黃麗玲, 李耘, 王珊珊, 陸超, 楊智敏, 林敏, 燕永亮, 陳明, 張維, 王勁, 周正富, 柯秀彬, 戰(zhàn)崳華, 陸偉

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所， 北京 100086)

硝酸鹽是植物、真菌及許多細(xì)菌生長(zhǎng)所需重要無(wú)機(jī)氮源。在有氧條件下將硝酸鹽轉(zhuǎn)化成氨的過(guò)程被稱(chēng)作硝酸鹽同化，該過(guò)程包含三個(gè)特異性步驟：由硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)完成的硝酸鹽吸收，進(jìn)入胞內(nèi)的硝酸鹽由同化硝酸鹽還原酶(nitrate reductase，NR)催化硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，隨后由同化亞硝酸鹽還原酶(nitrite reductase，NiR)催化亞硝酸鹽還原成氨，最終氨經(jīng)谷氨酰氨合成酶(glutamine synthetase，GS)催化生成谷氨酰胺摻入到中心代謝途徑。在氮循環(huán)系統(tǒng)中，硝酸鹽同化對(duì)藻類(lèi)等植物營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)的重要性早已通過(guò)大量研究得到認(rèn)可[1-3]，由于異養(yǎng)細(xì)菌的主要作用通常被認(rèn)為是分解和降解顆粒狀有機(jī)氮而鮮少受到關(guān)注，直到近些年異養(yǎng)細(xì)菌硝酸鹽同化研究才引起重視，例如：Rhodobactercapsulatus[4-5],Klebsiellaoxytoca[6-9],Azotobactervinelandii[10-16]和Bacillussubtilis[17-18]。

硝酸鹽和亞硝酸鹽均是帶電分子，不能快速穿越生物膜，特別是硝酸鹽(pKa=-1.3)需要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，而亞硝酸鹽通常被認(rèn)為可以不經(jīng)過(guò)特定蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)而通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散形式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[19-20]。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有兩種類(lèi)型：一類(lèi)是細(xì)胞周質(zhì)結(jié)合蛋白依賴(lài)系統(tǒng)，通常由ATP水解提供能量，屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，也被稱(chēng)作ATP驅(qū)動(dòng)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，例如K.oxytoca中的NasFED和Cyanobacteria中的NrtABCD；另一類(lèi)是依賴(lài)于質(zhì)子移動(dòng)勢(shì)的NarK家族轉(zhuǎn)運(yùn)，屬于主要協(xié)同超家族(major facilitator superfamily,MFS)，例如A.vinelandii中的NarK和Paracoccusdenitrificans中的NasA。

硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶是硝酸鹽同化的兩個(gè)關(guān)鍵酶，均存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。硝酸鹽還原酶都含有鉬輔因子和鐵-硫簇，真核生物中鉬輔因子是鉬-鉬喋呤(Mo-MPT)，而細(xì)菌中則是鉬-鳥(niǎo)苷二核苷酸鉬喋呤(Mo-MGD)，其催化中心由鉬輔因子和[4Fe-4S]簇組成[19]。電子供體在不同細(xì)菌中存在區(qū)別，在Azotobacter中是黃素氧還蛋白，而在Klebsiella 和 Bacillus中則來(lái)源于NAD(P)H還原態(tài)亞基[21]。亞硝酸鹽還原酶均含有西羅血紅素和鐵-硫簇，在植物和藍(lán)藻中電子供體為鐵氧還蛋白，而在細(xì)菌和真菌中電子來(lái)自于NADH和/或 NADPH[22]。

PseudomonasstutzeriA1501是一株分離自水稻根際的聯(lián)合固氮菌[34-36]，為適應(yīng)水稻田特殊的生存環(huán)境，該菌進(jìn)化出多樣氮轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，包括固氮、反硝化、硝酸鹽同化等。在水稻田淹水厭氧條件下，該菌能夠利用硝酸鹽作為電子受體進(jìn)行反硝化反應(yīng)，將硝酸鹽還原為氮?dú)獠@得能量；而在非淹水有氧條件下，該菌可以通過(guò)同化作用利用硝酸鹽為唯一氮源生長(zhǎng)；同時(shí)，在水稻根際微氧條件下，該菌還可以進(jìn)行固氮反應(yīng)，將氮?dú)廪D(zhuǎn)化成氨，供自身及植物生長(zhǎng)。2008年，燕永亮等[37]對(duì)該菌進(jìn)行了基因組測(cè)序，序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該菌包含一個(gè)49個(gè)基因組成的固氮基因簇[38]，一套完整的硝酸鹽呼吸系統(tǒng)[39]以及硝酸鹽/亞硝酸鹽同化基因簇。在此基礎(chǔ)上，本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)這套完整的硝酸鹽同化基因簇進(jìn)行研究和分析，為揭示P.stutzeriA1501硝酸鹽同化的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)進(jìn)一步闡明該菌硝酸鹽/亞硝酸鹽同化作用,對(duì)于理解細(xì)菌環(huán)境適應(yīng)機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及生長(zhǎng)條件

1.2 生物信息學(xué)分析

P.stutzeriA1501基因組序列已在GenBank上登記，登錄號(hào)為CP000304.1。采用NCBI中Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列比對(duì)，利用NCBI網(wǎng)站上保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)(conserved domain Database，CDD)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi.)分析蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域。

1.3 nasT和nasR基因非極性突變株及功能回補(bǔ)菌株的構(gòu)建

參考P.stutzeriA1501nasT和nasR序列設(shè)計(jì)引物(表1)，以基因組DNA為模板擴(kuò)增nasT和nasR5’上游序列，PCR產(chǎn)物和pK18mob 質(zhì)粒分別用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收目的片段，再分別將nasT和nasR5’上游片段連接到pK18mob載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，構(gòu)建重組大腸桿菌JM109nasT和JM109nasR。采用三親結(jié)合法[41]將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入P.stutzeriA1501中，利用同源交換原理將pK18mob整合插入到P.stutzeriA1501基因組相應(yīng)位置，經(jīng)卡那霉素篩選及PCR檢驗(yàn)，分別獲得nasT和nasR基因非極性突變菌株A15nasT和A15nasR。

表1 nasR、nasT非極性突變株與回補(bǔ)株構(gòu)建引物Table 1 Primers used in construction of the nasT, nasR mutants and complementary strains

利用分別帶有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的上下游引物擴(kuò)增nasT和nasR基因，PCR產(chǎn)物和廣宿主質(zhì)粒pLAFR3分別用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收目的片段，將nasT和nasR基因連接到pLAFR3載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒pLAFR3nasT和pLAFR3nasR，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。采用三親結(jié)合法[41]將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化P.stutzeriA1501，經(jīng)四環(huán)素壓力篩選及PCR驗(yàn)證獲得回補(bǔ)菌株Comp-A15nasT和Comp-A15nasR。

1.4 硝酸鹽攝取能力測(cè)定

參考Van等[45]方法測(cè)定胞內(nèi)硝酸鹽含量。12 000 r·min-1離心收集菌體(先測(cè)定菌株OD600吸光值，按照三種菌株總OD600數(shù)值相同收集適量的菌體)，用預(yù)冷的磷酸緩沖液洗菌三次，再用磷酸緩沖液重懸菌體，超聲破碎20 min，破碎液12 000 r·min-1離心收集上清液；0.5 mL的上清提取物中分別加入5 mL 0.55% Ca(CH3COO)2·H2O 溶于4% 氨水溶液，0.1 mL 1% MnSO4·4H2O 溶于5%乙酸溶液和0.1 g鋅粉，劇烈震蕩1 min，濾膜過(guò)濾反應(yīng)液，收集到的濾液放置冰上；2 mL濾液加入0.5 mL 1% sulfanilamide溶于5 mol·L-1HCl溶液，混勻后測(cè)量OD540值。

1.5 RT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 P. stutzeri A1501硝酸鹽同化基因簇分布

基因組序列比對(duì)分析顯示，P.stutzeriA1501在2 622 929～2 637 956和4 444 490～4 449 171各存在一個(gè)硝酸鹽同化相關(guān)基因簇(圖1)。

2.1.1基因簇1分析 基因簇1包含13個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)，從nasS至cobA(圖1)。nasSORF由1 449 bp核苷酸組成，編碼482個(gè)氨基酸，其后nasTORF由627 bp核苷酸組成，編碼208個(gè)氨基酸，這兩個(gè)基因之間有35 bp重疊，處于一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元。NasS編碼蛋白同源性比對(duì)顯示，該蛋白屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子底物結(jié)合蛋白，是Ⅱ型細(xì)胞周質(zhì)結(jié)合蛋白超家族中的一員，該超家族主要包含NrtA和CmpA蛋白，分別是硝酸鹽和碳酸氫鹽的受體結(jié)合蛋白，而NasT編碼蛋白含有ANTAR (AmiR and NasR transcription antitermination regulators)結(jié)構(gòu)域，其主要存在于一類(lèi)轉(zhuǎn)錄抗終止調(diào)節(jié)蛋白中[8,12,42]。上述兩個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)與已報(bào)道菌株的硝酸鹽同化兩組分調(diào)節(jié)蛋白NasS-NasT非常相似[12]，其中NasS序列與A.vinelandiiDJ NasS序列一致性為61.46%，NasT序列與A.vinelandiiDJ NasT序列一致性為78.85%，與P.denitrificansPD1222 NasS和NasT序列一致性分別為26.36%和36.84%[31]。

PST_2402、PST_2405和 PST_2408功能未知，PST_2403是個(gè)硫酯酶家族蛋白，PST_2404是1-磷酸果糖激酶家族己糖激酶，PST_2407推測(cè)為絲氨酸/蘇氨酸激酶。

nasA由1 212 bp核苷酸組成，編碼403個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示該蛋白是NarK/NasA家族硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于主要協(xié)同超家族(major facilitator superfamily，MFS)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，功能是跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽或亞硝酸鹽。

nirB由2 466 bp核苷酸組成，編碼821個(gè)氨基酸，其結(jié)構(gòu)類(lèi)似于亞硝酸鹽還原酶大亞基，屬于NirB超家族蛋白[NAD(P)/FAD-dependent oxidoreductase，NirB]。nirD由330 bp核苷酸組成，編碼109個(gè)氨基酸，該蛋白含有一個(gè)Rieske domain和一個(gè) [2Fe-2S] 簇結(jié)合位點(diǎn)，屬于NirD超家族蛋白[NAD(P)H-dependent nitrite reductase,NirD]。nasB由2 706 bp核苷酸組成，編碼901個(gè)氨基酸，該蛋白含有鉬喋呤二核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和[4Fe-4S]結(jié)構(gòu)域，與AzotobactervinelandiiDJ菌種NasB一致性為78.60%，該酶利用單核鉬輔因子催化硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。cobA由840 bp核苷酸組成，編碼279個(gè)氨基酸，該基因與上游基因有76個(gè)堿基的重疊，編碼尿卟啉-Ⅲ C-甲基轉(zhuǎn)移酶，該酶參與西羅血紅素合成，而西羅血紅素是亞硝酸還原酶的輔因子。

2.1.2基因簇2分析 第二個(gè)基因簇含有4個(gè)ORFs:nasR、nasF、nasE和nasD(圖1)。其中nasR由1 302 bp核苷酸組成，編碼433個(gè)氨基酸。該蛋白N端含有硝酸鹽/亞硝酸鹽感受結(jié)構(gòu)域(NIT)，C端含有抗轉(zhuǎn)錄終止因子結(jié)構(gòu)域(ANTAR)，與K.oxytocaM5a1 NasR結(jié)構(gòu)相似，序列一致性為30.80%，推測(cè)其功能也是感受硝酸鹽/亞硝酸鹽，起抗轉(zhuǎn)錄終止作用，正調(diào)節(jié)下游硝酸鹽同化操縱子的表達(dá)。

nasF至nasD處于同一操縱子，共同編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族蛋白。nasF編碼細(xì)胞周質(zhì)硝酸鹽/亞硝酸鹽結(jié)合蛋白，推測(cè)與NrtA功能類(lèi)似，與K.oxytocaM5a1 NasF序列一致性為38.03%；nasE編碼硝酸鹽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)透性酶，與NrtB功能類(lèi)似，與K.oxytocaM5a1 NasE序列一致性為39.39%；nasD編碼蛋白具有ATP結(jié)構(gòu)域，屬于ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與NrtC和NrtD功能類(lèi)似，與K.oxytocaM5a1 NasD一致性為62.21%。

2.2 nasT、nasR突變對(duì)硝酸鹽利用能力的影響

2.2.1硝酸鹽同化能力分析 生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，P.StutzeriA1501中存在兩個(gè)硝酸鹽同化基因簇，nasST-nasA-nirBDnasBcobA和nasR-nasFED，這樣的基因簇分布方式還未見(jiàn)報(bào)道。已有研究結(jié)果表明，硝酸鹽同化基因通常組成一個(gè)基因簇行使功能[14,17,46-48]。

從P.stutzeriA1501硝酸鹽同化基因排布情況推測(cè)NasS-NasT和NasR分別調(diào)控各自下游基因的表達(dá)，為驗(yàn)證上述推測(cè)，分別構(gòu)建了nasT和nasR基因突變株A15nasT和A15nasR，以及突變株回補(bǔ)菌株Comp-A15nasT和Comp-A15nasR。培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)表明，nasT和nasR突變均不影響菌株在銨鹽培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)，而在硝酸鹽培養(yǎng)基中nasR突變株生長(zhǎng)能力下降了約一半，nasT突變株則完全喪失了生長(zhǎng)能力。

2.2.2硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)能力分析 隨后測(cè)定了A15nasT和A15nasR突變株將硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)的能力(圖3)。結(jié)果表明，nasR突變硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降了約60%，而nasT突變對(duì)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)幾乎沒(méi)有影響。結(jié)合生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步判定NasR調(diào)控硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)，而NasT調(diào)控硝酸鹽/亞硝酸鹽還原。

2.3 硝酸鹽/亞硝酸鹽同化基因表達(dá)分析

為進(jìn)一步明確上述結(jié)果，對(duì)兩個(gè)突變株中主要硝酸鹽/亞硝酸鹽同化基因表達(dá)情況做了RT-qPCR分析(圖4)。在A15nasR突變株中調(diào)控基因nasST和硝酸鹽/亞硝酸鹽還原酶基因(nirBDnasBcobA)表達(dá)沒(méi)有顯著變化，但是硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因(nasFED)表達(dá)顯著下調(diào)；在A15nasT突變株中調(diào)控基因nasR和硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因(nasFED)表達(dá)沒(méi)有顯著變化，但是硝酸鹽/亞硝酸鹽還原酶基因(nirBDnasBcobA)表達(dá)顯著下調(diào)。

上述結(jié)果表明，在P.stutzeriA1501中，NasS-NasT系統(tǒng)調(diào)控該菌同化硝酸鹽/亞硝酸鹽還原酶基因的表達(dá)，NasR調(diào)控硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)，而NasS-NasT和NasR之間沒(méi)有調(diào)控關(guān)系。

3 討論

3.1 P. stutzeri A1501同化硝酸鹽/亞硝酸鹽相關(guān)基因命名

歷史上由于對(duì)硝酸鹽/亞硝酸鹽代謝研究階段及對(duì)象的不同，研究人員不可避免的對(duì)不同生物中同源基因給予了不同命名，至今也沒(méi)有統(tǒng)一，給后續(xù)研究帶來(lái)了一定的困擾。例如ABC同化硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)包括細(xì)胞周質(zhì)結(jié)合蛋白、膜蛋白和ATPase，在Cyanobacteria中上述蛋白編碼基因命名為nrtA、nrtB和nrtCD，在K.oxytoca中則命名為nasF、nasE和nasD；MFS家族硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因在P.denitrificans和B.subtilis中命名為nasA，在A.vinelandii和Methylococcuscapsulatus中命名為narK。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)、相似度以及為了區(qū)分硝酸鹽呼吸系統(tǒng)中narK基因，本研究暫將P.stutzeriA1501中這兩類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因分別命名為nasFED和nasA。

同化硝酸鹽還原酶編碼基因在P.denitrificans和B.subtilis中命名為nasC，在A.vinelandii和K.Pneumoniae342中命名為nasB，R.capsulatus和Haloferaxmediterranei中命名為nasA，在PseudomonasentomophilaL48中命名為narB，根據(jù)基因相似度將P.stutzeriA1501中同化硝酸鹽還原酶暫命名為nasB。

同化亞硝酸鹽還原酶大亞基編碼基因在A.vinelandii中命名為nasA，在P.denitrificans和K.Pneumoniae342中命名為nasB，在B.subtilis和H.mediterranei中命名為nasD，在R.capsulatus和P.entomophilaL48中命名為nirB。而同化硝酸鹽還原酶小亞基在R.capsulatus、A.vinelandii、P.entomophilaL48和M.capsulatus中命名為nirD，在P.denitrificans命名為nasG，在B.subtilis命名為nasE。根據(jù)基因相似度將P.stutzeriA1501中同化亞硝酸鹽還原酶大、小亞基編碼基因暫命名為nirB和nirD。

編碼尿卟啉-Ⅲ C-甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因在R.capsulatus菌中命名為cysG；在A.vinelandii菌中命名為nasH，在B.subtilis中命名為nasF。根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果將P.stutzeriA1501暫命名為cobA。

P.stutzeriA1501同化硝酸鹽/亞硝酸鹽相關(guān)基因命名之所以沒(méi)有完全按照nas(nitrate assimilation)系列來(lái)命名，主要原因有兩點(diǎn)：①學(xué)界對(duì)同化硝酸鹽/亞硝酸鹽還原相關(guān)基因命名比較混亂；②初步研究證明,上述基因參與了同化硝酸鹽/亞硝酸鹽代謝，但是其中一些基因是否同時(shí)參與該菌其他氮代謝途徑還有待進(jìn)一步研究。盡管在P.stutzeriA1501基因組中存在一套完整的呼吸型亞硝酸鹽還原酶(NIR)編碼基因[39]，但是處于同化硝酸鹽/亞硝酸鹽代謝基因簇內(nèi)的亞硝酸鹽還原酶仍有可能同時(shí)參與呼吸型亞硝酸鹽還原反應(yīng)。因此，本研究對(duì)P.stutzeriA1501菌同化硝酸鹽/亞硝酸鹽代謝相關(guān)基因命名主要基于編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征和序列相似度，不排除今后根據(jù)對(duì)其功能深入研究后修正基因命名。

3.2 P. stutzeri A1501硝酸鹽同化轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)編碼基因分析

基因組序列分析表明，P.stutzeriA1501同化硝酸鹽基因簇中含有兩類(lèi)硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，分別依賴(lài)于質(zhì)子移動(dòng)勢(shì)的MFS家族蛋白NarK/NasA和ATP驅(qū)動(dòng)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NasFED。當(dāng)阻斷nasFED基因表達(dá)時(shí)，該菌并沒(méi)有完全喪失硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)能力(降低60%)，表明該菌還有其他硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，推測(cè)是NasA蛋白，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。另外，該菌在硝酸鹽反硝化系統(tǒng)中還存在NarK蛋白和NarM蛋白[39]。盡管目前尚不清楚氮氧化物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，但已知NarK類(lèi)蛋白即參與了硝酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)，也參與了亞硝酸鹽的泵出[49]，有些菌株中會(huì)存在另一個(gè)NarK-like蛋白，例如E.coli中的NarU蛋白，它們的功能并不完全一致，NarU蛋白主要功能是促進(jìn)亞硝酸鹽泵出[50]。根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域分析,NasA和NarK、NarM均屬于依賴(lài)于質(zhì)子移動(dòng)勢(shì)類(lèi)硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，但它們的氨基酸序列一致性并不高(<20%)，由于它們處于不同轉(zhuǎn)錄單元，基因表達(dá)受不同蛋白調(diào)控，因此推測(cè)它們各自在不同系統(tǒng)中發(fā)揮作用。同化硝酸鹽還原不同于異化硝酸鹽還原，能力供應(yīng)較容易獲得，所以ATP驅(qū)動(dòng)的硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)就成為主要方式，因此推測(cè)P.stutzeriA1501同化硝酸鹽還原過(guò)程中硝酸鹽/亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)主要依賴(lài)于NasFED。

3.3 P. stutzeri A1501硝酸鹽同化特異性調(diào)控編碼基因分析

在已報(bào)道的同化硝酸鹽/亞硝酸鹽系統(tǒng)中，途徑特異性調(diào)控要么由雙組分的NasS-NasT執(zhí)行，要么由單一組分的NasR執(zhí)行，目前還沒(méi)有關(guān)于在同一個(gè)菌株中同時(shí)存在NasS-NasT和NasR的報(bào)道。本研究初步證明在P.stutzeriA1501中，NasS-NasT調(diào)控硝酸鹽/亞硝酸鹽還原酶編碼基因的轉(zhuǎn)錄，NasR調(diào)控硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄，推測(cè)硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)與還原是分開(kāi)進(jìn)行的。由于并未發(fā)現(xiàn)NasS-NasT與NasR之間具有相互調(diào)控作用，因此目前尚不清楚該菌硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)與還原過(guò)程的協(xié)調(diào)機(jī)制。