌癥免疫治療，并在治療及預(yù)防腫瘤中取得了很好的效果。1976年，卡介苗治療佐劑首次成功應(yīng)用于治療復(fù)發(fā)性淺表性膀胱癌，這是具有劃時代意義的研究成果[57]。隨后，卡介苗于 1990 年獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)用于臨床治療[41]。直至 40 年后的今天，卡介苗已成為復(fù)發(fā)性淺表性膀胱癌治療中最常用的佐劑。

雖然卡介苗治療腫瘤的機(jī)理尚無定論，但主流的觀點認(rèn)為卡介苗是通過激活局部和全身的免疫反應(yīng)來產(chǎn)生抗腫瘤效果[42]。研究表明，卡介苗通過灌注的方式進(jìn)入膀胱后，激活尿路上皮細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞，產(chǎn)生 IL-1β、IL-8、IL-15 和 IL-18 等細(xì)胞因子以及 CXC 趨化因子配體 10 (CXCChemokine Ligand 10，CXCL10)、GM-CSF等趨化因子，從而吸引中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD4＋T 細(xì)胞和 CD8＋T 細(xì)胞等免疫細(xì)胞的募集[43-44]，這些免疫細(xì)胞通過產(chǎn)生活性氧中間體或釋放促凋亡因子對腫瘤細(xì)胞具有直接殺傷作用[57]。同時也有研究表明，腫瘤浸潤性 CD4＋T 細(xì)胞數(shù)量的增加、CD4＋T 細(xì)胞與 CD8＋T 細(xì)胞比率的增加都和腫瘤的治療效果顯著相關(guān)[58]。

3 合成生物學(xué)推動腫瘤細(xì)菌療法的臨床開發(fā)

截至 2021 年，雖然已有多種細(xì)菌治療腫瘤的案例報道(表 1)，其中以卡介苗為代表的腫瘤細(xì)菌療法在治療和預(yù)防淺表性膀胱癌方面效果顯著、臨床安全，使其在諸多處于臨床前研究和臨床測試階段的活菌制劑中脫穎而出，成為腫瘤細(xì)菌療法的典范(圖 1)[55]。但就目前來說，腫瘤細(xì)菌療法在臨床開發(fā)中面臨著兩方面的關(guān)鍵挑戰(zhàn)：一是如何在保證活菌藥物生物安全性的前提下，提高細(xì)菌的腫瘤治療能力[59]。傳統(tǒng)的基因工程技術(shù)不能系統(tǒng)性地修飾細(xì)菌功能，從而不能很好地平衡細(xì)菌毒力和腫瘤治療效力之間的關(guān)系。例如，VNP20009 雖然降低了沙門氏菌天然毒力，避免了細(xì)菌毒副作用，但卻損失了細(xì)菌對腫瘤的抑制效果[46]。挑戰(zhàn)二是解析細(xì)菌治療腫瘤的現(xiàn)象背后潛藏的治療機(jī)理，活菌藥物是如何對腫瘤細(xì)胞起到殺傷作用的，至今仍是一個待解之迷。腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，活菌制劑的不可控性都給更深入的分子機(jī)理研究帶來嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

圖1 治療腫瘤細(xì)菌在臨床前和臨床試驗中的進(jìn)展情況Fig. 1 Progress in preclinical and clinical trials for the bacterial therapeutics

表1 腫瘤細(xì)菌療法在臨床測試中的范例Table 1 Examples of bacterial therapeutics in clinical trial

近年來，合成生物學(xué)作為一門以理性設(shè)計生物行為為目標(biāo)的學(xué)科快速發(fā)展，已成為更復(fù)雜、更精確地設(shè)計細(xì)菌行為的重要方法[60]。這種方法利用細(xì)菌作為模塊化的工程平臺，將基因和啟動子元件合理設(shè)計組合，創(chuàng)造出微妙而復(fù)雜的基因線路，從而能夠更精確地控制細(xì)菌的生理行為，加強(qiáng)對細(xì)菌的生物安全控制，調(diào)控細(xì)菌表達(dá)治療分子的釋放，增強(qiáng)細(xì)菌對疾病的治療能力等(圖 2)[61]。因此，合成生物學(xué)有望成為細(xì)菌療法臨床開發(fā)的助推劑，面對腫瘤細(xì)菌療法在臨床測試中面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，提高細(xì)菌制劑的研發(fā)質(zhì)量，強(qiáng)力推動腫瘤細(xì)菌療法走向臨床應(yīng)用。

圖2 合成生物學(xué)推動腫瘤細(xì)菌療法的臨床開發(fā)Fig. 2 Synthetic biology in promoting clinical advances of bacterial anti-cancer therapy

3.1 面向臨床的生物安全性

目前，通過基因工程改造能夠?qū)崿F(xiàn)對細(xì)菌減毒或構(gòu)建營養(yǎng)缺陷型菌株，從而限制細(xì)菌向正常組織器官擴(kuò)散。這一策略在臨床前藥理學(xué)和毒理學(xué)測試中均顯示出不錯的安全性[62-63]。然而，為了獲得更好的防治細(xì)菌逃逸效果，研究者并不僅僅滿足于此。根據(jù)實體瘤內(nèi)氧氣濃度比正常組織低的特性，Li 等[64]利用氧氣敏感啟動子元件設(shè)計了一套基于“自殺開關(guān)”的合成生物學(xué)基因線路，構(gòu)建了一株僅能在瘤內(nèi)定植的專性厭氧鼠傷寒沙門氏菌 YB1，由此規(guī)避細(xì)菌的逃逸風(fēng)險。他們首先利用厭氧啟動子 PpepT 驅(qū)動必需基因asd轉(zhuǎn)錄表達(dá)，再用需氧啟動子 PsodA 反向驅(qū)動asd的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而實現(xiàn) PsodA 對 PpepT 啟動子本底表達(dá)的抑制作用，確保一旦細(xì)菌逃脫瘤內(nèi)擴(kuò)散到正常組織，高氧氣的環(huán)境會誘導(dǎo) PsodA 抑制必需基因asd的表達(dá)，從而使細(xì)菌因不能合成細(xì)胞壁而“自殺”。實驗結(jié)果也表明，在乳腺癌裸鼠模型中，YB1 在瘤內(nèi)的定植數(shù)量要顯著高于正常組織器官內(nèi)的數(shù)量[64-65]。

此外，上述報道的活菌制劑 SYNB1891 不僅利用了厭氧啟動子 Pfnrs驅(qū)動 STING 激動劑環(huán)二磷酸腺苷基因dacA在瘤內(nèi)的特異表達(dá)，還敲除了細(xì)菌胸腺嘧啶核苷酸合成酶基因thyA和大腸桿菌合成細(xì)胞壁的關(guān)鍵基因dapA。相比于正常組織，實體瘤內(nèi)的胸腺嘧啶核苷酸合成酶的濃度比較豐富，這就使得細(xì)菌在缺失thyA基因的情況下僅能在瘤內(nèi)定植和復(fù)制；同時，細(xì)菌dapA基因的缺失使細(xì)菌喪失了合成細(xì)胞壁的能力，從而使細(xì)菌在進(jìn)入機(jī)體后，會逐漸被免疫細(xì)胞清除。這種對細(xì)菌關(guān)鍵基因的“雙敲除策略”更近一步提高了細(xì)菌的生物安全性，大大降低了安全風(fēng)險，也促使 SYNB1891 能夠在臨床安全風(fēng)險評估中取得成功[49]。

另一種通過合成生物學(xué)理念增強(qiáng)細(xì)菌療法臨床安全性的策略是由 Ho 等[66]開發(fā)的“合成生物學(xué)食用療法”。通過巧妙的設(shè)計重新編程EcN，使細(xì)菌能夠在腸道組成型表達(dá)組蛋白樣蛋白 A(Histone-like protein A，HlpA)。其中，組蛋白樣蛋白 A 能特異結(jié)合結(jié)直腸癌細(xì)胞上的硫酸乙酰肝素蛋白多糖(Heparan Sulfate Proteoglycan，HSPG)，同時 EcN 通過表達(dá)分泌黑芥子酶可以將患者食用的西蘭花中的天然成分硫代葡萄糖苷(Glucosinolates)轉(zhuǎn)化為抗癌小分子蘿卜硫素(Sulphoraphane)。在小鼠結(jié)直腸癌模型的研究顯示，該方法對鼠源和人源結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制率高達(dá) 95%。這種將可食用的西蘭花和“益生菌酸奶”的聯(lián)合療法實現(xiàn)了將日常食物轉(zhuǎn)化為癌癥預(yù)防及治療的藥物分子，進(jìn)一步確保了生物安全性。

3.2 提高腫瘤治療的有效性

細(xì)菌可以用于治療腫瘤的一個重要原因是其能夠作為免疫激活劑扭轉(zhuǎn)瘤內(nèi)的免疫抑制微環(huán)境。早在 150 年前，William B. Coley 研制的滅活細(xì)菌制劑——Coley’s Toxins 從某種程度上來講可能就是利用病原微生物進(jìn)入體內(nèi)后，打破體內(nèi)原本“沉寂”的免疫微環(huán)境，激活免疫細(xì)胞殺傷細(xì)菌的同時也消滅癌細(xì)胞，從而對惡性腫瘤達(dá)到“以毒攻毒”的治療效果。因此，研究者將Coley 稱為“癌癥免疫療法之父”[67]。

合成生物學(xué)“自下而上”的設(shè)計理念，給予科學(xué)家極大的便利，通過改造細(xì)菌作為遞送藥物的智能載體，實現(xiàn)藥物分子在瘤內(nèi)不同層次的遞送，從而達(dá)到調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)治療腫瘤的目的[3]。目前已經(jīng)報道的細(xì)菌可遞送藥物分子，包括溶血素 A(ClyA)、FAS 配體(FASL)、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)等細(xì)胞毒性分子，IL-2、IL-18、CCL21 等細(xì)胞因子，以及 p53 等調(diào)控因子等[61]。其中，Zheng 等[68]基于鼠傷寒沙門氏菌 ΔppGpp 開發(fā)的一種組成型“智能”載藥平臺，能夠使其表達(dá)及分泌創(chuàng)傷弧菌(Vibrio Vulnificus)鞭毛蛋白 FlaB，通過 FlaB 協(xié)同活化TLR5 和 TLR4 信號通路，提高腫瘤抑制因子的分泌，顯著增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷作用。另外，為了改善細(xì)菌本身治療腫瘤效果不佳的問題，本文作者團(tuán)隊[69]提供了一種細(xì)菌與光熱納米顆粒的聯(lián)合治療策略。通過將光熱納米顆粒 INPs 偶聯(lián)在減毒鼠傷寒沙門氏菌菌株 YB1上，開發(fā)出能夠感應(yīng)外界紅外光強(qiáng)的“合成溶瘤菌”。相比于未結(jié)合納米顆粒的對照菌株，細(xì)菌在瘤內(nèi)的定植數(shù)量提高了 14 倍。同時，這種聯(lián)合療法不僅能夠?qū)?xì)菌和腫瘤進(jìn)行示蹤和成像，還能有效提高對較大膀胱癌實體瘤(＞500 mm3)的治療效果。提高工程細(xì)菌在瘤內(nèi)的群體定植能力是實現(xiàn)腫瘤治療的關(guān)鍵步驟，但目前關(guān)于工程細(xì)菌定植能力的理性設(shè)計尚缺乏理論指導(dǎo)?；诤铣缮飳W(xué)造物致知的理念，本文作者團(tuán)隊[70]以大腸桿菌 MG1655 為模式生物，系統(tǒng)研究了細(xì)菌空間定植的進(jìn)化穩(wěn)定性策略，發(fā)現(xiàn)種群在不同大小生境的定植，都對應(yīng)著一個最優(yōu)的遷徙和生長策略，這為未來理性設(shè)計工程細(xì)菌瘤內(nèi)空間定植提供了重要的科學(xué)依據(jù)和基礎(chǔ)的理論指導(dǎo)。邏輯門控系統(tǒng)是合成生物學(xué)最具標(biāo)志性的基因線路之一。邏輯門控系統(tǒng)有助于改造細(xì)菌實現(xiàn)其對兩個或多個輸入腫瘤相關(guān)信號的整合，以便特異表達(dá)具有治療效果的功能性基因的輸出，實現(xiàn)其在腫瘤診斷、預(yù)防和治療方面的高度選擇性應(yīng)用場景[71]。Anderson 等[72]基于邏輯門控系統(tǒng)成功將大腸桿菌改造成具有腫瘤侵襲能力的合成工程菌。該系統(tǒng)應(yīng)用雙輸入邏輯與門基因線路，設(shè)計大腸桿菌只有在感知到腫瘤內(nèi)低氧氣濃度和自身群體密度后，才會特異性輸出表達(dá)來自假結(jié)核耶爾森菌(Yersinia pseudotuburculosis)的侵染素編碼基因inv，使細(xì)菌能夠侵入包括 HeLa、HepG2 和U2OS 等癌細(xì)胞系。這篇具有里程碑意義的文章開創(chuàng)了合成生物學(xué)優(yōu)化腫瘤細(xì)菌療法的先河，為細(xì)菌療法的優(yōu)化帶來了更多可能。

另外，為了獲得更好的腫瘤治療效果，可能還需要進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)菌搭載藥物分子可控釋放能力。通過合成生物學(xué)手段構(gòu)建的群體感應(yīng)基因線路能夠感知環(huán)境因素的變化，完成藥物分子表達(dá)釋放的智能切換，這套對基因表達(dá)智能精確的時空控制，有助于實現(xiàn)可控化的藥物管理策略，增強(qiáng)抗腫瘤效果[73]。根據(jù)上述理念，Din 等[74]和Danino 等[75]構(gòu)建了一套基于細(xì)菌載體表達(dá)抗腫瘤藥物的同步化合成和裂解釋放系統(tǒng)。這套系統(tǒng)不僅能夠維持細(xì)菌在實體瘤內(nèi)的定植數(shù)量，降低生物安全風(fēng)險，還能在細(xì)菌數(shù)量增多后，完成細(xì)菌菌體的裂解和抗腫瘤藥物的釋放。小鼠實驗顯示，將具有群體感應(yīng)系統(tǒng)的沙門氏菌與化療藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)聯(lián)用，可以使小鼠的平均生存時間增加約 50%，療效提高正是得益于系統(tǒng)藥物釋放的同步周期性和穩(wěn)定性[74]。

應(yīng)用同樣的思路，該課題組通過改造一株非致病性大腸桿菌，在腫瘤微環(huán)境中特異性裂解并釋放 CD47 納米抗體拮抗劑達(dá)到治療黑色素瘤的目的。CD47 是一種抗吞噬細(xì)胞受體，通常在幾種人類癌癥組織中過表達(dá)。研究表明，通過群體感應(yīng)裂解系統(tǒng)表達(dá) CD47 納米體拮抗劑可增加腫瘤浸潤 T 細(xì)胞的激活數(shù)量，刺激腫瘤抗原特異性免疫反應(yīng)，從而刺激腫瘤快速消退[76]。另外，該課題組還將群體感應(yīng)裂解釋放系統(tǒng)與免疫檢查點抑制劑療法聯(lián)用，通過設(shè)計 EcN 在瘤內(nèi)特異性周期化裂解表達(dá) PD-L1 和 CTLA-4 拮抗劑，激活增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，并在 B 細(xì)胞淋巴瘤小鼠模型上將腫瘤的抑制效果維持在 15天以上[77]。

4 總結(jié)與展望

雖然目前已有多種細(xì)菌制劑在動物模型中被證明具有治療癌癥的潛力，如梭狀芽胞桿菌等專性厭氧菌，或者如沙門氏菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌和大腸桿菌等兼性厭氧菌，但是這些菌株都還處于臨床前或臨床實驗階段，并沒有達(dá)到預(yù)期的人體臨床試驗效果。究其原因，主要是由于活細(xì)菌制劑在臨床評估中仍有一些挑戰(zhàn)需要克服：

(1)如何確保細(xì)菌治療腫瘤的安全性。將病原菌用于腫瘤治療，可能會引起全身毒性副作用。確保細(xì)菌在瘤內(nèi)特異性定植的前提下，降低細(xì)菌逃逸風(fēng)險，是研究者在研發(fā)溶瘤細(xì)菌藥物時需要優(yōu)先考慮的問題。一種新的“合成生物學(xué)防護(hù)策略”是構(gòu)建非天然氨基酸代謝依賴型菌株，使細(xì)菌無法在代謝途徑上繞過生物防護(hù)機(jī)制[78]。雖然基因改造可能限制了細(xì)菌的致病性，但并不能保證基因改造模塊的穩(wěn)定性和基因線路的遺傳穩(wěn)定性。因此，在早期臨床試驗中，不僅要確保細(xì)菌對臨床患者的生物安全性，也要確保細(xì)菌不會感染傳播到密切接觸者。故需要設(shè)置嚴(yán)格詳密的監(jiān)管框架和防護(hù)體系來規(guī)避上述風(fēng)險，如樣品采集程序、科學(xué)監(jiān)測方法、應(yīng)急處理方式等[79]。對此，F(xiàn)DA 也于 2018 年發(fā)布了一份行業(yè)指南，旨在解決這些問題，以幫助研發(fā)者和實驗人員設(shè)計合理的研究策略[80]。另外，也需要特別考慮前期接受過常規(guī)放療或化療無效的癌癥患者，這類免疫系統(tǒng)受損的患者若暴露于細(xì)菌感染，可能會導(dǎo)致巨大的風(fēng)險，對生命安全造成不可控的結(jié)果。

(2)如何針對不同患者確定“個性化診療標(biāo)準(zhǔn)”。由于不同患者的年齡、身體素質(zhì)、罹患癌癥類型都不相同，如何確立溶瘤細(xì)菌藥物的用藥劑量、用藥周期、給藥后輔助藥劑的選用等，都需要經(jīng)過謹(jǐn)慎的求證和測試。特別是在患者腫瘤消退后，如何使用合適的方法來清除體內(nèi)的細(xì)菌?？股乜梢宰鳛橐环N行之有效的策略，然而，治療后使用抗生素必須謹(jǐn)慎，因為過度使用抗生素會導(dǎo)致許多細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致出現(xiàn)新的安全風(fēng)險[81]。

(3)如何確定合理的給藥方式。給藥方式的不同也會造成患者機(jī)體免疫響應(yīng)的差異和副作用水平的不同，靜脈滴注的方式雖然可以確保細(xì)菌制劑快速達(dá)到并定植于腫瘤部位，但也會對患者機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p害，引起敗血癥，危及生命。目前，活細(xì)菌制劑在臨床上的常用給藥方式主要包括口服給藥和局部給藥等，如益生菌產(chǎn)品由于不存在細(xì)菌毒性，一般是選擇口服給藥的方式；但大多數(shù)活細(xì)菌腫瘤治療制劑由于天然毒性的原因，臨床研究者還是會優(yōu)先采取局部給藥，包括瘤內(nèi)注射、瘤旁注射或如 BCG 一樣采取膀胱灌注的給藥方式[51]。

綜上考慮，從活細(xì)菌腫瘤治療制劑的研發(fā)到臨床前和臨床試驗的成功仍然是一段充滿嚴(yán)峻考驗的漫漫長路，還需研究者通過設(shè)計更嚴(yán)格、更合理、更科學(xué)的臨床前基礎(chǔ)研究來逐漸縮短這段距離。而隨著合成生物學(xué)和腫瘤免疫學(xué)相關(guān)研究的不斷發(fā)展成熟，以及現(xiàn)代生物技術(shù)的日益完善，腫瘤細(xì)菌療法在未來必將取得重要突破，給癌癥患者帶來更多康復(fù)的希望，造福社會，造福于民！