王夢琪，朱 蔭，張 悅，施 江，林 智,，呂海鵬,

（1.農業(yè)農村部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，中國農業(yè)科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2.中國農業(yè)科學院研究生院，北京 100081）

綠茶的風味品質宜人，深受消費者的喜愛，是我國產量和銷量最大的茶類。綠茶的化學成分十分復雜，根據存在形式的差異，一般可分為揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性成分。揮發(fā)性成分主要包括芳香類物質，這類物質的化學性質不同、含量微小且差異較大，綠茶內的碳氫化合物、醇類、酮類、酸類、醛類等物質以不同的濃度構成了茶葉的多種香氣類型[1]；非揮發(fā)性成分種類眾多，數量龐大，其中初級代謝物有蛋白質、糖、脂質、核酸等，次級代謝物則主要包括生物堿、黃酮、多酚等物質，這些代謝產物是茶葉味道和生物活性的重要貢獻者。

綠茶的加工工藝一般可分為攤青、殺青、揉捻和干燥等步驟。殺青工藝可鈍化酶的活性，有效保留茶鮮葉中各種化學成分，形成綠茶“清湯綠葉”的品質特點；此外，殺青還對綠茶香氣的形成具有非常重要的作用，在殺青過程中，鮮葉中的青草味物質向果香、花香、清香味物質轉變，構成綠茶多樣的香型[2]。隨著殺青程度的增加，茶葉香氣物質形成顯著[3]，不同殺青溫度可影響揮發(fā)性化合物的組成及其相對含量從而實現不同香型綠茶的加工[4]。

目前科研工作者在不同香型綠茶的揮發(fā)性成分研究方面取得了重要進展，例如查明了不同香型綠茶中揮發(fā)性成分的組成及其含量上差異[5-6]，揭示了不同類型綠茶中的關鍵香氣成分[7]，并建立了綠茶香型的快速鑒別方法[8]。然而，目前鮮見不同香型綠茶中非揮發(fā)性成分差異的研究報道，僅有陳玉瓊等[9]于2003年研究了同一鮮葉制成的清香型、栗香型、高火香型以及焦香型綠茶的主要風味及品質成分，發(fā)現茶葉的火功從清香、栗香、高火香到焦香而逐漸加重，其茶多酚、氨基酸、可溶性糖的含量均逐漸下降，且差異顯著?？梢姡壳安煌阈途G茶中非揮發(fā)性成分的研究比較薄弱，限制了人們對綠茶風味品質的科學認知。

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS/MS）法具有檢出限低、靈敏度高等優(yōu)點，可同時用于定性和定量分析，目前在農藥殘留檢測[10]、食品真菌毒素檢測[11]、代謝物檢測[12]等諸多領域均有廣泛應用，適用于茶葉中非揮發(fā)性成分的檢測分析?！扒逑恪焙汀袄跸恪笔蔷G茶的2 種典型香型，也是綠茶香氣品質優(yōu)異的重要感官評價特征。因此，本實驗擬采用UPLC-MS/MS分析技術，嘗試分析比較“清香”和“栗香”2 種典型香型綠茶中的非揮發(fā)性化學成分差異，以期為后續(xù)深入剖析綠茶風味品質的化學物質基礎提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈、乙醇（均為色譜純） 德國Merck公司；標準品（色譜純） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

1.3 方法

1.3.1 樣品制備與感官評價

依據GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》，按3 g茶葉，150 mL水的比例對49 個實驗室自制分析茶樣進行感官審評，基于GB/T 23776—2018的評價準則（滿分100 分）；審評小組成員由實驗室內5 名具有茶葉感官審評經驗5 年以上的人員組成。最終從中篩選出“清香”綠茶3 個樣品（QX1、QX2、QX3）、“栗香”綠茶3 個樣品（LX1、LX2、LX3）。

1.3.2 樣品前處理

樣品利用研磨儀研磨（30 Hz、1.5 min）直至粉末狀。稱取100 mg茶粉溶解于0.6 mL體積分數70%的甲醇提取液中；溶解后的樣品放置于4 ℃冰箱過夜12 h，期間旋渦振蕩6 次；最后在4 ℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，用微孔濾膜（0.22 μm）進行樣品過濾，而后封存于進樣瓶中，用以進行后續(xù)UPLC-MS/MS檢測。

1.3.3 UPLC-MS/MS分析

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱（100.0 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流速0.35 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量4 μL。流動相A相為超純水（溶有體積分數0.04%的乙酸），B相為乙腈（溶有0.04%的乙酸）；流動相洗脫梯度為：0.00 min B相比例為5%，10.00 min內B相比例線性增加到95%，并維持B相95%的比例1 min，11.00～11.10 min，B相比例降為5%，并以B相5%的比例平衡至14 min。

質譜條件：電噴霧離子源溫度550 ℃，質譜電壓5 500 V，簾氣壓力30 psi，碰撞誘導電離（collisionacticated dissociation，CAD）參數設置為高。在三重四極桿中，依據優(yōu)化的去簇電壓和碰撞能對每個離子對進行掃描檢測。

1.3.4 質控樣本

質控樣本（quality control samples，QC）由樣本提取物混合制備而成，用于分析樣本在相同的處理方法的重復性。在儀器分析過程中，每3 個檢測分析樣本中插入1 個質控樣本，以檢測分析過程的重復性。

西安電子科技大學圖書館已與一家大數據公司合作，把大數據應用于白皮書、報表、智慧墻大屏、專題分析、熱點分析、資源保障分析，還將實現各類數據展示圖書館形象。

1.4 數據處理

基于MWDB數據庫對樣品中化學成分的二級質譜信息進行定性分析，分析時除去同位素信號，含K+、Na+、NH4+等的重復信號。根據代謝物保留時間與峰形的信息，采用Multia Quant軟件對每個代謝物在不同樣本中檢測得到的質譜峰進行校正。

利用三重四極桿質譜的多反應監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）進行化合物定量分析，獲得不同樣本的化合物質譜分析數據后，利用Analyst 1.6.3軟件對所有物質質譜峰進行峰面積積分，并對其中同一化合物在不同樣本中的質譜出峰進行積分校正[13]。

采用多元統(tǒng)計分析，建立數學模型對2 種不同香型綠茶樣品的代謝譜特點進行歸納和總結。首先對樣本（包括質控樣品）進行主成分分析（principal component analysis，PCA），以便初步了解各組樣本之間的總體代謝差異和組內樣本之間的變異度大小。而后，采用具有監(jiān)督模式識別的多元統(tǒng)計分析方法——偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA），提取相關性較小變量的主要信息；通過正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）除去不相關的差異以篩選差異變量。評價模型的預測參數有R2X、R2Y和Q2，其中R2X和R2Y分別表示所建模型對X和Y矩陣的解釋率，Q2表示模型的預測能力，這3 個指標越接近1表示模型越穩(wěn)定可靠，Q2大于0.5表示有效模型，Q2大于0.9表示出色模型?；贠PLS-DA結果，從獲得的多變量分析OPLS-DA模型的變量重要投影（variable importance in projection，VIP），可以初步篩選出不同樣品間差異顯著的化合物。結合單變量分析的假設值（probability，P-value）或者差異倍數值進一步篩選出差異化合物。最終選取VIP大于1，差異倍數值大于等于2或差異倍數值小于等于0.5的代謝物為差異化合物。

2 結果與分析

2.1 多元統(tǒng)計分析

采用多元統(tǒng)計分析，對“清香”和“栗香”2 種不同香型綠茶中的非揮發(fā)性化學成分進行差異分析，PCA得分圖如圖1所示，每個點代表1 個獨立的樣品，2 個主成分的累計貢獻率達到81.69%，2 組樣品之間的分離趨勢明顯，表明2 組樣品之間存在明顯差異。PCA模型的可解釋變量R2（R2X=0.774、R2Y=1.000）及可預測度Q2（Q2=0.992）均較高，說明該模型能夠較好地解釋和預測2 組樣本之間的差異，該模型可較好地反映“清香”及“栗香”香型綠茶樣品之間非揮發(fā)性化學成分的不同。

圖1 “清香”及“栗香”綠茶樣本的PCA得分圖Fig.1 PCA score plot for green tea samples with different aromas

2.2 “清香”及“栗香”型茶葉的化學成分差異分析

2.2.1 非揮發(fā)性成分分析

采用UPLC-MS/MS分析技術，從“清香”及“栗香”綠茶中共檢測得到化學成分543 個，其中含量存在差異的化學成分有173 種，其相對含量以峰面積表示，結果如表1所示。根據化合物結構的差異，上述173 種差異化學成分可分為黃酮類75 個、酚酸類22 個、萜類1 個、脂質31 個、氨基酸及其衍生物類9 個、生物堿4 個、核苷酸及其衍生物9 個、有機酸5 個、木脂素和香豆素5 個、鞣質1 個以及其他類11 個共11 類物質。

表1 清香及栗香綠茶中差異化合物分析結果Table 1 Analysis of differential components between green tea samples with different aromas

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

如圖2所示，脂質化合物、酚酸類化合物在“栗香”綠茶中的含量較“清香”綠茶高，脂質也是2 種香型綠茶中化合物數量較多的一類物質，根據結構差異，茶葉中的脂質又可細分為以下幾類：甘油酯、游離脂肪酸、磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺等；γ-亞麻酸、棕櫚油酸是在“栗香”及“清香”綠茶中含量均較高的脂肪酸類物質，其與茶葉香氣的形成密切相關。3-O-對香豆?？鼘幩釀t是在“栗香”及“清香”綠茶中含量均較高的酚酸類差異化合物；此外，黃酮類物質在“清香”及“栗香”綠茶中所占比重也較大，銀椴苷是“栗香”綠茶中具有最高相對含量的黃酮類化合物，該物質具有抑制人胰腺癌細胞增殖的作用效果[14]；而山柰酚-3-吡喃阿拉伯糖苷則是“清香”綠茶中具有最高相對含量的黃酮類化合物。除黃酮類物質外，N,N-二甲基甘氨酸則是上述2 種香型綠茶中含量最高的氨基酸及其衍生物類差異化合物。

圖2 “清香”及“栗香”綠茶的聚類熱圖Fig.2 Heatmap analysis of differential components between green tea samples with different aromas

通過結合2 種不同香型綠茶的分組情況及定量信息，對檢測得到的化合物差異倍數變化進行進一步比較。其中，有63 個差異化合物于“栗香”綠茶的含量高于“清香”綠茶的對應值，而“栗香”綠茶含量高于“清香”綠茶的差異化合物則多達110 個，差異倍數排名前20 位的化合物如圖3所示?！扒逑恪本G茶中含量明顯高于“栗香”綠茶的差異化合物主要是部分黃酮類及酚酸類化合物，包括矢車菊素-半乳糖苷、木犀草苷、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-木糖、丁香亭、阿福豆苷、異野漆樹苷、牡荊素-2-O-鼠李糖苷、槲皮素-葡萄糖-鼠李糖-鼠李糖苷、芹菜素-6-C-2-葡萄糖醛酸基木糖苷以及綠原酸甲酯，其中矢車菊素-半乳糖苷在2 種香型綠茶中含量差異倍數最大，其對應值為17.37；而“栗香”綠茶中含量明顯高于“清香”綠茶的化合物主要包括松柏苷、香豆酸、山梨酸、12,13-環(huán)氧十八碳二烯酸、芥子酸甲酯、p-香豆醇、芍藥花青素、山柰酚-鼠李糖-半乳糖-鼠李糖、6,7,8-三羥基-5-甲氧基黃酮、DL-泛酰醇等酚酸、脂質以及黃酮類物質，其中松柏苷在2 種香型綠茶中的含量差異倍數最大，其對應值為16.37。盡管火功由清香、栗香、高火香到焦香逐漸加重，茶葉中茶多酚（主要是兒茶素）等成分的含量均逐漸下降[9]，但本實驗發(fā)現，“栗香”綠茶中的大部分單一黃酮成分（主要是黃酮的糖苷成分）的含量往往比“清香”綠茶高。

圖3 “清香”及“栗香”樣品差異倍數排名前20 位物質的柱形圖Fig.3 Histogram of top 20 differential components between green tea samples with different aromas

利用KEGG數據庫對檢測得到的差異化合物進行通路的富集分析結果如圖4所示，“清香”及“栗香”綠茶樣品中共有117 種差異化合物可被注釋到相關的代謝通路上，主要在淀粉和蔗糖代謝、花青素生物合成、黃酮和黃酮醇的生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、咖啡因代謝等通路上顯著富集。

圖4 “清香”及“栗香”綠茶中差異代謝物KEGG富集圖Fig.4 KEGG enrichment map of differential components between green tea samples with different aromas

2.2.2 “栗香”及“清香”綠茶中可能與香氣品質形成有關的非揮發(fā)性化合物

香氣對茶葉風味、品質等級評定以及消費者感官評價都具有重要影響。一般認為，茶葉香氣的形成主要可以概括為以下4 個主要途徑：1）以類胡蘿卜素類物質為前體物質，通過酶促氧化及非酶促氧化途徑降解生成β-紫羅蘭酮、β-大馬酮、橙花叔醇、α-法尼烯以及香葉基丙酮等；2）以脂肪酸為前體物質，氧化生成醇、酮、醛類化合物；3）以糖苷類為前體物質，通過加工過程中的水解作用釋放萜品醇、芳香醇等；4）茶葉加工過程中美拉德反應生成吡喃、吡咯類雜環(huán)化合物[15]。香氣前體物質不同、作用途徑不同，反應所生成的茶葉中揮發(fā)性化合物香氣類型也各不相同，可見茶葉香氣類型的差異，與茶葉中香氣前體物質的組成、含量及比例密切相關。

“栗香”及“清香”綠茶中差異化合物的分析結果如圖5所示，發(fā)現了部分可能參與“栗香”及“清香”綠茶香氣成分形成的化合物或香氣前體物，例如α-亞麻酸、棕櫚油酸、香蘭素、隱綠原酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、L-蛋氨酸以及γ-氨基丁酸等。實驗表明，“清香”綠茶中隱綠原酸以及L-蛋氨酸含量較“栗香”綠茶高。隱綠原酸又可被稱為4-O-咖啡?？鼘幩?，該物質是綠原酸在異構化反應條件生成的[16]；隱綠原酸屬于酚酸類物質，是植物體中很關鍵的次生代謝產物，該物質曾作為烤煙煙葉中的糖苷類香氣前體物質被發(fā)現[17]。作為隱綠原酸的同分異構體，綠原酸帶有清香風味，可氧化生成吡咯、吡嗪等揮發(fā)性香氣成分[18]，因此，推測茶葉中的隱綠原酸可能參與茶葉中揮發(fā)性香氣成分的合成。L-蛋氨酸則在茶葉加工過程中通過Strecker降解反應形成了甲硫基丙醛，進而形成其他常見的含硫化合物[15]，如甲硫醇、二甲基硫醚、二甲基三硫醚、二甲基亞砜等物質。

圖5 “清香”及“栗香”綠茶中香氣前體物質差異組分層次聚類分析熱圖Fig.5 Hierarchical clustering heat map of differential aroma precursors between green tea samples with different aromas

與“清香”綠茶相比，“栗香”綠茶樣品中的α-亞麻酸、香蘭素、γ-氨基丁酸、棕櫚油酸以及山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量較高。其中，α-亞麻酸及棕櫚油酸為不飽和脂肪酸，脂肪酸類物質本身具有一定的香氣特征，同時可通過氧化降解生成其他香氣物質，因此其對茶葉呈香也具有重要貢獻作用，是某些茶葉呈香成分的重要前體物質[19-21]。在茶葉中，這2 種物質主要通過脂肪酸氧化途徑生成6～10 個碳的醛、酮、醇類揮發(fā)性化合物，六碳化合物如：(E)-2-己烯醛、(E)-2-己烯醇、(Z)-3-己烯醇等物質均表現出“青氣”氣味特征，但由于這類物質具有沸點低、易揮發(fā)的特性，導致其在“栗香”綠茶加工的高溫干燥過程中大量揮發(fā)。實驗表明，“栗香”綠茶中脂肪族類關鍵呈香成分有3-甲基丁醛、(E)-3-戊烯-2-酮、辛醛、(E)-2-辛烯醛、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮、壬醛、(E)-2-壬烯醛、癸醛、橙花叔醇共9 種物質[22]；而“清香”綠茶中脂肪族關鍵呈香成分僅有2-甲基丁醛、庚醛、1-辛烯-3-醇、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮及壬醛共6 種物質[23]?？梢姡扒逑恪奔啊袄跸恪本G茶中不飽和脂肪酸含量的差異，可能導致了其脂肪族類關鍵呈香成分在種類及含量上的不同。

“栗香”綠茶中含量較高的差異化合物還包括香蘭素，又被稱為香草醛，該物質為酚酸類化合物。香蘭素具有香草豆的特殊香氣，在茶葉中主要參與黃酮及黃酮醇的生物合成過程，曾在西湖龍井茶中被檢測到[24]。此外，“栗香”綠茶中γ-氨基丁酸也被檢測到具有較高含量，該物質又可被稱為氨酪酸，作為一種非蛋白質天然氨基酸，γ-氨基丁酸具有降血壓、助眠、改善焦慮、抗癲癇等多種生理作用[25-27]。三羧酸循環(huán)是植物體內γ-氨基丁酸合成與代謝的主要步驟，即α-酮戊二酸經谷氨酸、γ-氨基丁酸、琥珀酸半醛作用生成琥珀酸[28]。茶葉中γ-氨基丁酸一般由L-谷氨酸在谷氨酸脫羧酶作用時脫羧基形成[29]，γ-氨基丁酸具有特殊的、類似肉類的氣味特征[30]。諸多研究表明，γ-氨基丁酸含量較高的綠茶在風味上與普通綠茶存在較大差異。例如，曾貞等[31]發(fā)現γ-氨基丁酸綠茶風味為紅棗香，同時帶有酸悶氣味，富含γ-氨基丁酸的綠茶中2,6-二叔丁基對甲基苯酚、十四酸甲酯、月桂酸甲酯、棕櫚酸甲酯的含量高于普通綠茶；江平[32]同樣認為γ-氨基丁酸綠茶的特征風味與脂肪酸酯密切相關。因此，γ-氨基丁酸的存在可能促進了“栗香”綠茶中脂肪酸酯含量的上升，在一定程度上助力了綠茶“栗香”品質的形成，然而γ-氨基丁酸作用于脂肪酸酯類化合物的途徑尚不明確。此外，“栗香”綠茶中山柰酚-3-O-蕓香糖苷的含量也高于“清香”綠茶，山柰酚-3-O-蕓香糖苷屬黃酮醇類化合物，是已報道的烤煙煙葉中的糖苷類香氣前體物質，可在煙草陳化燃燒過程中釋放香氣物質[17]，然而目前鮮見山柰酚-3-O-蕓香糖苷作用于茶葉香氣形成的相關研究，因此推測“栗香”綠茶加工過程中的烘烤干燥可能有利于山柰酚-3-O-蕓香糖苷的轉化。此外，綠茶中較為常見的糖苷類香氣前體物質，如櫻草糖苷、葡萄糖苷類、巢菜糖苷類物質，本實驗中未能全部檢測到，其主要原因可能與檢測方法有關，茶葉中的糖苷類香氣前體物質含量低，且存在紫外吸收光譜中沒有明顯峰的缺點，單純依靠液相色譜技術難以實現較為全面的檢測，因此本實驗未對該類成分進行富集分析。

3 結 論

本實驗考察“清香”及“栗香”綠茶中的非揮發(fā)性化學成分的差異情況，共檢測得到543 種非揮發(fā)性化合物，其中含量差異化合物有173 種；矢車菊素-半乳糖苷以及松柏苷在“栗香”和“清香”2 種香型綠茶中的含量差異最大；黃酮類化合物中，銀椴苷在“栗香”綠茶中具有最高的相對含量，而山柰酚-3-吡喃阿拉伯糖苷則在“清香”綠茶中具有最高的相對含量。多元統(tǒng)計分析表明，“清香”及“栗香”綠茶樣品可被顯著區(qū)分。

實驗發(fā)現了α-亞麻酸、棕櫚油酸、香蘭素、隱綠原酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、L-蛋氨酸以及γ-氨基丁酸共7 種對茶葉香氣品質形成有重要影響的非揮發(fā)性化合物；其中“栗香”綠茶中α-亞麻酸、棕櫚油酸、香蘭素、γ-氨基丁酸以及山柰酚-3-O-蕓香糖苷的相對含量高于“清香”綠茶，可能提高了“栗香”綠茶中脂肪族醇、醛、酮、脂肪酸酯等化合物的含量，從而貢獻了綠茶的栗香品質；而“清香”綠茶中隱綠原酸、L-蛋氨酸的相對含量則高于“栗香”綠茶，這2 種物質分別與綠原酸、甲硫基丙醛密切相關，隱綠原酸、L-蛋氨酸可能促進了“清香”綠茶中吡咯類及含硫類揮發(fā)性成分的生成。本實驗可為后續(xù)深入研究綠茶香氣品質化學提供參考。