黃建東 韋孟溪 周 楠

1(香港大學(xué)李嘉誠(chéng)醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院 中國(guó)香港 999077)

2(中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院 中國(guó)科學(xué)院定量工程生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省合成基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 深圳 518055)

1 引 言

利用細(xì)菌治療腫瘤最早記載于古埃及的醫(yī)學(xué)著作[1-2]，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染腫瘤后能減緩腫瘤生長(zhǎng)。19 世紀(jì)初葉，Vautier 報(bào)道稱發(fā)現(xiàn)氣性壞疽的癌癥患者腫瘤會(huì)消退[3]。隨后，Coley[4]將化膿性鏈球菌(S. pyrogenes)和黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)滅活，制成了細(xì)菌制劑“Coley’s Toxins”，并將其作為一種治療手段，也取得了不錯(cuò)的療效。早期使用的是天然野生細(xì)菌，它們主要通過(guò)游走而被化學(xué)吸引滯留在腫瘤微環(huán)境中，且進(jìn)入腫瘤后繼續(xù)增殖，并通過(guò)觸發(fā)凋亡、壞死和細(xì)胞破裂直接殺死癌細(xì)胞[5]，同時(shí)還有一部分細(xì)菌能激活機(jī)體的適應(yīng)性免疫細(xì)胞，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。但治療過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，天然野生細(xì)菌除了會(huì)在腫瘤部位游走，還會(huì)參與血液循環(huán)，這就帶來(lái)了全身感染的風(fēng)險(xiǎn)[6-7]。在 20 世紀(jì) 90 年代中期，研究者發(fā)現(xiàn)細(xì)菌療法產(chǎn)生的療效竟然和傳統(tǒng)的治療方法不相上下，同時(shí)認(rèn)識(shí)到腫瘤微環(huán)境和重組 DNA 技術(shù)能夠產(chǎn)生更有效和毒性更低的細(xì)菌菌株，使用活細(xì)菌進(jìn)行癌癥治療的熱情被重新點(diǎn)燃[8]。

隨著基因工程的發(fā)展，可通過(guò)合成生物學(xué)的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行工程改造，使之毒性減弱，增強(qiáng)靶向定位腫瘤，特異性感知病灶，精準(zhǔn)定位于病灶。利用細(xì)菌作為載體搭載藥物運(yùn)輸至腫瘤部位，或?qū)?xì)菌進(jìn)行基因修飾來(lái)表達(dá)目的藥物分子，將大大提高細(xì)菌治療腫瘤的可利用性，也提升了治療效果。合成生物學(xué)領(lǐng)域開發(fā)的一系列基因工具能使工程化的細(xì)菌保留固有的抗腫瘤特性，同時(shí)為癌癥治療提供各種類型的載荷，以及更有效、更安全的策略。利用細(xì)菌治療腫瘤有望成為人類對(duì)抗腫瘤的新興趨勢(shì)，本文總結(jié)了近年利用工程菌治療腫瘤的研究進(jìn)展。

2 改造工程菌治療腫瘤

野生細(xì)菌對(duì)健康組織的全身毒性可能是在不適當(dāng)?shù)臅r(shí)間、部位釋放有毒的物質(zhì)以及不可控游走引起的。應(yīng)用合成生物學(xué)的方法對(duì)基因進(jìn)行篩選和修飾，通過(guò)基因改造可以控制細(xì)菌毒性的表達(dá)，推動(dòng)新的腫瘤特異性結(jié)合蛋白的開發(fā)，增強(qiáng)細(xì)菌與腫瘤的結(jié)合，使細(xì)菌達(dá)到更好的治療效果。

2.1 提高細(xì)菌治療的安全性和靶向性

有效的腫瘤靶向和治療的安全性是細(xì)菌癌癥治療中面臨的主要問題。由于腫瘤內(nèi)存在新生血管發(fā)育不全、血管分布混亂等問題，導(dǎo)致血液循環(huán)紊亂、血液流動(dòng)緩慢，腫瘤組織內(nèi)氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳遞低效，因此形成了獨(dú)特的腫瘤缺氧微環(huán)境?；诖?，中國(guó)香港大學(xué) Yu 等[9]通過(guò)合成生物學(xué)方法來(lái)設(shè)計(jì)沙門氏菌，以提高其在抗腫瘤治療中的減毒性和靶向性，使之抗擊腫瘤更加有效、靈活。該設(shè)計(jì)主要是對(duì)必需基因(asd)進(jìn)行工程改造，使其處于缺氧條件啟動(dòng)子的控制之下，只在缺氧條件下表達(dá)。在有氧條件下的正常組織中，則不表達(dá)asd，也不合成二氨基庚二酸，此時(shí)除非由環(huán)境提供二氨基庚二酸，否則細(xì)菌將在生長(zhǎng)期間溶解。經(jīng)過(guò)改造的沙門氏菌(YB1)在攜帶腫瘤的裸鼠體內(nèi)，能靶向定植于腫瘤中，抑制腫瘤生長(zhǎng)，同時(shí)不影響小鼠的正常組織[9]。另一種解決靶向傳遞的方法是在細(xì)菌表面表達(dá)腫瘤特異性結(jié)合蛋白。臨床上，細(xì)菌與腫瘤自然結(jié)合的依賴性還不夠強(qiáng)。為了解決其中的一些限制，研究人員已經(jīng)開始開發(fā)和篩選腫瘤特異性結(jié)合蛋白。新加坡國(guó)立大學(xué)永盧林醫(yī)學(xué)院的 Ho 等[10]對(duì)大腸桿菌 Nissle 1917(EcN)進(jìn)行編碼，使之與癌細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖(Heparan Sulfate Proteoglycan，HSPG)結(jié)合，并分泌芥子酶將膳食硫代葡萄糖苷轉(zhuǎn)為具有已知抗腫瘤活性的有機(jī)小分子蘿卜硫烷，其中蘿卜硫烷能抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。這種組合方法在體外實(shí)驗(yàn)幾乎完全抑制了癌細(xì)胞。當(dāng)施用在小鼠結(jié)直腸癌模型中時(shí)，觀察到小鼠荷瘤變小，腫瘤發(fā)生率比單獨(dú)使用工程微生物或膳食硫甙治療降低了 7 倍[10]。西班牙國(guó)家微生物中心的一項(xiàng)研究在大腸桿菌表面表達(dá)合成黏附素，并測(cè)試其與癌癥抗原表面結(jié)合的能力、以及該工程菌在體內(nèi)定植小鼠腫瘤的能力[11]。結(jié)果顯示，與野生型相比，含有合成黏附素的工程大腸桿菌能夠以較低劑量定植于實(shí)體腫瘤，并減少與健康組織的非特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)病灶的精準(zhǔn)靶向定位。

與野生型相比，改造后細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)在于，保留野生菌動(dòng)力活性的同時(shí)，毒性被大大地減弱，在合適的劑量范圍內(nèi)不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害，并且能夠靶向定植于腫瘤。但工程菌具有不穩(wěn)定性，隨著繁殖時(shí)間的延長(zhǎng)，可能出現(xiàn)基因變異回歸的情況，這有可能導(dǎo)致細(xì)菌部分恢復(fù)毒性而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害。腫瘤細(xì)胞表面特異性蛋白的表達(dá)和調(diào)控會(huì)受時(shí)間的影響。因此，對(duì)于表達(dá)合成黏附素的工程菌，需要把握好腫瘤細(xì)胞表面特異性附著蛋白分子的性能，防止因腫瘤表面特異性蛋白表達(dá)的變化，致使細(xì)菌脫靶而達(dá)不到應(yīng)有的治療效果。

2.2 通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成治療腫瘤

實(shí)體瘤的特點(diǎn)是血管生成增加，目前已經(jīng)有幾種工程化的細(xì)菌治療策略側(cè)重于抑制血管生成來(lái)產(chǎn)生抗腫瘤作用。廣東省深圳市動(dòng)物遺傳工程技術(shù)研發(fā)中心的 Wei 等[12]對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌進(jìn)行改造，使之可以分泌腫瘤血管內(nèi)皮抑制素(Tumstatin，Tum)。其中，腫瘤血管內(nèi)皮抑制素是一種強(qiáng)大的內(nèi)源性血管生成抑制劑。該團(tuán)隊(duì)將非致病性厭氧長(zhǎng)雙歧桿菌設(shè)計(jì)成新型的 Tum給藥系統(tǒng)，使之能夠在pBADs啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá) Tum，細(xì)菌精準(zhǔn)定位腫瘤的同時(shí)，提高靶向給藥功能。這種工程菌在 CT26 荷瘤小鼠模型中抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡(圖 1)，首次證明利用長(zhǎng)根雙歧桿菌轉(zhuǎn)化 Tum作為一種特異的基因傳遞系統(tǒng)治療腫瘤。Wood等[13]報(bào)道了一種基于單核細(xì)胞增生李斯特菌減毒疫苗的研制，該疫苗可分泌 tLLO-CD105 融合蛋白。其中，該融合蛋白包含一種膽固醇依賴性細(xì)胞溶血素李斯特菌溶血素 O(LLO)和一種在血管生成中起作用的 TGF-β 受體家族成員Edoglin(CD105)。改造后的李斯特菌能有效抗血管生成和抑制腫瘤，減輕小鼠的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性乳腺癌。

圖1 細(xì)菌經(jīng)工程改造后治療荷瘤小鼠的過(guò)程Fig. 1 Treatment process of tumor bearing mice with engineered bacteria

利用工程化細(xì)菌生成血管抑制劑治療腫瘤的優(yōu)勢(shì)在于：一是利用細(xì)菌的能動(dòng)作用靶向腫瘤；二是在腫瘤部位分泌血管抑制劑，僅針對(duì)腫瘤內(nèi)的血管起作用，減少了不必要的組織傷害。需要注意的是，細(xì)菌進(jìn)駐機(jī)體的方式必須和細(xì)菌分泌的血管抑制劑相對(duì)適宜，這樣才能避免治療后引起健康組織與腫瘤組織并發(fā)的安全性問題。同時(shí)，細(xì)菌分泌血管抑制劑的劑量對(duì)腫瘤的抑制也至關(guān)重要，分泌過(guò)多或過(guò)少都有可能達(dá)不到良好的治療效果。

2.3 通過(guò)細(xì)胞毒蛋白攻擊腫瘤

利用細(xì)菌在腫瘤部位產(chǎn)生細(xì)胞毒蛋白是一種癌癥治療的方式。這種設(shè)計(jì)方式主要是利用細(xì)菌能夠游走到腫瘤的缺氧病灶區(qū)域，然后通過(guò)裂解釋放或者分泌特定的抗腫瘤藥物，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的靶向給藥，達(dá)到抑制病情的效果。兩項(xiàng)獨(dú)立研究[14-15]表明，大腸桿菌 K-12 和鼠傷寒沙門氏菌(S. typhimurium)能產(chǎn)生溶血素 A(Cytolysin A，ClyA)。改造后的菌株在對(duì)放射治療有抵抗力的小鼠 CT26 腫瘤模型中的缺氧區(qū)有效。Ryan 等[16]在鼠傷寒沙門氏菌中設(shè)計(jì)生成孔毒素溶血素E(HlyE)，改造后的菌株能增大小鼠乳腺癌的壞死率，減少腫瘤生長(zhǎng)。St 等[17]研究表明，對(duì)大腸桿菌菌株 χ6212(Δasd)進(jìn)行工程改造可以提供金黃色葡萄球菌衍生的 α-溶血素(SAH)。該工程菌株能夠使 4T1 荷瘤小鼠的腫瘤消退，促進(jìn)腫瘤壞死。Yamada 等[18]利用銅綠假單胞菌表達(dá)低毒性氧化還原蛋白 Azurin。其中，Azurin 是一種抗癌治療蛋白，其向細(xì)胞核的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于 p53。Azurin 與 p53 形成復(fù)合物，穩(wěn)定 p53 并提高細(xì)胞內(nèi) p53 和 Bax 的水平，導(dǎo)致線粒體細(xì)胞色素 c 釋放到胞漿中，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。Zhang 等[19]的研究表明，表達(dá) Azurin 的 EcN 能夠抑制小鼠B16 黑色素瘤和 4T1 乳腺腫瘤的生長(zhǎng)。Lim 等[20]設(shè)計(jì)鼠傷寒沙門氏菌來(lái)表達(dá)和釋放融合蛋白，該融合蛋白包含轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 α(TGFα)和假單胞菌外毒素 a(PE38)，二者分別是表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)的天然配體和免疫毒素。經(jīng)改造后的鼠傷寒沙門氏菌釋放的 TGFα-PE38 融合蛋白顯著抑制小鼠實(shí)體瘤的生長(zhǎng)。

大多數(shù)癌癥藥物不能清除腫瘤中所有的癌細(xì)胞，它們通常只對(duì)抗增殖細(xì)胞，并且不能深入滲透到組織中。這些弱點(diǎn)使許多腫瘤細(xì)胞能夠逃脫治療，增大了復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和致死的概率。改造后的工程菌利用能動(dòng)性游走到腫瘤部位，此時(shí)它們相當(dāng)于提供一個(gè)在原位持續(xù)生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物的分子工廠：將生產(chǎn)的蛋白藥物集中在腫瘤的深處，隨細(xì)菌的游走而擴(kuò)散，分泌的蛋白藥物撒落于腫瘤的各個(gè)部位，擴(kuò)大了治療范圍，顯著提高了治療效果。然而，并不是所有的蛋白藥物對(duì)健康的組織都是有益的，因此，嚴(yán)格控制細(xì)菌的劑量，把握好細(xì)菌分泌蛋白藥物的時(shí)間、表達(dá)能力的穩(wěn)定性和藥物的產(chǎn)量，才能確保機(jī)體的安全。

2.4 通過(guò) RNA 干擾阻斷腫瘤生長(zhǎng)

通過(guò)工程細(xì)菌提供的 RNA 干擾(RNAi)治療是將治療性 RNAi 效應(yīng)物(短發(fā)夾狀 RNA，shRNA)運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞中，用來(lái)沉默癌癥相關(guān)的 mRNA。Jia 等[21]研究表明，減毒鼠傷寒沙門氏菌經(jīng)改造后在原位肝細(xì)胞癌小鼠模型中遞送STAT3-specific siRNA 和內(nèi)皮抑素。這兩種有效載荷的聯(lián)合應(yīng)用能夠抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，減少腫瘤的增殖炎癥和腫瘤微血管的數(shù)量。Phan等[22]對(duì)減毒鼠傷寒沙門氏菌菌株進(jìn)行改造，表達(dá)靶向吲哚胺 2,3-雙加氧酶的 shRNA，使用在CT26 和 MC38 結(jié)直腸癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，該菌株能增大中性粒細(xì)胞在腫瘤中的浸潤(rùn)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡數(shù)量增加。其他通過(guò)細(xì)菌介導(dǎo)的 RNAi并在臨床前模型中顯示出治療效果的靶基因包括 Survivin(凋亡抑制蛋白家族的新成員，具有腫瘤特異性)、B 細(xì)胞淋巴瘤 2(Bcl-2)、性別決定區(qū) Y(SRY)盒 2(Sox2)、程序性細(xì)胞死亡蛋白1(PD-1)、抑制素亞單位 α(INHA)、多藥耐藥突變 1(MDR1)和極性激酶 1(PLK1)[21,23-27]等。

通過(guò) RNA 干擾治療腫瘤的工程菌可以抑制腫瘤表面的免疫檢查點(diǎn)蛋白，使免疫反應(yīng)更加有效。此外，有些抗腫瘤抗體不僅費(fèi)用昂貴，治療過(guò)程還有可能產(chǎn)生毒副作用。如果使用 RNAi 來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞表面的 PD-L1，那么可以有效地誘發(fā)抗腫瘤反應(yīng)，該類型細(xì)菌不僅能夠作為免疫刺激劑，還降低了治療成本。然而，由于細(xì)菌前期不止在腫瘤部位游走，還游走于機(jī)體的其他部位，為了避免誤傷健康組織，控制好 RNAi 效應(yīng)物在時(shí)間和空間上的表達(dá)至關(guān)重要。

2.5 作為負(fù)載抗腫瘤藥物的底盤進(jìn)行治療

開發(fā)工程化的細(xì)菌為基礎(chǔ)方法進(jìn)行癌癥治療時(shí)，一個(gè)需重點(diǎn)考慮的因素是選擇合適的細(xì)菌底盤作為藥物載荷。選擇細(xì)菌作為底盤搭載藥物的優(yōu)勢(shì)在于，細(xì)菌具有良好的兼容性和基因改變的易用性，同時(shí)還具有天然的抗腫瘤活性和浸襲定植腫瘤的能力，能使藥物的靶向精準(zhǔn)給藥方式更加靈活和更加智能。越來(lái)越多的工程菌，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、李斯特菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬、乳酸桿菌屬和乳球菌屬等都可供應(yīng)用。美國(guó)哥倫比亞大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系的 Chowdhry 等[28]使用細(xì)菌作為底盤來(lái)進(jìn)行免疫檢查點(diǎn)的阻斷治療，他們?cè)诜侵虏⌒源竽c桿菌中搭載同步裂解基因線路(Synchronized Lysis Circuit，SLC)，并通過(guò)該基因線路編碼釋放 CD47 納米抗體。結(jié)果表明，在腫瘤內(nèi)釋放 CD47 納米抗體可增強(qiáng)腫瘤浸潤(rùn)性 T細(xì)胞的活性，顯著抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步在益生菌搭載 SLC，用來(lái)釋放程序性細(xì)胞死亡配體 1(PD-L1)和細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白 4(CTLA-4)的納米抗體。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，PDL1 和 CTLA-4 納米抗體的瘤內(nèi)釋放可以增強(qiáng) T 細(xì)胞的活化水平、增加記憶 T 細(xì)胞，進(jìn)而引起腫瘤消退。此外，聯(lián)合使用釋放 PD-L1 納米抗體、CTLA-4 納米抗體和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的細(xì)菌菌株比單獨(dú)或雙重使用釋放免疫檢查點(diǎn)納米抗體的菌株更為有效[29]。

2.6 制造癌癥活疫苗

細(xì)菌疫苗一直是疫苗學(xué)的主要研究領(lǐng)域，將細(xì)菌設(shè)計(jì)成疫苗來(lái)治療癌癥也是一種趨勢(shì)。日本東京大學(xué)醫(yī)學(xué)院的 Kawana 等[30]將乳酸桿菌設(shè)計(jì)成能分泌腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-Associated Antigen，TAA)來(lái)刺激機(jī)體適應(yīng)性免疫反應(yīng)。他們?cè)诤罄m(xù)的一項(xiàng) I/IIa 期臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，含有表達(dá) TAA(HPV16 E7)的干酪乳桿菌 GLBL101c 的口服疫苗能夠使 70% 的宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變患者(從 CIN3 到 CIN1-2)的癥狀消退。識(shí)別 E7 抗原的初始 T 細(xì)胞能夠定位于宮頸腫瘤并促使 T 輔助細(xì)胞 1(Th1)產(chǎn)生[30-31]。日本神戶大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Kitagawa 等[32]使用重組長(zhǎng)雙歧桿菌構(gòu)建了一種口腔癌疫苗——能表達(dá)腎母細(xì)胞瘤 1(WT1)蛋白，種植表達(dá) WT1 腫瘤細(xì)胞的小鼠經(jīng)口服給藥后，在為期 4 周的觀察中發(fā)現(xiàn)，該疫苗能夠誘導(dǎo) WT1表位特異性細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞的活性，并且減緩小鼠腫瘤生長(zhǎng)。在隨后的研究中，使用該疫苗和PD1 抗體聯(lián)合治療能夠顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)表達(dá) WT1 的 TRAMP-C2 荷瘤小鼠的生存期[33]。

2.7 工程菌在聯(lián)合治療中的應(yīng)用

腫瘤內(nèi)同一器官(瘤內(nèi)異質(zhì)性)或患者之間(瘤間異質(zhì)性)存在分子和細(xì)胞異質(zhì)性[34]。腫瘤內(nèi)異質(zhì)性可能是固有的基因組不穩(wěn)定以及腫瘤微環(huán)境中的各成分引起的，這些成分會(huì)引起癌細(xì)胞基因型和酚類的變化。此外，將藥物引入腫瘤微環(huán)境可能導(dǎo)致腫瘤獲得耐藥性，并產(chǎn)生具有不同類型且未確定癌癥特征的耐藥癌細(xì)胞克隆。

癌癥單一療法不能充分解決異質(zhì)性腫瘤的問題，因此產(chǎn)生了使用聯(lián)合療法的方案來(lái)獲得更好的治療效果。組合方案能同時(shí)提供多個(gè)有效載荷，可用于不同的癌癥標(biāo)志。例如，EcN 被用來(lái)傳遞 Tum-5-p53 融合蛋白[35]。這種方法既可以用 Tum-5 來(lái)抑制血管生成，又能引入 p53 抑癌基因來(lái)解決一些癌癥特性，如基因組穩(wěn)定性、抗凋亡、組織侵襲和轉(zhuǎn)移以及腫瘤相關(guān)炎癥[35-36]。He等[35]設(shè)計(jì)了 3 種不同的鼠傷寒沙門氏菌菌株，分別用來(lái)表達(dá) hlyE 毒素、CCL21 以及由 Bcl-2 轉(zhuǎn)錄抑制因子 1(Bit1)的細(xì)胞死亡域和凋亡觸發(fā)因子(腫瘤穿透肽 iRGD)組成的融合蛋白。將 3 種菌株的混合物在小鼠身上使用時(shí)發(fā)現(xiàn)，與單一菌株的使用相比，它在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面具有更強(qiáng)的效力[35,37]。另一種方法是將工程菌和其他常規(guī)療法聯(lián)合使用，也可以提高腫瘤的治療效果。有臨床前研究表明，與細(xì)菌單一療法相比，向小鼠聯(lián)合使用表達(dá) ClyA 的鼠傷寒沙門氏菌和放射療法能在更大程度上抑制腫瘤生長(zhǎng)[15]。此外，表達(dá) hlyE的鼠傷寒沙門氏菌與化療藥物 5-氟尿嘧啶的聯(lián)合應(yīng)用能夠抑制 MC26-LucF 荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)并延長(zhǎng)小鼠的生存期[37]。Chen 等[38]使用鼠傷寒沙門氏菌來(lái)傳遞人源化毒素 DNase I，其中 DNase I 是一種 DNA 核酸酶，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中負(fù)責(zé) DNA斷裂。該工程菌株與細(xì)胞毒性化合物雷公藤內(nèi)酯醇的聯(lián)合使用抑制了腫瘤生長(zhǎng)并提高了 B16-F10荷瘤小鼠的存活率。

3 工程菌的臨床研究進(jìn)展與面臨的挑戰(zhàn)

選擇合適的動(dòng)物模型和患者對(duì)臨床研究至關(guān)重要。目前已有一些在臨床前研究顯示出有療效的工程菌用于人體的臨床試驗(yàn)[23,39]。美國(guó)馬里蘭州的一個(gè)實(shí)驗(yàn)室利用減毒傷寒沙門氏菌株 VNP20009 表達(dá)大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶，該菌株在患者腫瘤內(nèi)將 5-FC(5-fluorocytosine)轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶(5-fluorocytosine，5-FU)[23,40]。該研究結(jié)果顯示，三位病人中只有兩位的腫瘤中有細(xì)菌定植和 5-FU 生成。最后由于所有患者的臨床反應(yīng)都未達(dá)到預(yù)期，該研究被終止。美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)獸醫(yī)臨床科學(xué)院在一項(xiàng)獸醫(yī)犬類臨床試驗(yàn)中使用了減毒鼠傷寒沙門氏菌 χ4550，該菌株能夠編碼 IL-2(SalpIL2)，然而臨床反應(yīng)并沒有達(dá)到預(yù)期[6]。這些研究顯示，臨床前研究和實(shí)際臨床研究的結(jié)果存在差異。

鑒于活性菌作為治療劑的獨(dú)特性質(zhì)，還需要考慮其臨床轉(zhuǎn)化的幾個(gè)重要問題。首先，攜帶抗生素抗性基因的細(xì)菌可能含有能夠介導(dǎo)水平基因轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒等移動(dòng)遺傳元件，這通常不適合臨床研究[41]。其次，與其他小分子等臨床試劑不同，活細(xì)菌或細(xì)菌孢子不能通過(guò)加熱或過(guò)濾來(lái)滅菌，這對(duì)生產(chǎn) GMP (Good Manufacture Practice)級(jí)試驗(yàn)制品提出了挑戰(zhàn)。此外，無(wú)菌測(cè)試的常規(guī)需氧和厭氧培養(yǎng)方法是行不通的。因此，須遵循嚴(yán)格的無(wú)菌條件，在專用潔凈室中進(jìn)行生產(chǎn)，并且嚴(yán)格監(jiān)控生產(chǎn)過(guò)程的潔凈度。雖然不能證明最終產(chǎn)品無(wú)雜菌污染，但需要確認(rèn)它們不含疾病或病理狀況的致病因子。第三，活細(xì)菌在靶組織中增殖，有效(無(wú)論治療或毒性)劑量與給藥時(shí)的劑量不一定相關(guān)聯(lián)。有效劑量更多地取決于靶組織的質(zhì)量，由細(xì)菌的可及性、腫瘤壞死或缺氧的程度以及預(yù)先存在的腫瘤浸潤(rùn)性炎性細(xì)胞的豐度來(lái)定義。這些因素決定了全身施用的細(xì)菌如何進(jìn)入靶組織，并且是否會(huì)引起增殖和感染。第四，當(dāng)在臨床環(huán)境中使用活的生物制劑時(shí)，其對(duì)公共健康和環(huán)境的潛在影響是一個(gè)問題，需要妥善解決。此外，使用溶瘤細(xì)菌面臨的另一個(gè)挑戰(zhàn)是，使用溶瘤細(xì)菌進(jìn)行治療是將腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)榫植磕[瘤破壞性感染，若管理不當(dāng)則可能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重后果。由于強(qiáng)感染會(huì)產(chǎn)生毒性效應(yīng)，所以平衡各種條件尤為重要。過(guò)早地使用抗生素預(yù)防可限制毒性，但可能會(huì)干預(yù)細(xì)菌的抗腫瘤作用。而晚期干預(yù)具有不可預(yù)測(cè)的風(fēng)險(xiǎn)。成功控制感染需要跨學(xué)科的專家，包括腫瘤學(xué)家、傳染病專家和介入放射科醫(yī)生或外科醫(yī)生來(lái)把控侵入性治療的膿腫或非膿腫形成感染。因此，在確定感染后如何進(jìn)行干預(yù)需要跨學(xué)科團(tuán)隊(duì)來(lái)確定。

4 總結(jié)與展望

目前癌癥的治療手段還集中在手術(shù)、化療、放療和免疫治療，由于腫瘤本身缺氧、微血管紊亂等微環(huán)境，限制了各種治療的療效。細(xì)菌治療的優(yōu)勢(shì)在于可以利用自身運(yùn)動(dòng)和生長(zhǎng)的驅(qū)動(dòng)性，深入到腫瘤內(nèi)部。不少研究表明，細(xì)菌通過(guò)基因改造后可以作為藥物載體、藥物疫苗等，有效治療腫瘤。隨著科學(xué)研究的不斷發(fā)展，合成生物學(xué)以及各項(xiàng)機(jī)理研究不斷深入，利用細(xì)菌治療腫瘤有望成為理想方法，為癌癥治療帶來(lái)希望。