張娜娜, 李雙民, 溫曉蕾, 馮麗娜, 王俊鳳, 楊文杰, 霍佳歡, 蘭淑慧, 孫偉明*, 齊慧霞*

(1.河北科技師范學院農(nóng)學與生物科技學院, 河北 秦皇島 066600; 2.河北省昌黎縣職業(yè)技術(shù)教育中心， 河北 秦皇島 066600; 3.河北農(nóng)業(yè)大學植物保護學院, 河北 保定 071002)

中國是板栗生產(chǎn)大國，種植栽培面積和產(chǎn)量均居世界前列[1]。近年來，隨著板栗產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，栽培面積不斷擴大，病害發(fā)生逐年加重。板栗在貯藏期由于果實呼吸旺盛，極易受微生物侵染而腐爛變質(zhì)。板栗貯藏期腐爛主要由多種真菌復合侵染造成，梁麗松等[2]對北京、山東、湖南等地板栗果實腐爛病共鑒定出11個病原菌屬，分別是大莖點屬(Macrophomasp.)、鐮孢菌屬(Fusariumsp.)、擬莖點霉屬(Phomopsissp.)、擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsissp.)、刺盤孢屬(Colletotrichumsp.)、莖點霉屬(Phomasp.)、小穴殼屬(Dothiorellasp.)、毛霉屬(Mucorsp.)、鏈格孢屬(Alternariasp.)、絲核菌屬(Rhizoctoniasp.)、青霉菌屬(Penicilliumsp.)。吳光金等[3]在腐爛栗果上檢測到13個真菌屬，1個細菌屬，認為泡囊假單胞桿菌(PseudomonasvesicularisGalarneaultetLeifson)和多主小穴殼菌(DothiorellaribisGrossetDuggur)是主要的致腐菌。貯藏期紅粉病是由粉紅單端孢菌(Trichotheciumroseum)引起的，主要危害板栗栗果，發(fā)病初期形成褐色病斑，并在病斑處附著白色粉狀物，隨后病斑緩慢擴展，可蔓延整個果面，后期在病斑處著生大量粉色霉層，發(fā)病果仁失水變僵、變苦，并能產(chǎn)生毒素。目前，對于紅粉病的研究集中在菜豆紅粉病[4]、芒果果腐病[5]、蘋果霉心病[6]、甜瓜粉霉病[7]、龍眼紅粉病[8]、棗紅粉病[9]、番茄紅粉病[13]、棉鈴紅粉病[14]、黃瓜紅粉病[15]等，對板栗的研究較少。本文對板栗紅粉病病原菌進行了分離純化，采用形態(tài)學及分子生物學方法進行了病原鑒定，同時研究了該病原菌的生物學特性,旨在明確板栗紅粉病的病原,了解其特性,明確其最適生長環(huán)境條件,為病害的識別和防控提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病果采集自河北省唐山市遷西市栗園，品種為早豐。

PDA培養(yǎng)基：水1 000 mL，馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g。

1.2 病原菌的分離純化

采用組織分離法[10]分離和純化病原菌，從栗果的病健交界處切取5 mm×5 mm的組織塊，將組織塊用75%乙醇表面消毒30 s,無菌水沖洗3次，最后用滅菌濾紙吸干表面水分，接種至PDA培養(yǎng)基上，每皿3塊，25 ℃恒溫箱(ZGZ-450，上海丙林電子科技有限公司)中倒置培養(yǎng)5 d，待菌落長出后挑取菌落邊緣處，接種到新的PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)純化，純化后轉(zhuǎn)入斜面試管4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌的形態(tài)學鑒定

將供試菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)10 d，觀察病原菌在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，從菌落表面挑取培養(yǎng)物，蔡司顯微鏡(Primo Star)觀察菌絲形態(tài)及孢子情況，測量孢子大小，進行形態(tài)學鑒定[10-11]，初步確定病原菌分類地位。

1.4 致病性鑒定

根據(jù)柯赫氏法則[10]，采用離體接種法檢測病原菌的致病性。選取健康板栗栗果，75%乙醇表面消毒后用無菌水沖洗2遍，用針刺法在果仁接種部位制造傷口，取7 mm活化后的菌絲塊接種于果仁的傷口部位，保鮮膜固定，以無菌水作為對照，置于培養(yǎng)皿(直徑150 mm)中25 ℃條件下保濕培養(yǎng)，24 h后去掉菌餅，記錄發(fā)病情況，分離發(fā)病栗果病原菌，與原接種菌進行比較。

1.5 病原菌的分子鑒定

從培養(yǎng)5 d的菌株上挑取適量菌絲，放入1.5 mL滅菌離心管里，用研磨機將其磨碎，利用DNA基因組試劑盒(康為世紀生物科技有限公司)提取DNA。對病原菌進行ITS序列擴增，所用引物為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[12]。PCR反應總體積25 mL，包含上下引物各1 mL，DNA模板2 mL，ddH2O 12.5 mL，2×EsTaqMasterMix 8.5 mL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min， 32個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，合格樣品送往生工(上海)公司測序。將測序所得菌株DNA-ITS序列與NCBI中ITS區(qū)相關(guān)序列比較同源性，用MEGA-X軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 病原菌的生物學特性研究

1.6.1培養(yǎng)基篩選 參照王勇等[13]和潘月敏等[14]方法篩選培養(yǎng)基：將直徑為0.7 cm的病原菌菌餅分別放入番茄培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基、板栗培養(yǎng)基、胡蘿卜培養(yǎng)基、綠豆培養(yǎng)基、玉米培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、馬丁培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基平板中央，每處理重復3次，25 ℃條件下恒溫培養(yǎng)8 d，采用十字交叉法測量菌落的直徑。

培養(yǎng)10 d后，在每個平板中加入10 mL的無菌水，制成孢子懸浮液，使用血球計數(shù)板在10×10倍的生物顯微鏡測定產(chǎn)孢量。

1.6.2碳源、氮源篩選 碳源：以PDA為基礎培養(yǎng)基，分別用阿拉伯糖樹膠粉、α-乳糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖、D-木糖醇、葡萄糖、可溶性淀粉作為唯一碳源。

氮源：以PDA為基礎培養(yǎng)基，添加硫酸銨、蛋白胨、氯化銨、硝酸鈉、酵母膏、牛肉膏、硝酸鉀作為氮源。

病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢的測定方法同1.6.1。

1.6.3pH篩選 用0.1%的NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基，使其pH為5、6、7、8、9、10、11、12。打取0.7 cm病原菌菌餅放在培養(yǎng)基平板的中央，3次重復，25 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢的測定方法同1.6.1。

1.6.4溫度篩選 打取0.7 cm病原菌菌餅放入PDA培養(yǎng)基平板中央，分別置于5、10、15、20、25、30、35 ℃進行培養(yǎng)，3次重復，病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢的測定方法同1.6.1。

1.6.5光照篩選 打取0.7 cm病原菌菌餅置于PDA培養(yǎng)基平板的中央，將光照條件設為24 h光照、12 h光暗交替、24 h黑暗，25 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，3次重復，病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢的測定方法同1.6.1。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用DPS 2005和SigmaPlot 12.5軟件分析和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的菌落及形態(tài)特征

病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)8 d，菌落直徑為6.78 cm。PDA培養(yǎng)基上病原菌菌落圓形或近圓形、粉狀、邊緣整齊，具有同心輪紋，生長初期菌絲為白色，后期菌落中央橘粉色，邊緣淺白色(圖1)，分生孢子梗形態(tài)直立或彎曲狀態(tài)、褐色，具有分支，分生孢子著生于分生孢子梗頂端，分生孢子無色透明、單胞、梨形、表面光滑，有橫膈膜0～1個，不具有縱膈膜，隔膜處縊縮(圖1)，分生孢子大小為5.465 mm×13.526 mm～11.504 mm×20.531 mm。經(jīng)形態(tài)學鑒定,該病原初步確定為粉紅單端孢菌(Trichotheciumroseum)。

2.2 致病性鑒定

板栗離體果仁經(jīng)刺傷接種3 d后開始發(fā)病，癥狀初期在傷口部位可見明顯的黑褐色病斑，病斑處著生白色霉層，隨后病斑緩慢向周圍擴展,接種10 d后病斑處著生大量橘粉色霉層，無菌水對照處理未發(fā)病(圖2)，根據(jù)柯赫氏法則，該病原菌能從接種發(fā)病的果仁上重新分離，得到與最初分離并用于接種的病原菌形態(tài)特征一致，說明分離的病原菌為引起板栗紅粉病的致病病原菌。

2.3 病原菌分子鑒定

經(jīng)測序，病原菌rDNA-ITS序列片段大小為613 bp,將所得rDNA-ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行blast比對，Blast比對結(jié)果顯示，該病原菌的rDNA-ITS序列與粉紅單端孢菌(Trichotheciumroseum.MN882763)的序列相似性為100%，聚為一個分支，能夠與其他的種類分開，結(jié)合形態(tài)學特征及分子生物學技術(shù)鑒定結(jié)果，確定造成板栗紅粉病的致病原菌為粉紅單端孢菌(Trichotheciumroseum)。

2.4 病原菌的生物學特性分析

2.4.1培養(yǎng)基對病原菌的影響 病原菌在不同培養(yǎng)基上生長及產(chǎn)孢情況如圖4所示：該病原菌在PDA、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長最好，8 d后菌落直徑分別為6.78和6.67 cm，產(chǎn)孢量分別為1.52×107和2.02×107cell·L-1，其次為綠豆、板栗培養(yǎng)基，燕麥培養(yǎng)基最不適合該病原菌的生長及產(chǎn)孢，其菌落直徑為2.90 cm，產(chǎn)孢量為0.20×107cell·L-1。

2.4.2碳源和氮源對病原菌的影響 病原菌對不同碳源的利用如圖5所示：病原菌在不同碳、氮源上均能生長，其中對碳源阿拉伯樹膠粉、可溶性淀粉利用最好，適合菌絲生長，8 d后菌落直徑分別為6.25和5.80 cm，但阿拉伯樹膠粉不利于病原菌的產(chǎn)孢，僅為0.58×107cell·L-1，對α-乳糖的利用較低，但其利于病原菌的產(chǎn)孢，達到3.05×107cell·L-1。

氮源蛋白胨、牛肉膏適合菌絲的生長(圖6)，8 d菌落直徑分別為6.33和5.83 cm，并且蛋白胨也利于該病原菌的產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量為1.73×107cell·L-1，硝酸鈉不利于菌絲的生長，菌落直徑為4.72 cm，硫酸銨不利于產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量僅為0.48×107cell·L-1。

2.4.3pH對病原菌的影響 由圖7可知，該病原菌在pH 5～12的范圍內(nèi)均能生長，其中在pH 8的條件下菌絲生長較快，菌落直徑為6.73 cm，在pH 12時菌絲生長最慢，菌落的直徑為3.25 cm，說明該病原菌菌絲不適合在強堿的環(huán)境條件下生存，在pH 7時產(chǎn)孢數(shù)量最多，數(shù)量為1.13×107cell·L-1，pH 5時產(chǎn)孢數(shù)量最少，pH 10與pH 9處理之間差異不顯著，pH 7與pH 5之間差異不顯著。

2.4.4溫度對病原菌生長和產(chǎn)孢的影響 溫度對病原菌影響較大(圖8)，在10～30 ℃時，可以正常生長，當?shù)蜏? ℃、高溫35 ℃時，該病原菌停止生長及產(chǎn)孢，當培養(yǎng)溫度為25 ℃時，最適合菌絲生長及產(chǎn)孢，菌落直徑為6.78 cm，產(chǎn)孢量為1.55×107cell·L-1；20 、15 ℃時生長次之，而溫度為30 、10 ℃時菌絲生長較慢，不利于其產(chǎn)孢。

2.4.5光照對病原菌生長和產(chǎn)孢的影響 病原菌的生長及產(chǎn)孢對光照有一定要求(表1)，12 h光暗交替最適合菌絲的生長及產(chǎn)孢，菌落直徑為6.78 cm，產(chǎn)孢量為1.55×107cell·L-1；24 h光照有利于菌絲生長但不利于病原菌的產(chǎn)孢；無光照條件時，菌絲生長緩慢，菌落直徑為4.35 cm。

表1 光照對病原菌生長的影響Table 1 Effects of light on growth of pathogen

3 討論

本研究結(jié)合形態(tài)學特征、致病性及ITS基因序列，明確了引起板栗紅粉病的致病原菌為粉紅單端孢菌(Trichotheciumroseum)，該菌屬半知菌亞門真菌[15]，發(fā)病初期形成褐色病斑，病斑可蔓延整個果面，后期在病斑處著生大量粉色霉層。本研究對其病原菌進行系統(tǒng)研究，生物學特性研究結(jié)果表明,該病原菌菌絲在10～30 ℃范圍內(nèi)均能生長,但在低溫下菌絲生長緩慢,5 ℃停止生長,適宜生長溫度為25 ℃；pH 5～12環(huán)境中菌絲均能生長,pH 8最適生長，在pH 7時產(chǎn)孢數(shù)量最多；在供試的碳氮源中,以阿拉伯樹膠粉有利于菌絲的生長，α-乳糖有利其產(chǎn)孢；在氮源蛋白胨上均利于其產(chǎn)孢和菌絲的生長；光暗交替有利于菌絲的生長和孢子的形成；在牛肉膏蛋白胨上均利于菌絲的生長與孢子的形成。劉文鈺等[16]報道的結(jié)果顯示，菌絲生長最適合的氮源是蛋白胨，25 ℃時菌絲生長最旺盛，12 h光暗交替時菌絲生長最好，與本研究結(jié)果相一致。焦瑞蓮等[17]研究顯示，T.roseum菌絲在5和40 ℃不再生長，菌絲生長的最適溫度為25 ℃，以25 ℃條件下產(chǎn)孢最多，與本文的研究結(jié)果基本相一致。王勇等[13]研究結(jié)果表明，在pH 6時最適宜菌絲的生長，pH 5時適宜產(chǎn)孢，與本文研究結(jié)果不一致，可能是由于不同的地域?qū)е聝烧咧g的生物學特性存在一定差異。本研究為冀東地區(qū)板栗紅粉病的針對性防治提供了理論依據(jù)，而該病原菌對不同板栗品種的致病性、侵染特性以及防控等方面還需進一步研究探討。