段 彪 王 璐 馮 清 周志偉 杜海燕

1贛州市人民醫(yī)院 江西贛州 341000;2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 內(nèi)蒙古包頭 014010

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent miscarriage, RM)是常見的妊娠并發(fā)癥，定義為妊娠20周前兩次或兩次以上自然流產(chǎn)[1]。與RM相關(guān)的危險因素主要包括感染、遺傳和自身免疫因素等[2]。CD4+T細(xì)胞亞群在母胎界面免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，包括T輔助細(xì)胞1(T helper, Th1)、Th2、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T, Treg)和Th17細(xì)胞等。其中Treg細(xì)胞具有高度的免疫抑制作用，叉頭盒P3(Forkhead box P3，F(xiàn)oxp3)是其分化重要的核轉(zhuǎn)錄因子。Th17細(xì)胞被認(rèn)為會影響慢性炎癥并控制真菌感染，越來越多的證據(jù)表明Treg和Th17細(xì)胞在妊娠建立和維持中具有重要作用[3]。在一項關(guān)于流產(chǎn)小鼠模型的研究表明應(yīng)用妊娠期的Treg細(xì)胞進行免疫治療可以逆轉(zhuǎn)由IL-17誘導(dǎo)的流產(chǎn)[4]。調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡可能是RM患者的一種新穎且有希望的治療策略。目前，維生素D3對Treg/Th17平衡的調(diào)節(jié)成為生殖免疫方面的研究熱點。維生素D首先在肝臟中被25-羥化酶(CYP2R1)代謝為25(OH)D3，接著在腎臟中被1-α-羥化酶(CYP27B1)代謝為完全活化維生素D形式1,25(OH)2D3[5]。包括免疫細(xì)胞在內(nèi)的很多細(xì)胞均表達維生素D受體(VDR)和CYP27B1[6]。1,25(OH)2D3是一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑，通過特異性結(jié)合VDR，能夠抑制Th17細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如IFN-γ、IL-2和TNF-α。同時，能夠誘導(dǎo)Foxp3的表達和Treg細(xì)胞的分化，達到對妊娠的保護作用[7-8]。本研究通過動物實驗，探討聯(lián)合使用Treg細(xì)胞和維生素D3治療RM，從而為治療RM提供新的治療思路和方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及試劑

實驗動物：雌性CBA/J小鼠(7～8周齡、18～21 g)、雄性DBA/2J(9～10周齡、22～25 g)和雄性BALB/c小鼠(9～10周齡、22～25 g)購自南京大學(xué)模式動物研究所。所有實驗小鼠均為SPF級，飼養(yǎng)條件為溫度22±1 ℃、光周期調(diào)控(12 h/12 h的光照/黑暗)和相對濕度50%～60%。

試劑：維生素D3和RIPA裂解緩沖液購自Sigma公司；免疫磁珠分離試劑盒購自MiltenyiBiotec公司；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購自達優(yōu)公司；RPMI1640培養(yǎng)液購自為Gibco公司；所有抗體購自Biolegend公司；CFSE和TRIzol試劑購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green購自TaKaRa公司；二辛可寧酸(BCA)蛋白測定試劑盒購自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 孕鼠外周血來源Treg細(xì)胞的分離 將CBA/J雌鼠與BALB/c雄鼠進行交配，次日早晨檢查陰道栓。見栓后分籠飼養(yǎng)，見栓日計為孕0.5 d。抽取孕14周CBA/J雌鼠的外周血10 mL，置于預(yù)先加有肝素的15 mL離心管中。血液樣品用PBS以1 ∶1稀釋。然后，以相同體積緩緩置于Ficoll液上方，室溫下800 g離心30 min。通過密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞(PBMCs)。CD4+CD25+Treg細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞用免疫磁珠分離試劑盒的產(chǎn)品說明步驟進行分選和富集。

1.2.2 Treg細(xì)胞的鑒定及功能鑒定分型 吸取分離的Treg細(xì)胞懸液100 μL，進行CD4和CD25抗體的雙單克隆抗體或同型對照染色，采用流式細(xì)胞儀檢測抗體陽性細(xì)胞的比率。接著，使用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)進行功能鑒定。用CFSE標(biāo)記分離的CD4+CD25-T細(xì)胞，將其作為效應(yīng)T細(xì)胞(Teff)。用抗CD3 /抗CD28免疫磁珠激活效應(yīng)T細(xì)胞，并在96孔板中以1×105個效應(yīng)細(xì)胞/孔的密度接種。將CFSE標(biāo)記的Teff細(xì)胞和Treg按照1 ∶1的比例混合，在37 ℃、5 % CO2的條件下進行培養(yǎng)。72 h后，收集細(xì)胞并通過流式細(xì)胞儀檢測，分析CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖抑制情況。

1.2.3 RM流產(chǎn)小鼠模型的建立 流產(chǎn)組為CBA/J雌鼠×DBA/2J雄鼠，對照組為CBA/J雌鼠×BALB/c雄鼠。所有組合小鼠按照雄:雌=1 ∶2的比例于擬交配日18:00合籠，次日早8:00檢查陰道栓，見栓后分籠飼養(yǎng)，見栓日計為孕0.5 d。

1.2.4 聯(lián)合使用Treg細(xì)胞和維生素D3的免疫治療 將CBA/J雌鼠隨機分為6組(聯(lián)合治療組、Treg細(xì)胞組、維生素D3組、生理鹽水組、空白對照組及正常妊娠組)，每組數(shù)量為10只，前5組雌鼠與DBA/2J雄鼠交配，第6組雌鼠與BALB/c雄鼠交配作為正常妊娠組。聯(lián)合治療組交配前2天給予尾靜脈注射孕鼠外周血分離得到的Treg細(xì)胞(細(xì)胞濃度2×106/mL，注射量100 μL)，自妊娠第2天開始每日腹腔注射生理鹽水稀釋的維生素D3溶液0.2 mL，單次給藥劑量為4 μg。Treg細(xì)胞組在交配前2天給予尾靜脈注射孕鼠外周血分離得到的Treg細(xì)胞，自妊娠第2天開始每日腹腔注射生理鹽水0.2 mL。維生素D3組在交配前2天給予尾靜脈注射50 μL生理鹽水，自妊娠第2天開始每日腹腔注射生理鹽水稀釋的維生素D3溶液0.2 mL，單次給藥劑量為4 μg。生理鹽水組在交配前2天給予尾靜脈注射50 μL生理鹽水，自妊娠第2天開始每日腹腔注射生理鹽水0.2 mL?？瞻讓φ战M不做任何處理。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血Treg和Th17細(xì)胞比率 在妊娠第13天頸椎脫臼法處死各組孕鼠，抽取外周靜脈血10 mL,分離并收集各組孕鼠PBMCs。加入10 μg/mL FITC標(biāo)記的抗小鼠CD4和5 μg/mL PE標(biāo)記的抗小鼠CD25，冰上避光孵育30 min后檢測Treg細(xì)胞。加入10 μg/mL FITC標(biāo)記的抗小鼠CD4和5 μg/mL PE標(biāo)記的抗鼠IL-17A，冰上避光孵育30 min后檢測Th17 細(xì)胞。

1.2.6 胚胎發(fā)育情況的觀察 處死各組孕鼠后，分離子宮觀察胚胎丟失情況。統(tǒng)計各組被吸收胚胎數(shù)和總胚胎數(shù)，根據(jù)公式計算胚胎吸收率(被吸收胚胎數(shù)/總胚胎數(shù)×100%)。

1.2.7 Q-PCR檢測 使用TRIzol試劑按照產(chǎn)品說明提取胎盤組織樣本的總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈cDNA，設(shè)計引物并進行Q-PCR擴增分析，引物序列如下表1所示。qRT-PCR條件為在95 ℃下2 min，在95 ℃下15 s、60 ℃ 15 s和72 ℃ 35 s的40個循環(huán)。應(yīng)用Applied Biosystems 7500熒光定量PCR儀進行Q-PCR實驗，記錄每次測定的Ct值，以GAPDH為內(nèi)參基因，得出的數(shù)據(jù)用2-△△Ct進行分析。每個樣本重復(fù)三次。

表1 各種基因的引物序列

1.2.8 Western Blot檢測 使用RIPA裂解液從胎盤組織中提取總蛋白，并用BCA試劑盒對總蛋白進行定量。將裂解物在4 ℃下15 000×rpm離心15 min。然后將蛋白質(zhì)提取物進行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。室溫下用5%牛血清白蛋白封閉膜1 h后，用一抗(1 ∶2 000)和GAPDH(1 ∶5 000)4 ℃過夜檢測目標(biāo)蛋白。隨后，室溫下加入辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔IgG(1 ∶20,000)，分別檢測Foxp3、VDR、CYP27B1和CYP2R1的表達，以GAPDH作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 Treg細(xì)胞的鑒定及功能鑒定分型

分離后的細(xì)胞終產(chǎn)物中CD4+CD25+雙陽性細(xì)胞的純度為(93.34±1.18)%，圖1顯示分選后的Treg細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測的其表型特征。采用CFSE標(biāo)記法檢測CD4+CD25-Teff的增殖情況，觀察加入Treg細(xì)胞后，Teff增殖是否受抑制。CD4+ CD25-Teff單獨培養(yǎng)時的增殖率是31.2%；當(dāng)加入CD3/CD28免疫磁珠后，細(xì)胞增殖率增至63.1%；當(dāng)CD4+CD25-Teff與Treg在CD3 / CD28免疫磁珠存在的條件下以1 ∶1的比例共培養(yǎng)時，Teff的增殖率降至35.5%。結(jié)果顯示CD4+CD25+Treg細(xì)胞對CD4+CD25-Teff細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，見圖2所示。

A.同型對照染色，B.分離的CD4+ CD25+Treg細(xì)胞的百分率

圖2 分選CD4+CD25+Treg細(xì)胞對自體 CD4+CD25-Te增殖抑制的流式細(xì)胞圖。M1代表增殖的自身CD4+CD25-Teff的百分率。A. CD4+CD25-Teff單獨培養(yǎng)，B. 存在CD3/CD28磁珠的情況下培養(yǎng)的CD4+CD25-Teff，C. CD4+CD25-Teff與Treg在CD3/CD28磁珠存在的條件下以1 ∶1的比例共培養(yǎng)

2.2 Treg、Th17細(xì)胞比率及兩者比值的比較

聯(lián)合治療組與其他5組相比在Treg、Th17細(xì)胞及兩者的比值均具有顯著差異，與單獨Treg細(xì)胞或維生素D3組相比三項參數(shù)也有顯著差異(P<0.05)，詳見表2。

表2 Treg 細(xì)胞、Th17 細(xì)胞比率及兩者比值比較

2.3 Treg細(xì)胞聯(lián)合維生素D3治療對相關(guān)基因表達的影響

與生理鹽水組、空白對照組相比，聯(lián)合治療組、Treg細(xì)胞組、維生素D3組的Foxp3 mRNA表達均顯著升高，其中聯(lián)合治療組的表達差異最大(P<0.001)，聯(lián)合治療組和維生素D3組之間的Foxp3 mRNA表達有顯著差異(P<0.05)，見圖3A，F(xiàn)oxp3蛋白表達顯示同樣的趨勢，見圖3E。在VDR mRNA的表達方面，與生理鹽水組、空白對照組相比，聯(lián)合治療組、Treg細(xì)胞組、維生素D3組的表達均顯著升高(P<0.01)，聯(lián)合治療組、Treg細(xì)胞組之間的表達有顯著差異(P<0.05)，見圖3B，VDR蛋白表達顯示同樣的趨勢，見圖3E。在CYP27B1 mRNA的表達方面，與生理鹽水組、空白對照組相比，聯(lián)合治療組、Treg細(xì)胞組、維生素D3組的表達均顯著升高(P<0.01)。與Treg細(xì)胞組相比，聯(lián)合治療組和維生素D3組的表達量顯著升高(P<0.05)，見圖3C， CYP27B1蛋白表達顯示同樣的趨勢，見圖3E。幾組間CYP2R1 mRNA和蛋白表達無顯著差異(P>0.05，圖3D和3E)。

2.4 胚胎吸收率的比較

聯(lián)合治療組的胚胎吸收率與維生素D3組、生理鹽水組、空白對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合治療組與Treg細(xì)胞組、正常妊娠組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Treg細(xì)胞組的胚胎吸收率與維生素D3組、生理鹽水組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Treg細(xì)胞組與聯(lián)合治療組、維生素D3組和正常妊娠組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，詳見表3。

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001

表3 胚胎吸收情況比較

3 討論

胎兒作為同種異體抗原，在妊娠過程中不被母體免疫系統(tǒng)所排斥，這是母體和胎兒之間形成免疫耐受的結(jié)果。越來越多的證據(jù)表明，Treg和Th17細(xì)胞的失衡與RM發(fā)病有關(guān)，正常人妊娠與發(fā)揮免疫抑制作用的Treg亞群的升高有關(guān)[9-10]。同時，來自體外研究和動物模型的實驗表明，維生素D3的活性形式可作為替代的免疫調(diào)節(jié)劑，維生素D3可以抑制或上調(diào)樹突狀細(xì)胞(DC)、Th1、Th2和Treg細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達，可以抑制促炎性Th1和Th17細(xì)胞反應(yīng)，同時通過增強白介素IL-4、IL-5和IL-10的產(chǎn)生來促進Th2和Treg細(xì)胞的表型[11-12]。

在本實驗中聯(lián)合治療組與生理鹽水注射組或空白對照相比，在Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞和兩者的比值方面均具有顯著差異，說明聯(lián)合治療的方式顯著增加Treg細(xì)胞比率和Treg/Th17比值。Rafiee等研究了同時注射父方淋巴細(xì)胞和補充維生素D治療人RM的效果，結(jié)果表明聯(lián)合治療降低了Th17/Treg比率和Th17細(xì)胞的比例，我們的結(jié)果與這一發(fā)現(xiàn)相符[13]。同時，聯(lián)合治療組與單獨Treg細(xì)胞組或維生素D3組相比，三項參數(shù)也具有統(tǒng)計學(xué)差異，說明聯(lián)合治療的方式在改善Treg/Th17平衡方面優(yōu)于單獨治療。Foxp3是Treg細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記分子和調(diào)節(jié)蛋白，其Q-PCR和Western Blot結(jié)果表明聯(lián)合治療組與單獨維生素D3、生理鹽水組和空白對照相比，表達量有統(tǒng)計學(xué)差異，而單獨Treg細(xì)胞或維生素D3治療與生理鹽水組和空白對照相比也具有統(tǒng)計學(xué)差異，說明聯(lián)合治療的方式產(chǎn)生更多的Foxp3表達，單獨Treg細(xì)胞或維生素D3治療表達水平次之，結(jié)果表明維生素D3對于增加Foxp3+Treg的數(shù)量產(chǎn)生積極意義，這也與相關(guān)研究報道一致[14]。對于VDR的表達，聯(lián)合治療組、單獨Treg或維生素D3與生理鹽水組和空白對照相比均有統(tǒng)計學(xué)差異，說明這三種方式均導(dǎo)致胎盤組織部位表達更多的維生素D3受體。同時，聯(lián)合治療組與單獨Treg組相比有統(tǒng)計學(xué)差異,與單獨維生素D3組無差異，說明單獨Treg不能增加VDR表達，只有增加體內(nèi)維生素D3的水平才有利于提高其受體的表達水平。研究表明活化后的維生素D3可以與VDR結(jié)合并作用于VDR的啟動子區(qū)域，增加其表達[15]。Kongsbak等[16]指出VDR的表達和活性很重要，它們在T細(xì)胞的發(fā)育和分化中以及在誘導(dǎo)效應(yīng)子功能中發(fā)揮重要作用，VDR的活性和表達水平是控制維生素D3免疫調(diào)節(jié)的主要機制。對于CYP27B1的表達，聯(lián)合治療組、單獨Treg或維生素D3與生理鹽水組和空白對照相比，均有統(tǒng)計學(xué)差異，說明這三種方式均導(dǎo)致更多量的CYP27B1的表達。聯(lián)合治療組與單獨Treg組相比有統(tǒng)計學(xué)差異,與單獨維生素D3組無差異，說明單獨Treg不能增加CYP27B1表達，增加體內(nèi)維生素D3的水平才有利于提高代謝酶CYP27B1的表達。在胚胎吸收率上，聯(lián)合治療組與單獨維生素D3、生理鹽水組和空白對照相比有統(tǒng)計學(xué)差異，聯(lián)合治療的方式得到最低的胚胎吸收率。

綜上所述，聯(lián)合使用Treg細(xì)胞和維生素D3起到良好得調(diào)節(jié)RM中的Treg/Th17平衡的作用。在充足的維生素D3水平條件下，體內(nèi)補充Treg細(xì)胞不但可以增加具有免疫抑制功能的Treg細(xì)胞的數(shù)量并維持其功能，還有利于體內(nèi)Th17向Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)化并減少炎癥反應(yīng)。我們的實驗證實在聯(lián)合使用的方法中Treg細(xì)胞、維生素D3和免疫調(diào)節(jié)相互聯(lián)系和相互作用，為進一步深入研究RM的發(fā)病機理奠定了理論基礎(chǔ)。因此，聯(lián)合使用Treg細(xì)胞和維生素D3可成為免疫異常的RM患者的新治療選擇。