金 帆 高艷梅 黃亞佳 蒲 璐 夏 霖*

1(中國科學院深圳先進技術研究院 合成生物學研究所 深圳 518055)

2(中國科學技術大學 合肥微尺度物質科學國家研究中心 合肥 230026)

1 引 言

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一種普遍存在的革蘭氏陰性菌，是一種獲得性的條件致病菌，廣泛存在于環(huán)境中，可以從人體皮膚、醫(yī)療器械、空氣、水和食物中獲得。銅綠假單胞菌對維持生存的營養(yǎng)需求很低，可以在多種環(huán)境中生存，這種強的環(huán)境適應力和生存能力幫助其在醫(yī)院等干燥、無生命的表面環(huán)境中存活 6 小時至 6 個月[1]。銅綠假單胞菌幾乎可以感染人體的任何部位和器官，嚴重的急性或慢性感染將導致機體死亡[2]。停留在醫(yī)療器械和設備表面的銅綠假單胞菌，給需要使用插管、呼吸機等侵入性醫(yī)療器械的患者或皮膚燒傷患者帶來重大的安全隱患。

銅綠假單胞菌很容易生成生物被膜從而幫助其在各種環(huán)境中定植[3]。生物被膜的生成使得細菌以群體的形式生活在胞外聚合物(Exopoly Saccharides，EPS)包裹的基質中，EPS 是由多糖、脂質、核酸和蛋白質組成的復合物。生物被膜可作為細菌群落與外部環(huán)境之間的屏障，阻礙宿主免疫細胞的吞噬作用以及抗生素等抗菌劑到達細菌從而提高單個細菌應對藥物和不利環(huán)境時的生存力，增大了銅綠假單胞菌感染患者體內病原菌的清除難度，甚至直接導致一些患者體內的病原菌無法被完全清除[4-6]。目前針對銅綠假單胞菌感染，臨床使用較多的仍是抗生素藥物。伴隨抗生素的過度使用，銅綠假單胞菌的耐藥性問題不斷加重，導致抗生素療效變差甚至完全失效。

根據(jù)發(fā)病率、病死率、疾病的長期性、預防和治療的現(xiàn)有選擇、保健利用、社會影響等參數(shù)，銅綠假單胞菌已被列為監(jiān)測和流行病學研究的最高優(yōu)先事項。2017 年，世界衛(wèi)生組織更是將銅綠假單胞菌列為迫切需要開發(fā)新抗菌藥物治療的細菌之一[7]。銅綠假單胞菌感染的治療和預防一直都是研究者們比較關心的問題，近年來也在不斷報道相應的治療藥物和方法。本文主要總結目前用于銅綠假單胞菌感染治療的藥物和方式，以及未來可能的新藥物和新方式。

2 抗菌藥物

2.1 抗生素

對感染銅綠假單胞菌的患者來說，多重耐藥的銅綠假單胞菌的出現(xiàn)往往意味著治療周期的延長和費用的增加，嚴重時甚至會導致患者死亡。對囊性纖維化(Cystic Fibrosis，CF)患者來說，這一問題尤其嚴重。CF 是一種由囊性纖維化跨膜調節(jié)因子(Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator，CFTR)的氯離子通道 19 編碼基因突變引起的隱性遺傳病。由于 CFTR 蛋白通道分布廣泛，所以 CF 影響多個器官，包括肺、胃腸道、肝臟、男性生殖道和胰腺等。CF 患者的主要并發(fā)癥之一是呼吸道的慢性感染，此并發(fā)癥主要由銅綠假單胞菌感染引起。對于呼吸道慢性感染銅綠假單胞菌的 CF 患者，機體內部的炎癥反應配合外部抗生素的強化治療仍無法根除呼吸道感染的銅綠假單胞菌，進而導致感染嚴重的患者需要進行肺移植手術甚至死亡[8]。

伴隨著治療過程中抗生素的頻繁使用，銅綠假單胞菌超強的耐藥性問題不容忽視。銅綠假單胞菌對抗生素的耐藥性增強主要有以下原因：(1)銅綠假單胞菌本質耐藥性和超強的耐藥性產生能力：銅綠假單胞菌具有低滲透壓的外膜以及12 個 RND (Resistance-Nodulation-Cell Division)家族外排泵，導致自身對很多抗生素敏感性低。而通過膜孔道蛋白低表達或丟失、產生修飾酶或滅活酶、改變藥物作用靶點等方式，銅綠假單胞菌可對不同的抗生素產生耐藥性。同時，通過轉化、轉導和接合將質粒、其他菌株的抗性基因轉移到銅綠假單胞菌基因組中，同樣增強了銅綠假單胞菌對不同抗生素的耐藥性[9-11]。(2)暴露在抗生素亞抑制濃度：受生物被膜、細菌與細菌之間隔離等因素影響，臨床使用的抗生素不能到達細菌或者在細菌周圍達到足夠的抑制濃度，使得暴露在亞抑制濃度的銅綠假單胞菌更容易產生耐藥性[12]。(3)銅綠假單胞菌感染時細菌狀態(tài)和感染部位營養(yǎng)成分：如感染后細菌是否生成生物被膜、生物被膜組成、細菌周圍金屬陽離子濃度、聚胺類化合物等誘因均會不同程度地導致銅綠假單胞菌對抗生素的最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)值改變，幫助細菌逃脫機體免疫和抗菌藥物的殺傷。上述因素均不同程度地增強了銅綠假單胞菌的耐藥性，進而導致使用常規(guī)的抗生素治療銅綠假單胞菌感染越來越難[9,13]。

隨著對銅綠假單胞菌對抗生素耐藥性產生機理研究的不斷深入，相應耐藥性抑制劑不斷研制出來。比如，包括銅綠假單胞菌在內的革蘭氏陰性菌對 β-內酰胺類抗生素產生耐藥性的主要機制是細菌可以產生各種 β-內酰胺酶。針對這一耐藥機制，研究者們發(fā)現(xiàn) β-內酰胺酶抑制劑可以抑制大部分細菌產生的 β-內酰胺酶，將其與 β-內酰胺類抗生素聯(lián)合使用時，可以保護抗生素不被水解，在提高 β-內酰胺類抗生素抗菌活性的同時降低了細菌對 β-內酰胺類抗生素的耐藥性。近年來，使用他唑巴坦作為著名的 β-內酰胺酶抑制劑和頭孢菌素組合形成的廣譜復合制劑(C/T)來治療腹腔感染、尿路感染以及肺炎的研究屢見報道[14-16]。另外，亞胺培南/瑞來巴坦、頭孢他啶/阿維巴坦等復合劑均對多重耐藥的銅綠假單胞菌具有很好的殺菌作用。

隨著研究者和醫(yī)院工作者對新抗生素的探索和研究的不斷深入，近年來已有一些新發(fā)現(xiàn)，其中具有高效清除能力和低耐藥性的抗生素頭孢地爾、多尼培南、普拉米星(Plazomicin)、POL7001、磷霉素等已用于臨床[10]。雖然抗生素在處理各類細菌感染中效果顯著，但抗生素的濫用和不當使用很可能引發(fā)藥物副作用和多耐藥菌的產生，而新抗生素的開發(fā)不僅費時，且其開發(fā)潛力也非常有限，故尋找新的抗菌藥物或新的抗菌療法，來代替抗生素或減少抗生素的使用十分必要。

2.2 有機酸

弱有機酸比強無機酸更易穿過細胞膜，因此弱有機酸具有良好的抗菌效果。目前弱有機酸已經在食品工業(yè)中被廣泛用作防腐劑，同時也一直被小規(guī)模地用于治療(如燒傷、糖尿病潰瘍和術后傷口的感染)。局部使用硼酸、抗壞血酸、檸檬酸、水楊酸和醋酸等有機酸來消除銅綠假單胞菌的皮膚和軟組織感染以及燒傷感染的工作都有報道[17-22]。例如：早在 1987 年，Kujath 和Hügelsch?ffer[23]就使用 3% 的硼酸治療 30 例局部銅綠假單胞菌傷口感染的患者，平均不到 6 天就取得了良好的效果，且未觀察到任何毒副作用，而使用抗生素治療的效果甚微。2018 年，Youn等[24]研究發(fā)現(xiàn)，4% 硼酸溶液和乙酸的 1∶1 混合液對喹諾酮類抗生素耐藥的銅綠假單胞菌的生物被膜具有較強的抑制作用。1998 年，Nagoba等[25]用 3% 的檸檬酸治愈了一例傷口感染銅綠假單胞菌且已對所有抗生素產生耐藥性的嚴重電灼傷患者。1993 年，Sloss 等[26]用濃度為 0.5%～5%的醋酸，在兩周內成功治愈了 14 位患者。2008年，Nagoba 等[27]用 3% 的乙酸成功治愈了 7 位傷口感染銅綠假單胞菌的患者，且從這些患者傷口分離出的細菌對 4 種或 4 種以上的抗生素均具有耐藥性，但這些耐藥菌均可被 3% 的乙酸抑制。2015 年，Kumara 等[28]探究了醋酸、抗壞血酸、硼酸三種酸對從傷口分離出的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌的抑菌情況，結果發(fā)現(xiàn)，在處理 30 min 時濃度為 0.5%、0.75% 和1% 的抗壞血酸抑菌率分別為 93.7%、97.9% 和100%；而濃度為 0.5%、0.75 % 和 1% 的硼酸沒有抑菌效果；濃度為 0.5% 的醋酸可以完全抑制銅綠假單胞菌。

目前有機酸僅是小規(guī)模的研究和使用，并且不同文獻存在使用差異，因此其臨床最有效的使用濃度仍無法確定。在一些臨床治療中，有的患者會出現(xiàn)過敏和強烈刺痛感而不得不停止使用有機酸治療。但是在面對耐多藥的銅綠假單胞菌時，單獨使用廉價的有機酸或聯(lián)合抗生素來治療患者也是一種不錯的選擇。

2.3 抗菌肽

天然的抗菌肽是一類所有生命體抵抗細菌、真菌和病毒入侵中不可缺少的一部分，因此抗菌肽也叫宿主防御肽。大多數(shù)的抗菌肽具有正電性、高度兩親性以及廣譜的抗菌性，還有一些多肽具有良好的抗生物被膜作用[29-31]。相比于傳統(tǒng)抗生素的作用機制，大多數(shù)抗菌肽通過改變細菌膜的通透性直接作用于細菌，而另一些需要進入細菌從而與細菌體內組分結合發(fā)揮作用[32]。根據(jù)抗菌肽數(shù)據(jù)(http://aps.unmc.edu/AP)可知，目前發(fā)現(xiàn)的抗菌肽已經達到 3 000 多種。不同的序列、長度和結構豐富了抗菌肽的種類和作用機制[33]。

2.3.1 抗菌肽殺死銅綠假單胞菌

隨著銅綠假單胞菌對多種抗生素的耐藥性增強以及開發(fā)新抗生素難度的增大，使用抗菌肽替代傳統(tǒng)的抗生素或者抗菌肽-抗生素聯(lián)用，減少抗生素的使用來解決銅綠假單胞菌耐藥性的研究不斷被報道。

黏菌素作為最典型的天然抗菌肽是目前臨床治療重癥銅綠假單胞菌感染的重要藥物之一[34-35]。黏菌素幾乎可以殺死所有的革蘭氏陰性菌，且病原菌對黏菌素的耐藥性較低。自 2002 年第一個從臨床上分離出來的對黏菌素產生耐藥性的銅綠假單胞菌被報道以來，此種銅綠假單胞菌仍然比較少見[36]。黏菌素自身已具有很強的抑菌效果，而與亞胺培南、哌拉西林、氨曲南、頭孢他啶等抗生素聯(lián)合使用后治療效果更佳[1]。

Mahdi 等[37]從唾液乳酸桿菌中分離出唾液霉素 LHM，其熱穩(wěn)定性好、適應的 pH 值范圍廣且不含脂質和碳水化合物，是一種有良好抗菌潛力的 II 型細菌素，也在體內外實驗中被證明可以預防和治療銅綠假單胞菌尿道感染。

雖然天然抗菌肽具有良好的抗菌效果和水溶性、以及低的耐藥性產生頻率等特性，但由于一些天然抗菌肽對細胞的選擇性較低，它們對很多真核細胞也有毒性。同時，天然抗菌肽的合成成本較高，其活性受到體內生理條件的顯著影響，包括二價陽離子和聚陰離子的強烈拮抗作用，許多天然抗菌肽很容易被細菌或者宿主的蛋白酶降解。因此，很多天然抗菌肽在體內實驗中的作用遠遠不及體外實驗，使其在臨床應用中受到相當大的限制[38]。

為解決天然抗菌肽的毒性、易降解以及穩(wěn)定性問題，目前已有研究者基于研究天然抗菌肽電荷數(shù)、結構、作用機制等理性設計，合成了很多新的多肽類似物，以提高抗菌多肽的穩(wěn)定性和抗菌性，并減少其細胞毒性[39-40]。Kim 等[41]通過將噬菌體中一種能夠特異性結合銅綠假單胞菌 OprF 孔蛋白的靶向肽 PA2 添加到 GNU7 上得到一種融合肽 PA2-GNU7。融合肽通過特異性地識別銅綠假單胞菌 OprF 孔蛋白發(fā)揮對銅綠假單胞菌的靶向抗菌作用，并且?guī)缀鯖]有細胞毒性。Zhong 等[42]探究了幾種合成的抗菌肽對臨床分離的 20 種多重耐藥的銅綠假單胞菌的抑菌效果，結果發(fā)現(xiàn) IK8L 可以通過膜裂解導致銅綠假單胞菌死亡。對比臨床使用的抗生素，IK8L 具有低誘導耐藥性，并通過老鼠燒傷傷口模型證明IK8L 在發(fā)揮抗菌作用的同時產生的毒性甚微。Mwangi 等[43]通過氨基酸替換的方法構建并篩選出一系列基于 Cathelicidin-BF-15 的抗菌肽，發(fā)現(xiàn)其中一種由二硫鍵穩(wěn)定的環(huán)肽 ZY4 在體內具有高穩(wěn)定性(半衰期為 1.8 h)，且對多重耐藥的銅綠假單胞菌具有良好的清除作用。通過老鼠敗血癥感染模型也證明 ZY4 具有良好的抑菌能力，其不僅可以抑制銅綠假單胞菌肺部感染，還可以抑制該菌向靶器官傳播。

2.3.2 抗菌肽清除銅綠假單胞生物被膜

銅綠假單胞菌在感染部位生成的生物被膜往往很難被完全清除——生物被膜不僅會提高單個細菌在環(huán)境中的生命力，而且會增強暴露在藥物下細菌的耐藥性。隨著天然抗菌肽的不斷出現(xiàn)以及合成抗菌肽的不斷發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)許多天然和合成的抗菌肽具有良好的消除銅綠假單胞菌生物被膜的能力[30-31,44-45]。

Yasir 等[46]將銅綠假單胞菌連續(xù) 30 天暴露在抗菌肽 Mel4 和環(huán)丙沙星中來誘導其耐藥性的產生，最后發(fā)現(xiàn) 30 天后銅綠假單胞菌對環(huán)丙沙星耐藥性增強了 64 倍而對抗菌肽未增加。環(huán)丙沙星在 4 倍 MIC 下不能抑制耐藥細胞生物被膜的形成，而抗菌肽在 1 倍的 MIC 下即可清除 75%的生物被膜。因此，抗菌肽 Mel4 相比環(huán)丙沙星抗生素具有弱的耐藥性誘導力，可以單獨或和環(huán)丙沙星聯(lián)用來幫助清除耐藥菌生物被膜。雖然人體防御多肽 LL-37 具有弱的抗菌性，但在低于其 MIC 濃度時，LL-37 可以通過減少細菌附著，刺激抽搐運動，并影響兩種主要的群體感應系統(tǒng)(Las 和 Rhl)，導致生物被膜發(fā)育所必需的基因下調，從而有效地抑制現(xiàn)存和早熟的銅綠假單胞菌生物被膜的生成[47]。Hirt 和 Gorr[45]通過向原有的抗菌肽 GL13NH2 中增加 3 個帶正電荷的賴氨酸得到了 GL13K，發(fā)現(xiàn)新的抗菌肽 GL13K 具有良好的銅綠假單胞菌生物被膜清除能力。2015 年，De La Fuente-Nú?ez 等[44]構建了 12 個氨基酸相關的 L-對映物、D-對映物以及反義的一類多肽衍生物，研究發(fā)現(xiàn) D-對映體的抗菌多肽具有更好的抗生物被膜效果。其中，DJK-5、DJK-6 的抗菌多肽具有更好的抗銅綠假單胞生物被膜和清除銅綠假單胞生物被膜的效果，且在蠟螟實驗模型中可以很好地預防銅綠假單胞菌感染[41]。

2.4 納米材料

早在幾個世紀前，銀、銅等金屬材質物品就已經被用作抗菌和抑菌材料。隨著科學技術的不斷發(fā)展，人們對這些金屬材質物品的抗菌原理逐漸清晰。通過對金屬及其氧化物的改造發(fā)現(xiàn)，相比于傳統(tǒng)的金屬材料，直徑小于 100 nm 的金屬離子及其氧化物納米粒子的比表面積更大，抗菌、抑菌活性更高，并且金屬納米粒子抗菌過程中不需要與細菌表面特定受體結合，因此使用金屬離子及其氧化物作為抗菌和抑菌材料時細菌難以產生耐藥性。目前，銀、銅、鐵、鋅、鎵等金屬離子及其氧化物均被證明具有較好的抑制銅綠假單胞生物被膜形成的能力[48-53]。

2014 年，Lee 等[52]對 36 種金屬離子的抗銅綠假單胞菌生物被膜及抗銅綠假單胞菌毒力因子的能力進行研究發(fā)現(xiàn)，Ag＋、Cd2＋、Co2＋、CrO4

2－、Fe2＋、Ga3＋、In3＋、Pt4＋、TeO32－和 Zn2＋可以抑制銅綠假單胞菌綠膿青素的產生；Ag＋、Cd2＋、Co2＋、CrO42－、Fe2＋、Ga3＋、Pt4＋、Sc3＋、TeO3

2－和 Zn2＋可以顯著抑制銅綠假單胞菌生物被膜的產生。隨后對 Zn2＋和 ZnO 納米顆粒的抑制性能進行探究發(fā)現(xiàn)，兩者可顯著抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成以及綠膿青素、群體響應、膿毒素和溶血活性的產生，但不會影響浮游銅綠假單胞菌的生長。2019 年，Liao 等[49]通過實驗探索發(fā)現(xiàn)，銀納米粒子對耐多藥的銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度值分別為1.406～5.625 μg/mL 和 2.813～5.625 μg/mL。通過蛋白質組學定量分析發(fā)現(xiàn)，銀納米粒子作用主要機制為氧化和抗氧化反應的不平衡導致細菌體內殘留過量無法消除的活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)。

金屬納米粒子對包括耐多藥的銅綠假單胞菌在內的革蘭氏陰性菌以及革蘭氏陽性菌均有良好的抑制作用，但是使用金屬納米粒子治療同樣會帶來不容忽視的副作用。例如：ZnONPs 的攝入會導致銅和鐵元素的攝入減少，而嚙齒動物缺乏鐵是文獻中最常報告的貧血原因；納米粒子引發(fā)的 ROS 和氧化應急會引起許多疾病的炎癥反應，如肺部疾病和肝變性[53]。

3 抗菌藥物載體

研究探索用于治療多重耐藥菌的新藥物無疑是解決抗生素耐藥性問題的最佳選擇。但無論是新的抗生素、抗菌肽、納米粒子還是一些蛋白酶，采用口服、注射等方式給藥時很容易在藥物還未到達治療部位時就被降解，或與周圍金屬離子、脂質、糖基發(fā)生拮抗作用，使其療效大打折扣甚至無法到達指定的治療部位。因此，將抗菌藥物負載在載體中，減少藥物的損失和提高藥物活性的研究也是十分的必要。

3.1 水凝膠載體

水凝膠是一種用物理或化學交聯(lián)的聚合物鏈組成網狀以包裹大量水的柔性三維多孔材料。水凝膠具有較高的比表面積、較好的結構可控性以及良好的生物相容性，一直以來都是最理想的生物材料。按照抗菌藥物來源，具有抗菌功能的水凝膠可分為兩大類：第一類本質抗菌的水凝膠，其主要是使用抗菌肽或者抗菌高分子聚合物自身直接形成的具有抗菌功能的水凝膠[54]；第二類抗菌藥物載體水凝膠即通過對自身沒有抗菌功能的水凝膠進行表面修飾或者內部負載抗菌藥物(無機金屬離子、無機金屬氧化物、納米粒子、抗生素和抗菌肽)而得到的具有抗菌功能的水凝膠。使用水凝膠作為藥物載體負載藥物治療時不僅能提高抗菌藥物的抗菌活性、延長抗菌藥物的活性時間，而且能減少病原菌對抗菌藥物抗性的產生[55-58]。本小節(jié)主要列舉近年水凝膠作為藥物載體用于抗銅綠假單胞菌的相關研究。

護理人員應對職業(yè)性腰背痛防護知識有足夠的認識，才能在保證自身安全的基礎上有能力護理好患者，使護理質量無縫銜接，確?；颊甙踩?。因此，護士職業(yè)性腰背痛問題應引起醫(yī)療衛(wèi)生管理部門和醫(yī)院管理層的足夠重視，在現(xiàn)階段需采取多種方式加強護士的繼續(xù)教育并且作為一種基本培訓項目，提高護士的認知水平，及早進行教育與培訓，預防職業(yè)性腰背痛的發(fā)生。合適而人性化的教育與培訓對提高護士職業(yè)性腰背痛認知水平繼而提高護理質量可以起到事半功倍的效果。

1998 年，DiTizio 等[59]研究了一種以由聚(乙二醇)-明膠水凝膠為基底負載環(huán)丙沙星的脂質體水凝膠。負載環(huán)丙沙星的水凝膠不僅可以在 7 天內均有環(huán)丙沙星釋放，而且在 7 天的體外黏附實驗中也證明了黏附在硅導管表面的銅綠假單胞菌完全被抑制。Al-Bakri 和 Mahmoud[60]將可以光誘導抗銅綠假單胞菌及其生物被膜的 DSPEAuNPs 負載在泊咯沙姆 407 水凝膠中，得到可以光控抗菌和抗生物被膜的水凝膠。如圖 1 所示，Bodenberger 等[61]利用幾種病原菌在生物被膜生成過程中可以與凝集素 B 特異性結合這一特征，在中間層加了抗菌肽的水凝膠表面修飾了凝集素 B。最終修飾后的水凝膠可以通過表面修飾的凝集素捕捉銅綠假單胞菌，并利用中間層抗菌肽將其殺死。Tao 等[62]通過反復凍融的方法將絲膠(Silk Sericin，SS)與聚乙烯醇(Poly(Vinyl Alcohol)，PVA)反復凍融，制備了絲膠/聚乙烯醇(SS/PVA)水凝膠。實驗表明，混合后的 SS/PVA 水凝膠具有負載和釋放小分子藥物及銀納米粒子的能力。細菌抑制實驗和傷口感染模型表明，負載慶大霉素的 SS/PVA 水凝膠能有效抑制銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長。

圖1 凝集素修飾的復合水凝膠用來捕獲和殺死耐碳青霉烯的銅綠假單胞菌示意圖[61]Fig. 1 Lectin-functionalized composite hydrogels for “capture-and-killing” of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa[61]

3.2 細菌載體

隨著合成生物學的不斷發(fā)展，目前已經可以通過人工設計構建出多種功能的工程菌。利用細菌作為抗菌藥物的生產母體和載體來治療病原菌(銅綠假單胞菌、霍亂、沙門氏菌)感染的相關研究相繼被報道[63-68]。利用細菌作為抗菌藥物的生產母體和載體來治療病原菌具有其他藥物載體無法比擬的優(yōu)點：(1)利用細菌來表達抗菌藥物可以防止藥物在血流中或在上消化道的運輸過程中迅速降解；(2)細菌可以將治療藥物運送到體內細菌可生存但口服或腸外藥物難以到達的部位，如結腸或腫瘤中心；(3)利用細菌來生產抗菌藥物的成本低；(4)工程菌表達藥物都是誘導性，因此可避免在非治療情況下抗菌藥物泄漏導致的耐藥性問題，大大降低了病原菌對抗菌藥物產生耐藥性的概率。本小節(jié)主要列舉利用合成生物學手段構建工程菌抗銅綠假單胞菌的相關研究。

2011 年，Saeidi 等[63]將銅綠假單胞菌群體響應 LuxR/LasR 系統(tǒng)、綠膿桿菌素 S5 以及 E7裂菌蛋白導入大腸桿菌 TOP10 中，如圖 2(a)所示，工程菌響應銅綠假單胞菌群體響應小分子后開啟綠膿桿菌素 S5 和 E7 裂解蛋白的表達，當細菌體內 E7 裂解蛋白達到一定濃度后可將工程菌裂解，同時釋放抗菌蛋白。最終證明工程菌可以殺死近 99% 的銅綠假單胞菌，且對生物被膜的抑菌效率達到 90%。2017 年，Hwang 等[65]從三方面對 Saeidi 等[63]的系統(tǒng)進行改進，如圖 2(b)所示：(1)將原本的載體菌株由大腸桿菌 TOP10換成了益生菌 Nissle；(2)在原有的響應裂解抗菌的系統(tǒng)中增加了抗生物被膜的酶 dspB，以進一步促進成熟的生物被膜瓦解，增強抗菌和抗生物被膜效果；(3)構建宿主載體互補系統(tǒng)。這些改進既保證了質粒在菌種中的穩(wěn)定性，又防止了菌種通過基因水平轉移功能從帶有抗性的質粒上獲得抗性基因，并且在線蟲和老鼠腸道感染模型中，均證明了改進版的工程菌不僅可以消除銅綠假單胞菌感染，還可以預防銅綠假單胞菌感染。

圖2 (a) Saeidi 等[63]構建的工程菌基因回路和抗菌作用示意圖；(b) Hwang 等[65]構建的工程菌基因回路示意圖Fig. 2 (a) Schematic of engineered bacteria gene circuit and antibacterial eあect of Saeidi et al.[63]; (b) Schematic of engineered bacteria gene circuit and antibacterial eあect of Hwang et al.[65]

雖然工程菌表達綠膿桿菌素抑制銅綠假單胞菌生長具有很高的特異性，但是大多數(shù)銅綠假單胞菌自身都會表達綠膿桿菌素及其免疫蛋白。工程菌表達的綠膿桿菌素只能作用于不表達綠膿桿菌素免疫蛋白且細胞膜上含有綠膿桿菌素特異性受體的銅綠假單胞菌，最終導致工程菌作用范圍很窄。2013 年，Gupta 等[64]通過將綠膿桿菌素 S3 的受體和轉位結構域與大腸桿菌素 E3 蛋白的核酸和免疫結構域相融合得到新的抗菌蛋白CoPy，如圖 3 所示。融合后的 CoPy 蛋白可以特異性地作用于任何細胞膜上含有綠膿桿菌素 S3受體的銅綠假單胞菌，較綠膿桿菌素 S3 可作用的菌株范圍更廣。同時通過將 CoPy 與鞭毛分泌標簽 FlgM 融合表達，抗菌蛋白在工程菌不裂解的情況下經鞭毛分泌系統(tǒng)排出，解決了前面回路中工程菌裂解后內毒素的副作用。

圖3 Gupta 等[64]構建工程菌基因回路和抗菌作用示意圖Fig. 3 Schematic of engineered bacteria gene circuit and antibacterial eあect of Gupta et al.[64]

銅綠假單胞菌感染后，生成的生物被膜不僅增強了細菌生命力，而且會影響治療時藥物的滲透，使得治療效果大打折扣。因此，構建工程菌來響應尋找銅綠假單胞菌以及清除銅綠假單胞生物被膜顯得尤為重要。如圖 4 所示，2014 年，Hwang 等[69]構建的工程菌可以在響應銅綠假單胞菌群體感知小分子后游向銅綠假單胞菌，然后通過分泌的 DNase I 來消散生物被膜，并利用分泌的抗菌肽 MccS 來殺死周圍的銅綠假單胞菌。

圖4 Hwang 等[69]構建工程菌基因回路和抗菌作用示意圖Fig. 4 Schematic of engineered bacteria gene circuit and antibacterial eあect of Hwang et al.[69]

4 噬菌體療法

噬菌體是具有感染能力并在許多情況下可殺死細菌的一種細菌病毒。與大多數(shù)病毒一樣，噬菌體通過與細菌表面特定受體結合后將遺傳物質注入細菌體內，并在細菌體內進行復制。當子代噬菌體濃度達到一定值后噬菌體通過裂解宿主細菌來終止復制和釋放子代到環(huán)境中，開啟新一輪的感染[70]。在抗生素未普及之前，噬菌體被用作抗菌劑廣泛使用，但隨著越來越多的抗生素種類被發(fā)現(xiàn)和普及，噬菌體療法逐漸被淡忘。隨著抗生素耐藥性問題的不斷嚴峻，利用噬菌體來治療多重耐藥的病原菌又重新被重視起來[70-75]。

4.1 噬菌體抗銅綠假單胞菌實驗研究

2016 年，Chan 等[78]分離出一種新的銅綠假單胞菌噬菌體 OMKO1，其受體結合位點是銅綠假單胞菌外排系統(tǒng) MexAB 和 MexXY 的外膜孔蛋白 M(OprM)。如圖 5 所示，當使用 OMKO1噬菌體侵染銅綠假單胞菌時，細菌通過改變外排泵機制對噬菌體產生抗性，進而導致其對幾種抗生素類藥物的敏感性增強，降低銅綠假單胞菌對抗生素耐藥產生頻率。

圖5 銅綠假單胞菌對噬菌體產生耐藥性外排泵機制[78]Fig. 5 Pseudomonas aeruginosa resistance to phage attack changes the eラux pump mechanism[78]

噬菌體通過細菌表面特異性的受體來特異性識別細菌。一旦細菌表面的受體發(fā)生突變，其就會對噬菌體產生抗性，單獨使用噬菌體來治療病原菌的效率勢必會受到影響。因此，研究者通過將幾種噬菌體混合起來的雞尾酒療法或者將噬菌體與抗生素聯(lián)合的方法來治療銅綠假單胞菌感染。

2017 年，Oechslin 等[79]研究發(fā)現(xiàn)，單獨使用噬菌體來治療銅綠假單胞菌感染雖然可以殺死大部分銅綠假單胞菌，但是 24 h 后會產生噬菌體抗性菌，而將噬菌體和環(huán)丙沙星聯(lián)用，不僅可以增強抗菌能力，還可以降低銅綠假單胞菌的抗性。如圖 6 所示，2020 年，Luscher 等[71]在人氣道上皮細胞系體外模型中，研究了噬菌體和環(huán)丙沙星單獨或聯(lián)合使用對銅綠假單胞菌感染的療效。結果發(fā)現(xiàn)，單獨使用噬菌體或抗生素時產生抗性的細菌會再次生長，而將噬菌體和環(huán)丙沙星聯(lián)合使用后不僅提高了抗菌效率，而且保持了細胞的完整性。2018 年，F(xiàn)orti 等[80]為了提高噬菌體的治療效果，將 6 種噬菌體(PYO2、DEV、E215、E217、PAK_P1 和 PAK_P4)混合，通過體外實驗驗證了這 6 種噬菌體混合物可以殺死浮游狀和生物被膜狀態(tài)的銅綠假單胞菌，而后在有菌血癥的蠟螟和呼吸道感染的老鼠模型中均驗證了 6 種噬菌體混合物清除銅綠假單胞感染的高效性。2019年，Cafora 等[81]在囊性纖維化的斑馬魚模型中也驗證了單獨使用 6 種噬菌體混合物能夠降低感染動物致死率、細菌負擔和減輕感染引起的促炎反應。

圖6 噬菌體和抗生素聯(lián)合治療可防止銅綠假單胞菌感染野生型和 cftr－上皮細胞[71]Fig. 6 Combined bacteriophage and antibiotic treatment prevents Pseudomonas aeruginosa infection of wild type and cftr－ epithelial cells[71]

用噬菌體治療銅綠假單胞等病原菌造成的感染具有很多優(yōu)點，但臨床中大規(guī)模地使用噬菌體來治療病原菌感染仍有不容忽視的問題。(1)天然噬菌體治療病原菌感染往往會導致病原菌裂解，而裂解后的病原菌釋放的內毒素是膿毒癥發(fā)病機制中最重要的因素；(2)哺乳動物的循環(huán)系統(tǒng)能有效地從血液中清除噬菌體，因此治療時噬菌體很難維持必要的噬菌體濃度；(3)單個天然噬菌體特異性太高導致其作用范圍較窄[82]。

隨著分子生物學和基因工程的發(fā)展，越來越多的噬菌體基因組序列和蛋白功能被闡明。通過對天然的噬菌體基因組進行設計改造，可以提高噬菌體的抗菌效率，同時降低噬菌體療法的副作用[83-86]。

2004 年，Hagens 等[87]通過修改銅綠假單胞菌噬菌體的Pf3基因，得到的Pf3R噬菌體在殺死宿主細菌時不會導致宿主細胞裂解。因此，在殺死銅綠假單胞菌后其內毒素的釋放保持在最低水平，有效解決了用噬菌體清除銅綠假單胞菌感染時內毒素釋放帶來的問題。2014 年，Pei和 Lamas-Samanamud[88]通過對 T7 噬菌體進行改造，得到一種可表達廣泛活性內酯酶的工程 T7 噬菌體。該噬菌體可以通過降解細菌生物被膜，生成必需的群體響應小分子 AHLs，從而阻止銅綠假單胞菌、農桿菌等細菌的生物被膜生成。

4.2 噬菌體治療多重耐藥的銅綠假單胞菌的臨床應用

目前，噬菌體療法已在一些感染銅綠假單胞菌的燒傷、尿路病人上應用，具有良好的效果且未觀察到不良反應[89-90]。

2009 年，Merabishvili 等[91]通過篩選將 3 種作用范圍比較廣的噬菌體混合，得到的噬菌體混合物 BFC1 用于治療銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌感染燒傷患者，且未觀察到不良反應。2016 年，一位 61 歲銅綠假單胞菌感染的敗血癥患者由于急性腎損傷不得不停止對其體內分離銅綠假單胞菌唯一敏感的抗生素——黏菌素的繼續(xù)使用。Jennes 等[92]通過靜脈輸入噬菌體混合物BFC1 的方式成功治愈銅綠假單胞菌感染，避免了傳統(tǒng)的血液過濾，同時也沒有觀察到可能與噬菌體應用有關的意外不良事件、臨床異?；驅嶒炇覚z測結果的變化。2018 年，F(xiàn)urr 等[93]用 ABPA01 混合噬菌體成功治愈一位囊性纖維化患者的肺部耐多藥銅綠假單胞菌肺炎，并且在治療的兩個月內都沒有發(fā)生肺炎，患者的腎衰竭也得到了改善。2019 年，Jault 等[94]用 12 種銅綠假單胞菌噬菌體混合物(1×106[PFU]/mL)和 1% 磺胺嘧啶銀乳劑分別來治療已經感染多重耐藥的銅綠假單胞菌的燒傷患者。雖然相比使用 1% 磺胺嘧啶銀乳劑，噬菌體混合物治療效果略差，但是單獨使用噬菌體混合物仍然可以有效殺死傷口表面感染的銅綠假單胞菌。

5 結語與展望

近年來，為了提高多重耐藥的銅綠假單胞菌的治愈率，不同領域的研究者們研究探索了很多新的藥物和新的治療方式。目前，已經投入臨床使用或尚在研究中的針對多重耐藥的銅綠假單胞的抗菌藥物分為廣譜型藥物(有機酸、抗生素、納米粒子、抗菌肽)和靶向型藥物(綠膿桿菌素、綠膿桿菌素融合蛋白)。廣譜的抗菌藥物雖然可以同時作用于多種菌，適用范圍較廣，但無差別殺菌在對抗病原菌的同時，往往會影響正常菌群的生長，進而導致菌群紊亂，對治療帶來不良效果。靶向型藥物特異性高，但作用范圍又太窄。無論是廣譜型的藥物還是靶向型的藥物，直接將抗菌藥物用于治療往往會因為體液中金屬離子、生物被膜等因素影響藥物濃度和活性。為了提高藥物的活性和減少藥物損失，需要將藥物負載在載體中進行保護。使用水凝膠作為藥物載體時往往會受到使用時的 pH 值、生物相容性以及水凝膠流動性等的影響；使用細菌作為抗菌藥物表達母體和藥物載體可以降低成本，實現(xiàn)藥物抗菌可控性，但工程菌內基因線路是否穩(wěn)定以及工程菌裂解后內毒素問題等無一不困擾著研究者。

開發(fā)新的抗菌藥物和新的治療方法以治療多重耐藥的銅綠假單胞菌感染是一條漫長而曲折的道路。盡管在體外實驗或動物模型中許多新的抗菌藥物和治療方式對多重耐藥的銅綠假單胞菌表現(xiàn)出顯著的抗菌作用，但受限于抗菌藥物生產難度、給藥方式等原因，進入臨床實踐的很少。未來銅綠假單胞菌感染治療研究中，除了繼續(xù)開發(fā)新藥物和新治療方式外，更不能忽略將現(xiàn)有抗菌藥物、治療方式聯(lián)合起來揚長避短推動多重耐藥銅綠假單胞菌在臨床治療中的應用。