張勝珍, 馬艷芝

(唐山師范學(xué)院生命科學(xué)系， 河北 唐山 063000)

當(dāng)前，日益嚴(yán)重的土壤鹽漬化問(wèn)題已成為制約全世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素之一[1]。在鹽漬化土壤中，高濃度的鹽離子(主要是Na+和Cl-)會(huì)使土壤水勢(shì)下降，造成植物根系吸水困難，形成生理干旱；同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生離子毒害，影響植物對(duì)其他離子的吸收(如K+、Ca2+等)，造成礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)虧缺與營(yíng)養(yǎng)失衡。高濃度的鹽分還會(huì)破壞質(zhì)膜透性，使植物生理代謝發(fā)生紊亂，最終造成植物生長(zhǎng)發(fā)育不良，產(chǎn)量降低、品質(zhì)變劣，甚至植株死亡[2-3]。我國(guó)是土壤鹽漬化非常嚴(yán)重的國(guó)家之一[4]，對(duì)大面積鹽漬化土壤進(jìn)行恢復(fù)改良和開(kāi)發(fā)利用是當(dāng)前農(nóng)業(yè)科研中非常重要的研究方向。

鈣是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，具有極其重要的生理功能[5-6]。近年來(lái)，鈣在植物抗逆反應(yīng)中的作用受到廣泛關(guān)注。研究表明，在鹽脅迫下適量添加外源鈣不僅可以緩解因鈣素不足而導(dǎo)致的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)虧缺，還可以增強(qiáng)生物膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，降低質(zhì)膜透性，從而控制離子的選擇吸收[7]。此外，由于鈣素是偶聯(lián)胞外信號(hào)與胞內(nèi)生理反應(yīng)的第二信使[8]，因此適量添加外源鈣可以保證鈣信號(hào)系統(tǒng)的正常發(fā)生和傳遞，從而增強(qiáng)植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)，減輕鹽脅迫對(duì)植物的傷害[9]。

荊芥(SchizonepetatenuifoliaBriq.)為唇形科荊芥屬草本植物，其地上部干燥后可入藥，用于感冒、頭痛、麻疹、風(fēng)疹、瘡瘍初起等疾病的治療，為我國(guó)傳統(tǒng)的常用大宗類中藥材之一[10]。由于野生資源的不斷減少，目前荊芥以人工栽培為主，主要分布于河北、江蘇、浙江、東北三省等地區(qū)[11]。前人對(duì)荊芥的研究主要集中在栽培技術(shù)、化學(xué)成分、藥理活性及臨床應(yīng)用等方面[12-15]。作為荊芥主產(chǎn)區(qū)的華北和東北地區(qū)存在較嚴(yán)重的土壤鹽漬化問(wèn)題[4]，但關(guān)于荊芥鹽脅迫的相關(guān)研究較少，利用外源物質(zhì)緩解荊芥鹽脅迫的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。種子在鹽脅迫環(huán)境中順利萌發(fā)成苗是植物在鹽漬化土壤中生長(zhǎng)發(fā)育的前提。鑒于此，本研究采用氯化鈣對(duì)荊芥種子進(jìn)行浸種處理，研究其對(duì)鹽脅迫下荊芥種子萌發(fā)及幼苗生理特性的影響，尋找緩解荊芥鹽脅迫的最適氯化鈣浸種濃度，并探索其作用機(jī)理，以期為荊芥在鹽漬土地區(qū)的栽培生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取大小均勻、健康飽滿的荊芥種子作為試驗(yàn)材料，由北京同仁堂河北中藥材有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)及前期研究結(jié)果，選擇對(duì)種子發(fā)芽抑制率在50%左右的150 mmol·L-1NaCl作為鹽脅迫處理濃度。氯化鈣設(shè)置2.5(Ca2.5)、5.0(Ca5)、10.0(Ca10)、20.0(Ca20)、40.0(Ca40) mmol·L-1共5個(gè)濃度進(jìn)行浸種處理。選取飽滿的荊芥種子，用0.1%的高錳酸鉀消毒10 min，蒸餾水沖洗干凈后，用不同濃度氯化鈣溶液浸種24 h。將浸種后的種子放入墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿100粒，加入150 mmol·L-1NaCl溶液，每處理重復(fù)3次。另設(shè)蒸餾水對(duì)照(CK0)及鹽脅迫對(duì)照(CK150)2個(gè)對(duì)照處理。蒸餾水對(duì)照的種子采用蒸餾水浸種24 h，然后加入蒸餾水培養(yǎng)。鹽脅迫對(duì)照的種子采用蒸餾水浸種24 h，然后加入150 mmol·L-1NaCl溶液培養(yǎng)，具體操作方法與氯化鈣處理相同。將培養(yǎng)皿置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽培養(yǎng)，每天觀察記錄荊芥種子的發(fā)芽情況，并計(jì)算發(fā)芽勢(shì)(germination energy,GE)、發(fā)芽率(germination rate,GR)、發(fā)芽指數(shù)(germination index,GI)、活力指數(shù)(vital index,VI)等。于處理第13 d時(shí)測(cè)定幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮重等生長(zhǎng)指標(biāo)及相關(guān)生理指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1種子萌發(fā)指標(biāo)測(cè)定 以胚根長(zhǎng)度為種子長(zhǎng)度1/2時(shí)作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽情況，按以下公式計(jì)算發(fā)芽指標(biāo)[16]。

發(fā)芽勢(shì)(GE)=前3 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

(1)

發(fā)芽率(GR)=7 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

(2)

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)

(3)

式中，Gt為t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

活力指數(shù)(VI)=GI×S

(4)

式中，S為第7天的平均苗重。

1.3.2幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定 取荊芥幼苗，用濾紙吸干表面的水分，采用游標(biāo)卡尺測(cè)量幼苗的株高和根長(zhǎng)，每處理測(cè)定10株，重復(fù)3次；采用分析天平測(cè)定幼苗的鮮重，每處理20株，重復(fù)3次。

1.3.3幼苗生理指標(biāo)的測(cè)定 丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[17]；脯氨酸含量測(cè)定采用酸性茚三酮法[17]；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[17]；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑法[17]、過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[18]、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活性測(cè)定采用紫外吸收法[17]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖，采用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 氯化鈣對(duì)鹽脅迫下荊芥種子萌發(fā)的影響

不同處理下荊芥種子的萌發(fā)情況見(jiàn)表1。與CK0處理相比，CK150處理的種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)分別降低52.94%和55.99%，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別降低53.62%和72.32%，表明150 mmol·L-1NaCl脅迫對(duì)荊芥種子萌發(fā)有顯著的抑制作用。用氯化鈣浸種處理后，隨氯化鈣濃度的增加，荊芥種子在鹽脅迫下的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等各項(xiàng)指標(biāo)均呈先升高后降低的趨勢(shì)。5個(gè)氯化鈣處理中，Ca2.5處理的各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)最低，種子發(fā)芽率僅為45.00%，發(fā)芽勢(shì)僅為39.67%，與CK150對(duì)照無(wú)顯著差異；其余氯化鈣濃度處理的荊芥種子各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)均顯著高于CK150對(duì)照，其中，Ca20處理荊芥種子的各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)均為最高，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)分別為CK150對(duì)照的1.73和1.89倍，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別為CK150對(duì)照的1.87和2.45倍。綜上所述，較高濃度的氯化鈣浸種可以有效緩解NaCl脅迫對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用，且20 mmol·L-1氯化鈣效果最顯著。

表1 氯化鈣浸種后鹽脅迫下荊芥種子的萌發(fā)Table 1 Seed germination of Schizonepeta tenuifolia Briq. of seed soaking with CaCl2 under salt stress

3.2 氯化鈣對(duì)鹽脅迫下荊芥幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

不同處理下荊芥幼苗的生長(zhǎng)見(jiàn)表2。與CK0對(duì)照相比，CK150處理荊芥幼苗生長(zhǎng)受到明顯的抑制，株高、根長(zhǎng)及鮮重分別降低74.26%、38.00%和30.28%。用氯化鈣對(duì)荊芥種子浸種處理后，隨著氯化鈣溶液濃度的增加，荊芥幼苗的株高、根長(zhǎng)和鮮重均呈先增加后降低的趨勢(shì)，其中，CK20處理的株高、根長(zhǎng)和鮮重等指標(biāo)均為最大，且顯著高于CK150對(duì)照，分別為CK150對(duì)照的1.54、1.41和1.24倍；但仍低于CK0對(duì)照，尤其是株高僅為CK0對(duì)照的39.60%。

3.3 氯化鈣對(duì)鹽脅迫下荊芥幼苗生理生化指標(biāo)的影響

3.3.1氯化鈣浸種對(duì)鹽脅迫下荊芥幼苗丙二醛含量的影響 植物在逆境條件下會(huì)發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用。丙二醛是膜脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物之一，其含量的高低可反映膜質(zhì)過(guò)氧化程度和膜系統(tǒng)受損狀況[19]。從圖1可知，與CK0對(duì)照相比，CK150處理荊芥幼苗中丙二醛的含量大幅升高，表明荊芥幼苗在150 mmol·L-1NaCl脅迫下細(xì)胞膜受到了嚴(yán)重?fù)p傷。用氯化鈣浸種處理后，荊芥幼苗中丙二醛含量隨氯化鈣濃度的增大先降低后升高。除Ca2.5處理外，其他處理幼苗中丙二醛含量均顯著低于CK150對(duì)照。其中Ca20處理幼苗中丙二醛的含量最低，較CK150對(duì)照降低46.40%。以上結(jié)果表明，氯化鈣浸種可以降低荊芥幼苗的膜脂過(guò)氧化水平，減輕荊芥幼苗在鹽脅迫下的膜損傷程度，且20 mmol·L-1氯化鈣浸種效果最好。

3.3.2氯化鈣浸種對(duì)鹽脅迫下荊芥幼苗抗氧化酶活性的影響 不同處理下荊芥幼苗中抗氧化酶活性表明(圖1)，CK150處理荊芥幼苗中SOD、POD和CAT活性較CK0對(duì)照分別降低了70.73%、36.66%和49.93%。氯化鈣浸種處理后，荊芥幼苗的SOD活性隨氯化鈣濃度的增加先大幅升高，而后小幅降低；各濃度處理的SOD活性均顯著高于CK150對(duì)照。POD和CAT活性的變化趨勢(shì)與SOD基本一致，均隨氯化鈣濃度的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，但變幅較小。低濃度(<5 mmol·L-1)的氯化鈣處理幼苗中POD和CAT活性較CK150對(duì)照相比雖有所升高，但差異不顯著；中高濃度(≥5 mmol·L-1)的氯化鈣處理幼苗中POD和CAT活性顯著高于CK150對(duì)照。其中Ca20處理幼苗中SOD、POD、CAT活性均為最高，分別是CK150對(duì)照的3.07、1.29和1.71倍。綜上所述，氯化鈣浸種可促進(jìn)抗氧化酶活性的提高，從而增強(qiáng)清除活性氧能力，減輕鹽脅迫對(duì)荊芥幼苗所造成的傷害，且20 mmol·L-1氯化鈣為提高荊芥幼苗抗氧化能力的最佳濃度。

3.3.3氯化鈣浸種對(duì)鹽脅迫下荊芥幼苗中脯氨酸及可溶性蛋白含量的影響 植物在鹽脅迫下會(huì)在細(xì)胞內(nèi)合成并積累一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以平衡外部介質(zhì)或液泡內(nèi)的滲透壓。脯氨酸和可溶性糖都是植物體內(nèi)重要的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[20]。由圖2可以看出，CK150處理荊芥幼苗中脯氨酸和可溶性蛋白含量較CK0分別提高了4.73和1.93倍，表明150 mmol·L-1NaCl 處理對(duì)荊芥幼苗產(chǎn)生了滲透脅迫，從而使脯氨酸和可溶性蛋白大量積累，以調(diào)節(jié)滲透壓，緩解滲透脅迫。氯化鈣浸種處理后，荊芥幼苗中脯氨酸和可溶性蛋白含量均隨氯化鈣濃度的增大呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。Ca2.5處理幼苗中脯氨酸和可溶性蛋白含量最高；Ca20處理最低。氯化鈣處理的幼苗脯氨酸和可溶性蛋白含量均顯著高于CK0對(duì)照。與CK150相比，僅Ca2.5處理的可溶性蛋白與其無(wú)顯著差異，其他處理與CK150間差異均達(dá)顯著水平。綜上所述，氯化鈣浸種在一定程度上降低了荊芥幼苗在鹽脅迫下對(duì)脯氨酸和可溶性蛋白的合成與積累，推測(cè)添加外源鈣使得荊芥幼苗在鹽脅迫下可能存在多種滲透調(diào)節(jié)方式，從而使脯氨酸與可溶性蛋白的累積量減少。

4 討論

種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)周期中最初和最關(guān)鍵的階段[21]，也是抗逆性最弱的階段，易受到環(huán)境脅迫的影響甚至傷害。鹽堿脅迫是最嚴(yán)重的生態(tài)限制因素之一[22]。本研究表明，150 mmol·L-1的NaCl脅迫下，荊芥種子的各項(xiàng)萌發(fā)指標(biāo)均受到抑制。而采用氯化鈣對(duì)荊芥種子進(jìn)行浸種處理后，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等隨氯化鈣濃度的升高呈先升高后降低的趨勢(shì)，且各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)均顯著高于未浸種對(duì)照。此外氯化鈣浸種后荊芥幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮重等也顯著高于對(duì)照，與前人關(guān)于外源鈣促進(jìn)馬齒莧[23]、小麥[24]、豌豆[25]、黃芩[26]等種子萌發(fā)的研究結(jié)果相一致。

植物在逆境環(huán)境下會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，從而發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，丙二醛作為其產(chǎn)物之一，是判斷細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度和植物對(duì)逆境條件反應(yīng)強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[27]。本研究中，在150 mmol·L-1NaCl脅迫下，荊芥幼苗的丙二醛含量顯著提高，表明在鹽脅迫下荊芥幼苗發(fā)生了嚴(yán)重的膜脂過(guò)氧化反應(yīng)。而氯化鈣浸種處理后，荊芥幼苗丙二醛含量與鹽脅迫對(duì)照相比顯著降低，與前人研究結(jié)果相一致[24-26]，表明外源鈣處理可有效地降低荊芥幼苗中MDA的積累，從而減輕鹽脅迫下膜質(zhì)過(guò)氧化作用對(duì)細(xì)胞的傷害程度。而外源鈣處理后荊芥幼苗中MDA含量降低的原因可能與外源鈣提高抗氧化酶活性有關(guān)。植物體內(nèi)的SOD、POD和CAT等抗氧化酶是植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)的重要成員，它們協(xié)同作用，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的活性氧平衡，抵御其對(duì)膜的結(jié)構(gòu)和完整性造成破壞。本研究表明，在鹽脅迫下荊芥幼苗體內(nèi)的SOD、POD和CAT活性均顯著降低，而用氯化鈣浸種處理后，幼苗中SOD、CAT和POD的活性均顯著提高，與李小玲等[26]關(guān)于鹽脅迫降低黃芩體內(nèi)抗氧化酶活性，而外源鈣可提高抗氧化酶活性的研究結(jié)果相一致。氯化鈣浸種后，荊芥幼苗中抗氧化酶活性的提高降低了植株體內(nèi)活性氧水平, 抑制了膜質(zhì)過(guò)氧化作用，減少了MDA的累積，從而減輕了細(xì)胞膜損傷程度。

當(dāng)土壤溶液中鹽分含量增加時(shí)，滲透壓也隨之提高，從而造成植物根系吸水困難，甚至出現(xiàn)生理干旱現(xiàn)象。因此植物在鹽脅迫下自身會(huì)進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)，即在細(xì)胞內(nèi)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以提高細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度，降低胞內(nèi)水勢(shì)。滲透調(diào)節(jié)一般由無(wú)機(jī)離子(如K+、Cl-、Ca2+等)和有機(jī)物質(zhì)(如游離脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖等)共同參與[5]。本研究結(jié)果表明，在150 mmol·L-1NaCl脅迫下，荊芥幼苗的脯氨酸及可溶性蛋白含量與蒸餾水對(duì)照相比顯著提高，這正是荊芥在鹽脅迫下受到傷害后的一種自我調(diào)節(jié)反應(yīng)。采用氯化鈣浸種處理后的幼苗在鹽脅迫下脯氨酸和可溶性蛋白含量雖整體上高于蒸餾水對(duì)照，但均低于未浸種對(duì)照，與前人關(guān)于外源鈣提高鹽脅迫下巴西蕉[9]、酸棗[20]、沙拐棗[27]幼苗脯氨酸及可溶性蛋白含量的研究結(jié)果存在差異。但侍瑞高等[24]研究發(fā)現(xiàn)，外源氯化鈣會(huì)使鹽脅迫下小麥幼苗中脯氨酸含量降低、可溶性糖含量提高；王志強(qiáng)等[28]研究發(fā)現(xiàn)，外源Ca2+顯著降低了小麥在高鹽脅迫下的脯氨酸含量，但增加了K+的吸收，認(rèn)為增加的K+可部分替代脯氨酸等有機(jī)溶質(zhì)的滲透調(diào)節(jié)作用，且與有機(jī)溶質(zhì)相比，利用無(wú)機(jī)離子作為滲透調(diào)節(jié)劑的耗能更低；蘇江碩等[7]研究發(fā)現(xiàn)外源Ca2+使鹽脅迫下菊花幼苗脯氨酸含量降低，認(rèn)為脯氨酸可能僅是鹽脅迫下的一種產(chǎn)物，外源Ca2+可能是通過(guò)保護(hù)膜的穩(wěn)定性、保持離子平衡等其他途徑來(lái)減少菊花在鹽脅迫下所受的傷害。本研究中外源鈣使荊芥幼苗在鹽脅迫下的脯氨酸及可溶性蛋白含量降低，推測(cè)可能是由于外源鈣使植株啟動(dòng)了其他脅迫生理響應(yīng)機(jī)制，從而具備了多種滲透調(diào)節(jié)方式，如提高抗氧化物酶活性、促進(jìn)無(wú)機(jī)離子的吸收或其他滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成等，從而降低了脯氨酸和可溶性蛋白的累積，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。