昝芳芳 崔 瑾

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，貴州貴陽 550002；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸科，貴州貴陽 550002

弩藥液是傳統(tǒng)苗醫(yī)外治法中常用的外用藥物之一，由嗟尚（大血藤）50 g、斗珍空（透骨香）50 g、嘎八叉賒（黑骨藤）30 g、包家利幼（生草烏）20 g、嘎炯豆丟勞（白龍須）15 g 組成，具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)、散瘀止痛的功效[1-3]。常搭配針具使用，由針具和弩藥液結(jié)合成弩藥針療法，在苗族民間主要治療風(fēng)類疾病，現(xiàn)代臨床中廣泛應(yīng)用于膝骨性關(guān)節(jié)炎、腰椎間盤突出癥、頸椎病等痛癥的治療[4-7]。多年來，經(jīng)苗族人民和現(xiàn)代臨床不斷驗(yàn)證，該療法具有極其顯著的臨床作用，操作簡單，安全性較高[8-12]。劉向陽[13]通過急性毒理試驗(yàn)，證明了弩藥液經(jīng)皮給藥對動(dòng)物的急性毒性小，通過鎮(zhèn)痛抗炎試驗(yàn)得出弩藥液能顯著提高小鼠的痛閾，具有明顯的鎮(zhèn)痛效果，但是它的藥理作用機(jī)制尚未闡明。目前苗醫(yī)弩藥針的研究現(xiàn)狀僅停留于臨床研究，弩藥液的藥理研究少之又少，其有效成分的含量測定方法亦少見。故本實(shí)驗(yàn)建立高效液相色譜法（HPLC）測定弩藥液中5個(gè)具有抗炎鎮(zhèn)痛作用活性成分的含量方法，為弩藥液的臨床療效提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀LC-2030C 3D（日本島津）；十萬分之一電子天平（AUW120D，日本島津）；高速離心機(jī)（TGL-16B，上海安亭科學(xué)儀器廠）；超聲波清洗機(jī)（SB25-12DTD，寧波新芝生物科技股份有限公司）。

弩藥材購于貴陽市萬東花鳥市場，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為正品。綠原酸對照品（批號(hào)：110753-201817，純度≥98%）購于中國食品藥品檢定研究院；八角楓堿對照品（批號(hào)：DST190715-176，純度≥98%）、兒茶素對照品（批號(hào)：DST190628-001，純度≥98%）、新烏頭堿對照品（批號(hào)：DST190613-025，純度≥98%）、次烏頭堿對照品（批號(hào)：DST190307-058，純度≥99%）均購自成都德思特生物技術(shù)有限公司。乙腈（色譜純，Tedia 公司），磷酸（色譜純，科密歐化學(xué)試劑有限公司），其余均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 八角楓堿、兒茶素、綠原酸 色譜柱：Agilent 5 TC-C18（2）（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（C）-0.2%磷酸水溶液（A），梯度洗脫：0～25 min，5.0%C；25～35 min，5.0%～8.5%C；35～50 min，8.5%～8.8%C；50～60 min，8.8%～9.0%C；流速1.0 mL/min；檢測波長：258 nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 新烏頭堿、次烏頭堿 色譜柱、流動(dòng)相與“2.1.1”項(xiàng)相同，梯度洗脫：0～10 min，28%C；10～25 min，28%～33%C；25～35 min，33%～37%C；35～40 min，37%～40%C；流速為1.0 mL/min；檢測波長：235 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 將藥材切片放置1500 mL 玻璃容器內(nèi)，加入50 度白酒1000 mL 密封，常溫下浸泡14 d，浸泡過程中需每日輕輕搖蕩1～2 次，待浸泡14 d 后，過濾出藥液，棄去藥渣，該原液需密封靜置3 d，再過濾，裝瓶，密封避光常溫下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。精密抽取弩藥? mL，置于10 mL 容量瓶中，甲醇定容，搖勻，過濾，即得。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，置于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，即得含有八角楓堿6.294 μg/mL、兒茶素58.086 μg/mL、綠原酸17.900 μg/mL、新烏頭堿6.018 μg/mL、次烏頭堿2.890 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備6 份分別缺大血藤、透骨香、黑骨藤、生草烏、白龍須、黑骨藤與大血藤的陰性樣品溶液，過濾，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液、混合對照品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果見圖1～2。

圖1 八角楓堿、兒茶素、綠原酸HPLC 圖

圖2 新烏頭堿、次烏頭堿HPLC 圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL 至10 mL 量瓶，甲醇定容至刻度，搖勻，即得一系列濃度的對照品溶液。按“2.1”項(xiàng)色譜條件測定，記錄峰面積。以對照品的質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 各成分線性關(guān)系

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液各10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果八角楓堿、兒茶素、綠原酸、新烏頭堿、次烏頭堿峰面積的RSD 分別為0.929%、0.569%、0.472%、0.647%、0.481%，可見儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取上述供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。記錄八角楓堿、兒茶素、綠原酸、新烏頭堿和次烏頭堿的峰面積，RSD 分別是2.662%、0.650%、1.147%、1.367%、1.165%，提示供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次購買的弩藥材，按供試品溶液制備方法平行制備6 份，進(jìn)樣測定。結(jié)果八角楓堿、兒茶素、綠原酸、新烏頭堿、次烏頭堿平均含量分別為2.195、3.713、3.718、1.669、1.121 mg/g，RSD 分別為1.402%、1.770%、1.461%、1.542%、1.421%，提示該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精準(zhǔn)吸取已知含量的同一批次弩藥液6 份，每份1 mL，置于10 mL 容量瓶中，分別精密加入適量的八角楓堿、兒茶素、綠原酸、新烏頭堿、次烏頭堿對照品溶液，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率及RSD，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.3.7 含量測定 取6 批弩藥材，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備弩藥液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。測得峰面積按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算出6 批次藥材中5個(gè)化學(xué)成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 弩藥液中5個(gè)成分的含量（mg/g，n=6）

3 討論

本課題組在前期大量的臨床研究中發(fā)現(xiàn)弩藥針療法治療膝骨性關(guān)節(jié)炎具有極其顯著的臨床療效[14-17]，除針具的物理促滲作用外，弩藥液有重要的作用。黑骨藤、大血藤屬于藤類植物，均含有黃酮、皂苷、酚酸類化學(xué)成分，現(xiàn)代研究表明具有一定的抗炎、抑菌、抗氧化作用[18-20]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道白龍須、生草烏均含有生物堿、黃酮、皂苷等化學(xué)成分，經(jīng)藥理學(xué)研究證明具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等作用，而烏頭屬植物中二萜類生物堿的生理活性顯著，是最主要的特征性化學(xué)成分[21-25]。故本實(shí)驗(yàn)篩選了生物堿類、酚酸類及黃酮類成分作為弩藥液的指標(biāo)性成分具有可行性。

本研究建立了弩藥液中八角楓堿、綠原酸、新烏頭堿等5種有效成分的含量測定方法，選取了弩藥方中含量較高且與臨床藥效緊密聯(lián)系的成分作為指標(biāo)性成分。該方法操作簡便，快速高效，靈敏度高，干擾性少，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于弩藥液的含量測定，能為臨床用藥的安全性和有效性提供理論支撐。