羅梟磊 卡吾力·居買 孫清超 李德生 買地尼也提·尼亞孜 張力為 伊力亞爾·夏合丁

1.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胸外科，新疆烏魯木齊 830054；2.新疆維吾爾自治區(qū)食管癌研究所，新疆烏魯木齊 830054；3.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究院，新疆烏魯木齊 830054

食管癌是中國第六大癌癥，也是第四大癌癥死因，我國95%以上的食管癌為食管鱗狀細胞癌[1-2]。新疆是我國食管癌高發(fā)區(qū)之一，新疆食管癌發(fā)病率由高到低依次為哈薩克族、維吾爾族和漢族[3]。泛素樣蛋白D（ubiquitin D，UBD），又稱人白細胞抗原FAT10（human leukocyte antigen-F adjacent transcript 10，HLA-FAT10），屬于泛素樣蛋白家族中的一員，具有和泛素相似的性質、結構，能夠直接介導蛋白酶體降解途徑[4-5]。UBD在神經(jīng)、消化、泌尿系統(tǒng)等多種惡性腫瘤中均檢測到其高表達現(xiàn)象[6]。文獻報道部分腫瘤中高表達的UBD能夠促進惡性腫瘤的增殖、侵襲、轉移能力和放、化療抵抗性[7-11]，但其在食管鱗癌中的表達及臨床病理意義尚不明確。本研究采用PCR、免疫組織化學法、HE染色檢測UBD 在哈薩克族、維吾爾族和漢族3個民族食管鱗癌患者癌組織及癌旁組織中的表達情況，結合患者臨床病理資料探討其對不同民族食管鱗癌的影響及其臨床相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2011 年1 月—2014 年12 月在新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）收治并行食管癌根治術的患者。收集173 例食管癌患者的癌組織和癌旁正常組織（距癌組織＞5 cm 的正常食管黏膜組織），其中哈薩克族43 例，維吾爾族58 例，漢族72 例；年齡38～83 歲，中位年齡64 歲；男119 例，女54 例。腫瘤分期按第7 版UICC/AJCC 食管癌分期標準進行，組織學分類及分化程度據(jù)世界衛(wèi)生組織2010 年腫瘤組織學分類標準進行分級[12]。納入人群為食管鱗癌患者，來我院就診前未接受其他特殊治療及放、化療等。所有患者在簽署知情同意書后留取標本，本研究通過我院醫(yī)學倫理委員會的審查標準。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學法及HE 染色 食管鱗癌組織及癌旁組織經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片后進行免疫組織化學染色（EnVision 兩步法）及HE 染色。兔抗人UBD 單克隆抗體（ab192581）購自Abcam 公司，二抗通用型試劑盒（PV-6000）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。經(jīng)過預實驗一抗?jié)舛冗x用1∶100，陰性對照用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液，用宮頸癌陽性組織切片為陽性對照。步驟依次為抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶、血清封閉、加一抗4℃冰箱孵育、次日加二抗37℃恒溫箱孵育、加DAB 顯色劑、蘇木精復染、脫水、封片及鏡檢拍照。鏡檢采用雙盲法，由2 名高年資病理科醫(yī)師完成，每例切片均應分別對超過100個觀察細胞數(shù)的高倍鏡視野進行獨立評價，且高倍鏡視野不能少于5個（400×）。UBD 蛋白低表達與高表達的判定標準：結果由以下2 項評分的乘積來判定。①以切片中細胞著色深淺評分：細胞無著色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分；②以陽性細胞數(shù)在同類細胞數(shù)中所占百分比評分：無陽性細胞為0 分，陽性細胞占比1%～25%為1 分，＞25%～50%為2 分，＞50%～75%為3 分，＞75%～100%為4 分。2 項乘積為最終得分。得分≤4 分定義為低表達，得分＞4 分定義為高表達。

1.2.2 實時熒光定量PCR 采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測食管癌及癌旁組織中UBD mRNA表達水平。定量實驗使用（TaKaRa）寶生物工程有限公司（中國，大連）試劑盒完成。第一鏈反轉錄使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（perfect real time）第一鏈合成試劑盒（RR047A）熒光定量檢測使用abm?EvaGreen qPCR MasterMix-no dye 試劑盒。引物序列由陜西艾優(yōu)稷生物科技有限公司設計。見表1。采用Trizol 法提取食管癌組織和癌旁組織的總RNA，經(jīng)反轉錄獲得cDNA，以H-actin 為內參，進行實時PCR 檢測。反應條件：在95°C 下起始模板變性10 min，在94°C 下變性15 s，在60°C 下退火、延伸1 min，總共進行45個循環(huán)。PCR 反應體系由以下試劑或溶液組成：SYBR mix 10 μL，Primer F 1 μL，Primer R 1 μL，cDNA 1 μL 和蒸餾水7 μL。以H-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算UBDmRNA的相對表達水平。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，兩組間采用t 檢驗，多組間比較采用方差分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，采用χ2檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同民族食管癌鱗患者癌組織與癌旁組織中UBD mRNA 表達情況

不同民族癌及癌旁組織UBD mRNA 表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。三個民族癌組織中UBD mRNA 的表達水平高于對應癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 不同民族食管癌患者癌組織與癌旁組織中UBD mRNA 表達情況比較（）

表2 不同民族食管癌患者癌組織與癌旁組織中UBD mRNA 表達情況比較（）

注：UBD：泛素樣蛋白D

2.2 不同民族食管鱗癌患者UBD 的表達情況

本研究中173 對組織切片免疫組化及HE 染色結果顯示，UBD 在單民族食管鱗癌癌組織和對應癌旁組織中的表達均有差異，癌組織中較癌旁組織高表達，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。而UBD 在食管癌組織及癌旁正常組織的表達情況，不同民族比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表3、圖2。

圖2 UBD 在食管鱗癌癌組織及癌旁組織中的表達

表3 不同民族食管鱗癌患者UBD 的表達情況比較[例（%）]

2.3 UBD 在食管鱗癌中的臨床病理學意義

UBD 的表達與腫瘤TNM 分期、N 分期、分化程度及神經(jīng)脈管侵犯有關（P ＜0.05）。而UBD 表達與性別、年齡、T 分期、腫瘤大小和腫瘤部位等無關（P ＞0.05）。見表4。

表4 UBD 蛋白表達與食管癌患者臨床病理特征的關系[例（%）]

3 討論

自從1996 年UBD 被發(fā)現(xiàn)以后，已有大量的報道證實了UBD 在肝癌、肺癌、宮頸癌、乳腺癌、膠質瘤等多種腫瘤組織中均存在高表達情況。UBD 在肝癌中的高表達率甚至達90%[13]。UBD 目前在食管癌中的研究較少，新疆地區(qū)作為食管癌高發(fā)病區(qū)，進一步增加對該疾病的了解意義重大[14]。本研究結果顯示，UBD在癌組織中蛋白陽性表達率為42.8%，高于癌旁正常食管組織（12.7%），差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。提示UBD 可能與食管癌密切相關，與諸多腫瘤相關研究結論相一致[15-16]。

本研究結果顯示，低分化患者的UBD 蛋白的高表達在食管癌分化程度、N 分期、神經(jīng)脈管侵犯及TNM分期方面存在差異性，提示UBD 過表達與多民族食管癌患者具有相關性。本研究顯示，UBD 在食管鱗癌中具有促進食管鱗癌細胞轉移及侵襲潛能的可能性，進一步促進了食管癌的惡性發(fā)展。

UBD 腫瘤研究相關文獻發(fā)現(xiàn)，UBD 在多種惡性腫瘤中均具有促進腫瘤細胞侵襲及轉移的能力。①UBD促進肝癌細胞的侵襲能力：同源框基因B9（HOXB9）是Ⅰ類同源盒基因的一員，在胚胎發(fā)育及肢體形成中起著重要作用，HOXB9 的過度表達與肝癌的腫瘤大小以及血管侵襲能力有關，UBD 表達上調可通過非共價結合β 連環(huán)蛋白（β-catenin）阻止其泛素化和隨后被蛋白酶體降解，從而穩(wěn)定β-catenin/TCF4 信號通路誘導HOXB9 的表達增加，增強腫瘤細胞的侵襲能力[17-18]。②UBD 促進骨肉瘤細胞的侵襲和轉移能力：UBD 在骨肉瘤中也存在高表達現(xiàn)象，特別是在轉移性骨肉瘤中，其高表達與骨肉瘤患者預后不良相關。此外，沉默UBD 骨肉瘤細胞的侵襲和轉移能力受到明顯抑制移[19-20]。③UBD 促進肺鱗癌細胞的侵襲能力：在肺鱗癌中，UBD 可增強Hsp90/Akt 信號通路表達，促進肺鱗癌細胞增殖，增強腫瘤細胞的侵襲能力[21]。④UBD 促進乳腺癌的轉移能力：鋅指E 盒結合同源盒蛋白2（ZEB2）的表達增強被認為可以促進乳腺癌的轉移，UBD 可以直接與ZEB2 結合降低其泛素化，增強ZEB2 在乳腺癌細胞中的蛋白質穩(wěn)定性，從而間接增強乳腺癌細胞轉移能力[22-23]。⑤UBD 參與上皮-間質轉化發(fā)生過程：上皮-間質轉化能夠賦予細胞轉移和入侵的能力，研究發(fā)現(xiàn)UBD 激活AKT/Gsk3β 信號通路后可上調β-catenin 的表達及胞核轉位，βcatenin 入核后可以調控與細胞增殖和細胞周期相關的蛋白，如細胞周期蛋白D1、原癌基因蛋白質等，同時其還可以通過促進波形蛋白表達和抑制上皮型鈣黏附素（E-cadherin）表達而誘導上皮-間質轉化發(fā)生。此外，UBD 還可通過激活AKT/GSK3β 信號通路來調控E-cadherin 的上游調節(jié)蛋白，如鋅指蛋白和smad2/3等的表達，最終導致E-cadherin 的表達降低和上皮-間質轉化發(fā)生[24-26]。UBD 在惡性腫瘤發(fā)病及侵襲轉移中的以上機制，可能在食管鱗癌中也發(fā)揮著同樣的作用。

綜上，UBD 在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中可能具有重要影響作用，本研究探討了UBD 在3個民族食管鱗癌患者中的表達情況與臨床病理資料的相關性，后期將繼續(xù)結合患者生存資料進行生存分析，并觀察UBD在體內外對食管鱗癌的影響，從而進一步闡明UBD在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移中的具體機制。UBD可能成為食管鱗癌潛在的治療靶點或早期診斷、預后判斷的分子標志物。