杜永秀 楊 琴 楊晨希 徐 普

中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院口腔醫(yī)學中心黏膜病科，海南?？?570208

口腔癌中約90%為口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC)，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[1-2]。據報道，OSCC 的5 年生存率不足50%，早期診斷和治療OSCC 可顯著提高其5 年生存率[3-4]。世界衛(wèi)生組織傾向于把可能引起OSCC 的疾病稱為口腔潛在惡性病變（oral potential malignant disorder，OPMD），常包括口腔扁平苔蘚、口腔白斑、口腔黏膜下纖維化等[5]。

β-防御素-3（human β-defensin-3，hBD-3）是人天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，主要表達于上皮組織中，在炎癥性疾病、損傷修復以及腫瘤形成和轉移中均發(fā)揮重要的作用[6-8]。核因子-κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）是參與細胞增殖、分化、凋亡的重要核轉錄因子，與炎癥性腫瘤的發(fā)生密切相關[9-10]。近期研究發(fā)現hBD-3 能通過激活NF-κB 信號通路促進宮頸癌細胞生長[11]，但hBD-3 能否通過調節(jié)NF-κB 介導的炎癥反應參與OSCC 的進展尚缺乏研究。本研究將通過檢測正?？谇火つ?、OPMD、OSCC 組織中hBD-3 和NFκB p65 表達情況，探究hBD-3 和NF-κB p65 在口腔黏膜癌變過程中的表達規(guī)律及其相關性，為OSCC早期診斷和治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

選取中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院（以下簡稱“我院”）病理科2015 年1 月—2018 年12 月存檔的蠟塊中病理確診的OSCC 患者40 例，OPMD 患者60 例。其中60 例OPMD 組中包括口腔白斑20 例、口腔扁平苔蘚20 例、口腔黏膜下纖維化20 例。對照組選取15 例正?？谇火つ?，取自我院口腔外科拔除阻生牙及外傷的患者。收集上述患者的年齡、性別、吸煙飲酒史、病變部位、上皮異常增生等臨床資料。所有病例術前未經過任何治療，OPMD 組中未伴發(fā)其他系統(tǒng)性疾病及黏膜疾病。

1.2 試劑及方法

兔抗人hBD-3 多克隆抗體（美國NOVUS 公司，貨號：NB200-117）；兔抗人NF-κB p65 多克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號：TA890002）；即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒（福州邁新生物技術有限公司，貨號：KIT-5920）；DAB 顯色劑（福州邁新生物技術有限公司，貨號：DAB-0031）。

所有標本作4 μm 厚的連續(xù)切片，其中1 張作常規(guī)HE 染色，復片確診。免疫組化染色步驟按MaxVisionTM試劑盒說明書進行。抗原修復采用高壓熱修復。hBD-3 抗體工作濃度為1∶400，NF-κB p65 抗體工作濃度1∶600。用PBS 代替一 抗作空白對照。

1.3 結果判斷

免疫組化以胞漿和胞核出現棕黃色染色顆粒為陽性細胞，分別由2 位病理科醫(yī)師在高倍鏡（400×）下觀察5個不同視野（不少于200個細胞），按照參考文獻[6]進行評分。①陽性細胞比例打分：＜5%記為0 分，5%～＜25%記為1 分，25%～＜50%記為2 分，50%～＜75%記為3 分，75%～100%記為4 分；②染色強度評分：無（-），弱（+），中等（++），強（+++），分別記為0～3 分。標本免疫組化評分為上述2 項得分之和，得分0～1 分記為陰性（-），2～3 分為弱陽性（+），4～5 分為陽性（++），6～7 分為強陽性（+++）。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0 軟件進行分析。等級資料先采用Kruskal-Wallis H 秩和檢驗進行整體比較，然后采用Man-Whitney U 秩和檢驗進行兩兩比較；相關性分析采用Spearman 等級相關；計數資料以例數表示，采用χ2檢驗及Fisher 精確概率法。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 hBD-3 在OPMD 和OSCC 中的表達

hBD-3 陽性染色定位于細胞質和細胞核內，呈黃色或者棕黃色的顆粒，見圖1。OSCC 中hBD-3 的表達強度明顯高于正常組及OPMD 組（P ＜0.05），OPMD組顯著高于正常組（P ＜0.05），見表1。

圖1 各組中hBD-3 蛋白的表達（免疫組化染色，400×）

表1 各組hBD-3 表達強度的比較（例）

2.2 各組NF-κB p65 表達水平比較

NF-κB p65 陽性染色主要定位于細胞質內，呈黃色或者棕黃色的顆粒，見圖2。OSCC 中NF-κB p65 的表達強度明顯高于正常組及OPMD 組（P ＜0.05），OPMD 組顯著高于正常組（P ＜0.05），見表2。

表2 各組NF-kB p65 表達水平比較（例）

圖2 各組NF-κB p65 蛋白的表達（免疫組化染色，400×）

2.3 hBD-3、NF-κB p65 表達與臨床病理因素的關系

hBD-3、NF-κB p65 蛋白表達與患者的年齡、性別、吸煙飲酒史、病變部位均不相關（P ＞0.05），但與OPMD 上皮異常增生相關（P ＜0.05）。見表3。

表3 hBD-3、NF-κB p65 表達與OPMD 臨床病理因素的關系（例）

2.4 hBD-3 與NF-κB p65 表達的關系

結果顯示，hBD-3 與NF-κB p65 表達量呈正相關（r=0.355，P ＜0.001）。

表4 hBD-3 與NF-κB p65 表達之間的關系（例）

3 討論

OSCC 是頭頸部較常見的惡性腫瘤，預后較差，早發(fā)現、早診斷、早治療可以顯著提高其生存率。OPMD在組織學上多表現為上皮單純增生或異常增生，癌變率為5%～18%，上皮異常增生是OPMD 發(fā)展為OSCC 的高危因素[13]。因此，尋找能夠指示OPMD 癌變的早期分子標志物，將對降低OPMD 癌變率、提高OSCC的生存率具有重要意義。

hBD-3 定位于人染色體8p22～23 區(qū)域內，相對分子質量約為5 kD，具有較強的抗菌和免疫調節(jié)功能[14]。研究發(fā)現，hBD-3 在多種腫瘤組織中存在異常表達，過表達的hBD-3 能夠影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲遷移等生理過程從而參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[15]，其致癌機制尚不明確。目前有關hBD-3 在口腔黏膜癌變過程中的研究鮮見報道。本研究顯示正常口腔黏膜、OPMD、OSCC 中hBD-3 蛋白表達逐漸增強，提示hBD-3 的量變與口腔黏膜癌變有一定的相關性。OPMD 中上皮異常增生比無上皮異常增生組織中hBD-3 表達水平明顯升高，提示hBD-3 與口腔黏膜惡性轉化潛能有關。體外實驗顯示，外源性hBD-3 能促進OSCC 細胞株增殖，數量增多[16]。Shuyi 等[17]發(fā)現在OSCC 細胞株中沉默hBD-3 基因能降低腫瘤細胞增殖和侵襲能力。有學者提出上皮基底層區(qū)過表達的hBD-3 能與趨化因子受體結合招募單核/巨噬細胞到病變部位，誘導促腫瘤因子和炎癥因子的釋放，構建腫瘤相關微環(huán)境從而促使腫瘤發(fā)生[18-19]。

NF-κB 是一種轉錄調控因子，共有5種，其中p65是NF-κB 家族中的典型代表，常與p50、抑制蛋白IκB結合成無活性復合體存在于胞漿中，在外界因素作用下NF-κB p65 被激活，與IκB 解離，易位入核，啟動相關靶基因，構建腫瘤微環(huán)境，造成細胞的增殖、轉移等[10]。本研究結果顯示，在正?？谇火つぁPMD、OSCC 中NF-κB p65 表達強度呈遞增趨勢，正?？谇火つの匆姲吮磉_，OPMD 及OSCC 中出現了少數胞核表達，提示NF-κB p65 在OPMD 及OSCC 組織中存在活化現象，這提示在正?？谇火つぐ┳冞^程中，可能隨著NF-κB p65 的活化，促進細胞增殖和抑制凋亡基因的表達，引起細胞惡性轉化，促進OSCC 發(fā)生[20-21]。NF-κB p65 的表達與OPMD 上皮異常增生有關，提示NF-κB p65 可能在口腔黏膜早期癌變階段中起作用。

對于hBD-3 和NF-κB p65 在OPMD 癌變過程中的相互作用至今未見報道。本研究顯示hBD-3 與NF-κB p65 呈正相關，提示hBD-3 可能與NF-κB p65 通過協同作用來促進OSCC 的發(fā)生。Qian 等[22]發(fā)現hBD-3 表達水平與NF-κB 信號通路有關。hBD-3能通過細胞內化作用，與膜內PI（4,5）P2 結合，激活PI3K/Akt 信號通路，從而增加NF-κB 的轉錄活性[23]。NF-κB 信號通路活化后可以激活大量炎癥介質基因的表達，比如白細胞介素-1、腫瘤壞死因子-α等，而這些炎性細胞因子又能誘導hBD-3 表達[24]。體外細胞實驗表明當沉默hBD-3 基因后，NF-κB/p65 促進腫瘤細胞生長的能力明顯減弱[25]。目前，關于hBD-3 通過調控NF-κB 來影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制仍較少，本研究結果為將來探討這一機制在腫瘤中的作用提供了一定的理論基礎。

綜合上述研究成果，hBD-3 與NF-κB p65 的高表達可能參與了正常口腔黏膜向OPMD 及OSCC 的發(fā)生、發(fā)展，聯合檢測hBD-3 與NF-κB p65 的表達，不但有助于了解OSCC 的發(fā)生發(fā)展，而且為OPMD 癌變的早期檢測、治療選擇、預后判斷提供新方向。