王 嬋，李 榮,，吳 楊，王 穎，湯書(shū)華，譚 津，姜子濤,3,

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134；2.天津埃文森科技有限公司，天津 300384；3.天津天獅學(xué)院食品工程學(xué)院，天津 301700）

蓽茇（Piper longumL.）系胡椒科胡椒屬植物蓽茇的干燥近成熟或成熟果穗[1]。國(guó)內(nèi)主產(chǎn)于云南、廣西、廣東和福建等地。蓽茇作為調(diào)味香料，常與白芷、豆蔻、砂仁等配合使用，可用于食品的增香和除去異味，對(duì)去除動(dòng)物性原料如牛羊肉的腥臊味特別有效；蓽茇與桂皮、陳皮配合，可降低或改善食物的苦味。蓽茇精油（essential oil fromP.longumL.，EOPL）及生物堿類(lèi)化合物為蓽茇的主要有效成分，蓽茇具有抗胃潰瘍、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血脂、防治膽結(jié)石等作用[2-5]；關(guān)于蓽茇的化學(xué)成分，迄今關(guān)于生物堿的研究較多；EOPL僅有少量報(bào)道[6-8]，EOPL的主要成分為大根香葉烯和石竹烯等。鑒于EOPL具有一定的抗氧化[9-10]、抗炎和抗菌[11]活性，且不同產(chǎn)地、不同提取方法會(huì)使EOPL成分產(chǎn)生一定的差異，有必要對(duì)EOPL的成分進(jìn)行進(jìn)一步研究。

精油大多是由萜烯及萜烯類(lèi)含氧衍生物構(gòu)成的，因此精油具有一定的清除自由基即抗氧化活性。評(píng)價(jià)精油清除自由基活性的方法一般采用體外抗氧化活性法，其包括化學(xué)法[12-14]和細(xì)胞抗氧化法[15-17]。這些方法雖然簡(jiǎn)單易行，但只能用于評(píng)價(jià)精油的總體抗氧化活性，卻無(wú)法測(cè)定精油中每一個(gè)成分清除自由基及抗氧化活性的大小。本實(shí)驗(yàn)采用超快速氣相色譜電子鼻（gas chromatography-based electronic nose，GC-E-nose）技術(shù)[18-19]快速鑒定EOPL的化學(xué)成分，并與氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析結(jié)果進(jìn)行比較；利用GC-E-nose結(jié)合化學(xué)抗氧化法，無(wú)需費(fèi)時(shí)費(fèi)力的單體分離過(guò)程，直接對(duì)所有EOPL成分清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）陽(yáng)離子自由基和羥自由基的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并從分子結(jié)構(gòu)的角度闡明EOPL成分的抗氧化機(jī)理，建立EOPL成分結(jié)構(gòu)與抗氧化活性之間的構(gòu)效關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓽茇樣品購(gòu)自四川，粉碎后過(guò)篩備用；C6～C16正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)混合物 法國(guó)Alpha MOS公司；C8～C40正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)混合物 美國(guó)AccuStandard公司；DPPH、ABTS、過(guò)硫酸鉀（K2S2O8） 美國(guó)Sigma公司；無(wú)水硫酸鈉、無(wú)水乙醇和硫酸亞鐵等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Heracles II電子鼻、MTX-5超快GC色譜柱（10 m×0.18 mm，0.4 μm） 法國(guó)Alpha MOS公司；Trace 1310 TSQ 8000 Evo GC-MS聯(lián)用儀、TR-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國(guó)Thermo Fisher公司；Multisynth微波反應(yīng)器 意大利Milestone公司；Lambda 25紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)PerkinElmer公司；AUY120萬(wàn)分之一電子天平 日本島津公司；FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；DK-S12型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 EOPL的提取

稱(chēng)取適量蓽茇粉末，放入超聲-微波反應(yīng)器的提取瓶中，以蒸餾水為提取劑，采用單因素試驗(yàn)對(duì)植物組織破碎和EOPL提取條件進(jìn)行優(yōu)化，在最佳破碎條件（微波功率700 W、微波溫度95 ℃、微波時(shí)間3 min）和最佳提取條件（微波功率500 W、微波溫度95 ℃、料液比1∶10（g/mL））下提取EOPL，得到的EOPL經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后，用0.22 μm有機(jī)濾膜，于棕色瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 EOPL化學(xué)成分分析

1.3.2.1 GC-E-nose鑒定EOPL化學(xué)成分

取一定量待測(cè)樣品于頂空瓶中，GC-E-nose色譜柱MTX-5（10 m×0.18 mm，0.4 μm），捕集阱溫度40 ℃，進(jìn)樣口溫度200 ℃，檢測(cè)器溫度250 ℃，采集時(shí)間215 s，采用程序升溫：以1 ℃/s升溫速率由50 ℃（初始等溫時(shí)間2 s）升到250 ℃（維持10 s），以氫氣作為載氣。以C6～C16正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比測(cè)定出EOPL中每一個(gè)化合物的保留指數(shù)，再通過(guò)GC-E-nose Arochembase數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，確定EOPL的化學(xué)成分。

1.3.2.2 GC-MS鑒定EOPL化學(xué)成分

參照文獻(xiàn)[20]中的GC-MS條件稍作改進(jìn)。TR-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：初始溫度50 ℃，以10 ℃/min升溫至120 ℃，以2 ℃/min升溫至180 ℃，以20 ℃/min升溫至280 ℃，最后280 ℃恒溫10 min；載氣（He）流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量0.4 μL；分流比60∶1。電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度260 ℃；傳輸線(xiàn)溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z50～450。

以C8～C40正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比測(cè)定化合物的保留指數(shù)。利用系統(tǒng)自帶的Mainlib Library和Replib Library質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，并結(jié)合保留指數(shù)對(duì)EOPL化學(xué)成分進(jìn)行定性，確認(rèn)EOPL的化學(xué)成分。

1.3.3 GC-E-nose篩選清除自由基活性成分

1.3.3.1 清除DPPH自由基活性成分

取500 μL 10.0 mg/mL EOPL乙醇溶液和等體積10 mmol/L的DPPH-乙醇溶液，室溫下避光反應(yīng)30 min為實(shí)驗(yàn)組；另外，相同條件下以等體積無(wú)水乙醇代替DPPH溶液作為對(duì)照組，按照1.3.2.1節(jié)進(jìn)行GC-E-nose分析。以EOPL各組分與DPPH溶液反應(yīng)前后峰面積變化[21-22]計(jì)算清除率，以表征EOPL各組分對(duì)DPPH自由基的清除活性強(qiáng)弱。清除率按式（1）計(jì)算：

式中：A0為對(duì)照組EOPL各成分峰面積，即未與自由基反應(yīng)的各成分峰面積；Ai為實(shí)驗(yàn)組EOPL各成分峰面積，即與自由基反應(yīng)后剩余的各成分峰面積。

1.3.3.2 清除ABTS陽(yáng)離子自由基活性成分

將7.4 mmol/L的ABTS和2.6 mmol/L K2S2O8等體積混合，用無(wú)水乙醇稀釋10 倍為ABTS工作液。取500 μL EOPL乙醇溶液（10 mg/mL）和500 μL ABTS工作液，室溫下避光反應(yīng)30 min為實(shí)驗(yàn)組。另外，以等體積的乙醇溶液代替ABTS工作液作為對(duì)照組，進(jìn)行GC-E-nose分析，以各成分峰面積變化計(jì)算清除率，以表征EOPL各組分對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除活性強(qiáng)弱。清除率按式（1）計(jì)算。

1.3.3.3 清除羥自由基活性成分

將250 μL FeSO4溶液（1.0 mol/L）、500 μL EOPL乙醇溶液（10 mg/mL）以及250 μL H2O2溶液（15%）混合均勻后于室溫避光反應(yīng)30 min為實(shí)驗(yàn)組。另外，以等體積的除氧蒸餾水代替FeSO4溶液和H2O2溶液作為對(duì)照組，進(jìn)行GC-E-nose分析。以各成分峰面積變化計(jì)算自由基清除率，以表征EOPL各組分對(duì)羥自由基的清除活性強(qiáng)弱。清除率按式（1）計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 EOPL的GC-E-nose鑒定結(jié)果

如表1、圖1所示，GC-E-nose所用的檢測(cè)器為氫火焰檢測(cè)器（hydrogen flameionization detector，F(xiàn)ID），而GC-MS所用的檢測(cè)器為質(zhì)譜檢測(cè)器，后者的靈敏度比FID高。由于檢測(cè)器的不同和靈敏度的差異，GC-E-nose檢測(cè)出EOPL共34 種成分，占精油總量的87.8%，主要成分為大根香葉烯（26.04%）、石竹烯（13.57%）、順式-茴香腦（8.87%）及β-甜沒(méi)藥烯（7.32%）。GC-MS檢測(cè)出39 種成分，占精油總量的91.6%。GC-E-nose與GC-MS檢測(cè)有34 種成分一致，兩者符合度達(dá)89.7%。另外，GCE-nose同樣具有強(qiáng)大的數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)功能，且其檢測(cè)時(shí)間用時(shí)較短，一般只需200～300 s，比GC-MS快14 倍，說(shuō)明采用GC-E-nose對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行快速定性分析可行，與GC-MS對(duì)比檢測(cè)速率有明顯的優(yōu)勢(shì)。

圖1 EOPL的GC-E-nose色譜圖（A）與GC-MS總離子流圖（B）Fig.1 GC-E-nose chromatogram (A) and GC-MS (B) total ion current chromatogram of EOPL

2.2 清除自由基活性成分的識(shí)別

2.2.1 清除DPPH自由基活性成分的識(shí)別

如圖2和表2所示，EOPL中有12 種成分對(duì)DPPH自由基均有一定的清除效果，但清除能力各不相同，依次為順式-茴香腦＞大根香葉烯＞反式-肉桂酸甲酯＞桉葉油醇二烯＞十五烯＞石竹烯＞α-金合歡烯＞氧化石竹烯＞反式羅勒烯＞β-甜沒(méi)藥烯＞蛇麻烯氧化物。其中順式-茴香腦和大根香葉烯表現(xiàn)出很強(qiáng)的DPPH自由基清除活性，清除率分別為78.1%和67.9%。

圖2 EOPL清除DPPH自由基的GC-E-nose色譜圖Fig.2 GC-E-nose chromatogram showing EOPL’s scavenging capacity against DPPH radicals

表2 EOPL活性成分對(duì)DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基及羥自由基的清除能力Table 2 DPPH radicals, ABTS cation radicals and hydroxyl radicals Scavenging capacity of bioactive components in EOPL

在清除DPPH自由基較強(qiáng)的化合物中，共同點(diǎn)是多數(shù)化合物中均含有碳碳雙鍵（C＝C），C＝C導(dǎo)致其鄰位碳上的α-H較活潑，使C—H鍵易斷裂發(fā)生H原子轉(zhuǎn)移（hydrogen atom transfer，HAT）反應(yīng)[23]，H與DPPH自由基結(jié)合生成穩(wěn)定的DPPH—H。大根香葉烯含有多個(gè)C＝C，在3、4號(hào)位點(diǎn)上的碳?xì)滏I更容易斷裂，其α-H也較多，在傳遞H時(shí)，多位點(diǎn)均可以傳遞H原子，相比較而言共軛體系[24-25]中的C＝C更容易給出H原子，因此大根香葉烯表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除DPPH自由基活性。而順式-茴香腦清除DPPH自由基活性最強(qiáng)，可能是因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)中除了含有活潑的α-H同時(shí)還含有醚鍵（—C—O—C—）不穩(wěn)定，在乙醇溶液中水解為醇羥基，O—H極性較強(qiáng)，容易斷裂，鍵斷裂后也可以提供H，通過(guò)HAT與DPPH自由基上的電子結(jié)合而生成DPPHH。清除DPPH自由基的機(jī)理如圖3所示。

圖3 清除DPPH自由基反應(yīng)機(jī)理Fig.3 Mechanism for scavenging of DPPH radicals

2.2.2 清除ABTS陽(yáng)離子自由基活性成分的識(shí)別

如圖4和表2所示，EOPL中有10 種成分對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基均有一定的清除效果，但清除能力各不相同，依次為氧化石竹烯＞十五烯＞石竹烯＞大根香葉烯＞順式-茴香腦＞α-金合歡烯＞β-甜沒(méi)藥烯＞蛇麻烯氧化物＞乙酸冰片酯＞反式羅勒烯。其中氧化石竹烯與順式-茴香腦對(duì)清除ABTS陽(yáng)離子自由基均有很強(qiáng)的活性，清除率為87.0%和77.1%。

圖4 EOPL清除ABTS陽(yáng)離子自由基的GC-E-nose色譜圖Fig.4 GC-E-nose chromatogram showing EOPL’s scavenging capacity against ABTS cation radicals

氧化石竹烯與順式-茴香腦結(jié)構(gòu)中均含有醚鍵（—C—O—C—），反應(yīng)機(jī)理分為3 步，第1步，—C—O—C—不穩(wěn)定，在醇溶液中，醚鍵斷裂生成醇羥基，醇羥基電離出H+生成了氧負(fù)離子；第2步，氧負(fù)離子提供一個(gè)單電子與ABTS陽(yáng)離子自由基上的單電子結(jié)合[26]；第3步，電離的H+與氮上的共用電子對(duì)結(jié)合，生成穩(wěn)定的ABTSH。清除ABTS陽(yáng)離子自由基的反應(yīng)機(jī)理主要是通過(guò)質(zhì)子優(yōu)先損失電子轉(zhuǎn)移機(jī)制[27]，反應(yīng)機(jī)理如圖5所示。

圖5 清除ABTS陽(yáng)離子自由基反應(yīng)機(jī)理Fig.5 Reaction mechanism for scavenging of ABTS cation radicals

2.2.3 清除羥自由基活性成分的識(shí)別

如圖6和表2所示，EOPL中有21 種成分對(duì)羥自由基均有一定的清除效果，但清除能力各不相同，依次為右旋萜二烯＞反式羅勒烯＞β-蒎烯＞左旋樟腦＞α-蒎烯＞芳樟醇＞α-香柑油烯＞順式-茴香腦＞丁香酚＞古巴烯＞大根香葉烯＞反式-肉桂酸甲酯＞桉葉油醇二烯＞花柏烯＞十五烯＞β-甜沒(méi)藥烯＞氧化石竹烯＞乙酸冰片酯＞十六醛＞石竹烯＞β-金合歡烯。其中右旋萜二烯、反式羅勒烯和β-蒎烯對(duì)清除羥自由基的活性較高，清除率分別為71.6%、67.8%和66.6%。

右旋萜二烯、反式羅勒烯、β-蒎烯結(jié)構(gòu)中均含有雙鍵，研究表明，萜烯類(lèi)和倍半萜烯類(lèi)化合物和烯烴化合物含有雙鍵，可以加成羥自由基形成二級(jí)基團(tuán)，因此表現(xiàn)出較好的羥自由基清除能力[28]。在與羥自由基發(fā)生加成反應(yīng)，自由基對(duì)α-烯烴的加成方向總是優(yōu)先選擇末取代端[29-30]，因此右旋萜二烯中1、2號(hào)位的雙鍵容易與羥自由基加成，同理反式羅勒烯的5、6號(hào)位與β-蒎烯中的1、2號(hào)雙鍵易發(fā)生加成反應(yīng)。清除羥自由基的機(jī)理如圖7所示。

圖7 清除羥自由基反應(yīng)機(jī)理Fig.7 Mechanism for scavenging of hydroxyl radicals

3 結(jié) 論

采用GC-E-nose鑒定EOPL的化學(xué)成分，與GC-MS的檢測(cè)結(jié)果相比，符合度高達(dá)89.7%。此結(jié)果表明，GC-E-nose用于精油等揮發(fā)性成分的結(jié)構(gòu)鑒定切實(shí)可行。而且整個(gè)定性過(guò)程僅需要200～300 s，以現(xiàn)有其他技術(shù)手段難以實(shí)現(xiàn)。采用GC-E-nose結(jié)合化學(xué)法對(duì)復(fù)雜的精油樣品中每一個(gè)化學(xué)成分其清除自由基和抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，沒(méi)有涉及到費(fèi)時(shí)費(fèi)力的單體分離過(guò)程。并從分子的角度對(duì)清除DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基和羥自由基的反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行理論解釋?zhuān)沂静煌衔锴宄杂苫幕钚圆町悾煌杂苫淝宄龣C(jī)理也不同；建立EOPL的化合物結(jié)構(gòu)與抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系。本研究為從復(fù)雜混合物中快速篩選和評(píng)價(jià)生物活性成分提供了一個(gè)較優(yōu)的解決思路。