胡 寶 徐子昕 郭金英 王春霞 鄭素月

（河北工程大學(xué)園林與生態(tài)工程學(xué)院，河北邯鄲056038）

香菇是我國主要的栽培食用菌種類之一，已有800多年的栽培歷史[1]。近年來，我國食用菌產(chǎn)業(yè)正迎來“精準(zhǔn)扶貧”“一帶一路”等重大發(fā)展機(jī)遇，香菇產(chǎn)業(yè)成為許多地區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)。據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計(jì)，2019年我國香菇仍以1 151.9萬t的產(chǎn)量居各類食用菌產(chǎn)量的首位。隨著香菇產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型升級以及受菌棒出口利益的推動，我國出現(xiàn)了越來越多的香菇菌棒廠[2-3]。菌種培養(yǎng)是菌棒生產(chǎn)流程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)。常規(guī)香菇菌種為固體菌種，存在生產(chǎn)成本高，容易感染雜菌，生長周期過長等缺陷[4-5]。液體菌種相比較固體菌種而言，具有制種簡單、生產(chǎn)成本低、生長周期短、菌齡一致性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于工廠化生產(chǎn)菌棒[6]。試驗(yàn)主要研究不同培養(yǎng)基及其他培養(yǎng)條件對液體菌種培養(yǎng)的影響，以期篩選出適合規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的香菇液體菌種培養(yǎng)基配方，為香菇液體菌種生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

香菇0912，河北工程大學(xué)園林與生態(tài)工程學(xué)院食用菌研究室保藏。

1.2 供試培養(yǎng)基

試驗(yàn)共設(shè)計(jì)11個(gè)搖瓶培養(yǎng)基配方（均為1 000 mL）。配方①：土豆200 g，KH2PO43 g，葡萄糖20 g，MgSO41.5 g，維生素B 0.01 g；配方②：土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，KH2PO42 g，MgSO41 g，維生素B 2片；配方③：土豆200 g，紅糖20 g，葡萄 糖15 g，蛋 白 胨5 g，酵 母 膏3 g，KH2PO41 g，K2HPO41 g，MgSO41 g，維生素B 2片；配方④：土豆200 g，木屑50 g，葡萄糖20 g，蛋白胨6 g，KH2PO40.5 g，維生素B 2片；配方⑤：玉米粉20 g，麩皮20 g，葡萄糖10 g，酵母膏3 g，KH2PO41 g，MgSO41 g，維生素B 2片；配方⑥：玉米粉10 g，豆粉7 g，葡萄糖20 g，酵母浸粉1 g，蛋白胨1 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g；配方⑦：土豆200 g，紅糖15 g，葡萄糖10 g，蛋白胨3 g，豆粉3 g，玉米粉3 g，KH2PO41 g，K2HPO41 g，MgSO40.8 g，維生素B 2片；配方⑧：土豆200 g，葡 萄 糖20 g，KH2PO43 g，蛋 白 胨3 g，K2HPO43 g，MgSO41 g，維生素B 2片，玉米粉1 g；配方⑨：土豆200 g，紅糖10 g，葡萄糖10 g，蛋白胨3 g，KH2PO43 g，K2HPO43 g，豆粉3 g，玉米粉3 g，MgSO41 g，維生素B 2片；配方⑩：土豆200 g，酵母膏3 g，葡萄糖20 g，MgSO41 g，KH2PO41 g。配方?：合成培養(yǎng)基12 g，麩皮6 g，玉米粉4 g，白砂糖6 g，蛋白胨1 g，豆油4 mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

將香菇菌種接種到PDA綜合培養(yǎng)基平板上，置25℃恒溫箱培養(yǎng)，長滿平板后備用。

1.3.2 培養(yǎng)基配制及接種和培養(yǎng)

按上述配方將11種培養(yǎng)基配制好后，裝入500 mL搖瓶培養(yǎng)基中，每瓶裝液量200 mL，加入10~20粒直徑5 mm玻璃珠，封口滅菌。121℃滅菌30 min，冷卻后接種。接種時(shí)用6 mm的無菌打孔器在活化菌株的菌絲邊緣打孔，每個(gè)液體搖瓶接種8個(gè)菌餅塊，靜置培養(yǎng)24 h，置恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，25℃，170 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)。

1.4 觀察記錄

接種后第7天開始，觀察測定搖瓶中菌液pH變化、菌絲鎖狀聯(lián)合、生物量等指標(biāo)。鎖狀聯(lián)合計(jì)數(shù)方法是在10×40倍視野下計(jì)錄每個(gè)視野下鎖狀聯(lián)合數(shù)量，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)培養(yǎng)基液體發(fā)酵中的p H變化

測定11個(gè)香菇發(fā)酵配方的初始pH，從接種后的第7天開始，取樣檢測培養(yǎng)液pH，結(jié)果見圖1所示。由圖1可知，試驗(yàn)培養(yǎng)基配方初始pH有所不同，均6.0~7.0。在液體培養(yǎng)過程中，pH均呈下降趨勢，但下降程度不同，說明香菇菌絲在試驗(yàn)培養(yǎng)基中生長和代謝能力有差異。根據(jù)香菇液體菌種的生物學(xué)特性，在培養(yǎng)過程中，初始pH為6.0~7.0，發(fā)酵終點(diǎn)pH3.0~4.0，其中配方⑤和配方⑦，pH變化適度。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間菌液pH的變化

2.2 試驗(yàn)培養(yǎng)基p H和菌絲生物量的比較

試驗(yàn)培養(yǎng)基初始pH、發(fā)酵終點(diǎn)pH及菌絲生物量比較見表1。由表1可見，試驗(yàn)培養(yǎng)基的初始pH、發(fā)酵終點(diǎn)pH和生物量均不同。根據(jù)菌絲生物量干重并結(jié)合菌液培養(yǎng)過程中pH的變化，菌液初始pH均在6.0~7.0，菌液發(fā)酵終點(diǎn)pH多數(shù)在3.0~4.0，只有配方⑨pH從6.5下降到5.6，但菌絲生物量最低，為2.635 mg/mL。配方⑤菌絲生物量最高，為9.140 mg/mL，其次為配方⑦，為7.695 mg/mL，配方③為7.560 mg/mL，配方④為6.645 mg/mL。依據(jù)菌絲生物量干重測定情況，且工廠化生產(chǎn)中要求菌絲量越高越好，配方①、配方⑥、配方⑧、配方⑨和配方⑩五個(gè)配方菌絲生物量均在5.0 mg/mL以下，因此并非理想的配方。

表1 試驗(yàn)培養(yǎng)基的p H和菌絲生物量比較

2.3 香菇液體菌種活力判定及菌絲球形態(tài)觀察

鎖狀聯(lián)合是雙核菌絲細(xì)胞分裂的一種特殊形式，也是結(jié)實(shí)能力的標(biāo)志，鎖狀聯(lián)合數(shù)量的多少直接反映菌絲體活力的強(qiáng)弱。試驗(yàn)配方培養(yǎng)的菌絲每個(gè)視野下鎖狀聯(lián)合數(shù)量見表2（配方⑧和配方⑨未見明顯菌絲球，未檢測鎖狀聯(lián)合）。由表2可知，試驗(yàn)培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲鎖狀聯(lián)合數(shù)量不同，當(dāng)搖瓶培養(yǎng)至第10天時(shí)，配方①和配方⑥菌絲鎖狀聯(lián)合數(shù)量最多，平均每個(gè)視野中鎖狀聯(lián)合數(shù)量均超過20個(gè)，培養(yǎng)至第11天時(shí)，鎖狀聯(lián)合數(shù)量大部分呈下降趨勢，其中，配方①和配方⑥下降最明顯，配方②和配方④下降幅度相對較小。

表2 試驗(yàn)培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲球的鎖狀聯(lián)合檢測

培養(yǎng)基菌液及菌絲生長形態(tài)見表3、圖2。通過肉眼觀察菌液和菌絲形態(tài)，結(jié)合顯微觀察可初步判定菌絲是否退化或老化。

不同配方培養(yǎng)基的菌液顏色有明顯差異，菌絲球也略有差異。試驗(yàn)多數(shù)配方培養(yǎng)基培養(yǎng)菌球呈毛刺球形，形似海膽；試驗(yàn)配方培養(yǎng)液中菌絲球量有一定差異，綜合配方⑤、配方⑦，菌球大小比較均勻，量適中（表2、圖2）。

3 小結(jié)與討論

香菇液體菌種生產(chǎn)中，隨著菌絲的生長，生物量的增加，菌液pH、菌絲鎖狀聯(lián)合數(shù)量、菌絲形態(tài)等都會發(fā)生相應(yīng)的變化，并因培養(yǎng)基不同有所差異，在生產(chǎn)中如何選擇適宜的配方及快速的檢測發(fā)酵終點(diǎn)方法，以便在香菇菌絲最好的生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)接栽培袋，是急需解決的難題。綜合11個(gè)配方液體培養(yǎng)香菇菌種過程中pH、菌絲球形態(tài)、菌液顏色等變化，篩選出較優(yōu)良的4個(gè)配方，分別為配方⑤、配方⑦、配方③和配方④，可在香菇液體菌種工廠化生產(chǎn)上進(jìn)一步推廣應(yīng)用。試驗(yàn)結(jié)果表明，香菇液體培養(yǎng)基初始pH6.0~7.0為宜，發(fā)酵終點(diǎn)pH3.0~4.0為宜。

表3 試驗(yàn)培養(yǎng)基中香菇菌液及菌絲球的形態(tài)特征

圖2 試驗(yàn)培養(yǎng)基中香菇菌絲球的形態(tài)

有關(guān)菌絲出現(xiàn)退化、老化的特征有待進(jìn)一步研究。