王亞玲,趙軍英,喬為倉,張明輝,劉 妍,陳歷俊
(北京三元食品股份有限公司,國家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心,北京市乳品工程技術(shù)研究中心,母乳研究技術(shù)創(chuàng)新中心,北京 100163)
母乳是嬰兒最理想的天然食物[1-3],可滿足嬰兒生長發(fā)育的實時需求[4]。母乳含有嬰兒生長所必需的各種營養(yǎng)素[5],如高品質(zhì)的蛋白質(zhì)、易消化的乳脂肪、獨特的乳糖、豐富的礦物質(zhì)和多種維生素。礦物質(zhì)作為母乳中重要的營養(yǎng)素,對嬰兒的正常生理功能和生長發(fā)育有無可替代的作用。
母乳中的礦物質(zhì)包括K、Ca、Na、Mg、P等常量元素,還包括Cu、Mn、Zn、Fe、Se等必需微量元素及Pb、Cr、Hg、As等其他元素[6]。目前母乳中礦物元素的測定方法主要有火焰原子吸收光譜(flame atomic absorption spectrometry,AAS)法[7-9]、火焰原子發(fā)射光譜(atomic emission spectrometry,AES)法[10]、原子熒光光譜(atomic fluorescence spectrometry,AFS)法[11-13]、紫外-可見分光光度(ultraviolet-visible spectrophotometry,UVVIS)法[14-15]、離子色譜(ion chromatography,ICP)法[16]、電感耦合等離子體-發(fā)射光譜(inductively coupled plasmaatomic emission spectrometry,ICP-AES)法[17-19]、電感耦合等離子體-質(zhì)譜(inductively coupled plasma-mass spectrometry,ICP-MS)法[20-22]等。其中,ICP-MS法是檢測母乳中礦物元素含量的最常用方法[23-25],其具有樣品需求量少、分析速度快、準(zhǔn)確度和靈敏度高、檢測限低、線性范圍寬等優(yōu)點[6],不僅可以檢測樣品中多種礦物元素含量,還克服了AAS、AES、AFS、UV-VIS法測定單個元素、分析速度慢的缺點,同時分析了以上方法不能檢測的元素,是強有力的元素分析技術(shù)[6],已廣泛應(yīng)用于乳品[26]、嬰幼兒配方食品[27]等。我國已將ICP-MS法列入GB 5009.268—2016《食品中多元素的測定》[28],用于食品中多元素的測定。
目前國內(nèi)外關(guān)于母乳中礦物元素的研究熱點多集中在研究單一元素,或一類含量水平相近的元素,缺少全面分析母乳中礦物質(zhì)水平的研究[6]。因此,建立中國母乳數(shù)據(jù)庫,研究母乳中礦物質(zhì)水平及影響因素需要快速、準(zhǔn)確、靈敏的高通量檢測技術(shù),其不僅解決了樣本量少、耗時長的問題[29],還實現(xiàn)了大批量樣本的快速檢測。國內(nèi)外已有研究人員將微波消解-電感耦合等離子體-質(zhì)譜(microwave digestion-inductively coupled plasmamass spectrometry,MD-ICP-MS)法應(yīng)用于高通量測定嬰幼兒配方奶粉[27,30]、乳品[26]、母乳[31]及其他食品[32-33]的礦物元素,如高亦軍等[30]采用MD-ICP-MS法同時檢測配方乳粉中14 種礦物元素的含量;陳歷俊等[26]應(yīng)用ICPMS法高通量檢測原料乳及乳制品中15 種礦物元素的含量;Khan等[27]采用ICP-MS法同時測定嬰幼配方粉中Cr、Mo、Se含量;Astolfi等[31]應(yīng)用高通量ICP-MS法測定人乳中34 種礦物元素含量;Wei Yihua等[32]采用MD-ICPMS法同時測定富硒大米中Se和其他礦物元素的含量;Chevallier等[33]采用MD-ICP-MS法同時測定食品樣品中31 種礦物元素含量等,而已有文獻中有關(guān)應(yīng)用悶罐消解-電感耦合等離子體-質(zhì)譜(sealed digestion-inductively coupled plasma-mass spectrometry,SD-ICP-MS)法高通量檢測母乳中礦物元素含量的研究報道相對較少。
與ICP-MS法檢測母乳相配套的常用前處理方法[28]主要有微波消解法和壓力罐消解法。微波消解法于高溫測定Se等易揮發(fā)元素的結(jié)果偏低。壓力罐消解法要求在全密封的罐內(nèi)消解樣品,所以可測定易揮發(fā)、易損失元素,防止樣品損失,減少試劑消耗,因此壓力罐消解法是消解含有微量元素及痕量元素樣品的有效方法。
由于母乳樣品較難獲得且樣品量有限,實驗采用高壓悶罐消解法對母乳樣品進行前處理,利用ICP-MS法高通量測定母乳的K、Ca、Na、Mg、P、Cu、Mn、Zn、Fe、Se共10 種礦物元素的含量,在較寬的濃度范圍內(nèi),實現(xiàn)高通量、快速、準(zhǔn)確分析母乳的多種礦物元素。實驗還統(tǒng)計了北京地區(qū)母乳中礦物元素的含量,以期對中國母乳數(shù)據(jù)庫的建立提供一定的參考。
母乳樣品采自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院和北京市通州區(qū)婦幼保健院[34],共收集211 例樣本,所有樣品在采集后均貯存于-80 ℃超低溫冰箱。
濃硝酸、過氧化氫(均為優(yōu)級純) 北京化學(xué)試劑研究所;K、Ca、Na、Mg、Cu、Mn、Zn、Fe、Rh單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL),Se單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL),奶粉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW10017),脫脂奶粉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08509) 中國計量科學(xué)研究院;P單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL) 國家有色金屬及電子材料分析測試中心;Be、Ce、Fe、In、Li、Mg、Pb、U調(diào)諧溶液(1 μg/L) 美國PerkinElmer公司;實驗用水均為超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm),所用器皿均在稀釋成質(zhì)量分?jǐn)?shù)20.0%的硝酸溶液(原質(zhì)量分?jǐn)?shù)69.0%)中浸泡24 h以上,并用超純水沖洗,烘干備用。
NexION 350D ICP-MS儀 美國Perkin Elmer公司;恒溫電熱板 濟南精密科學(xué)儀器儀表有限公司;Milli-Q超純水機 美國Merck Millpore公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;BP 210S電子天平德國Sartorius公司;密閉高壓消解罐(配有聚四氟乙烯消解內(nèi)罐) 南京瑞尼克科技開發(fā)有限公司。
1.3.1 儀器校正與參數(shù)
儀器開機預(yù)熱后,用質(zhì)量濃度1 μg/L的Be、Ce、Fe、In、Li、Mg、Pb、U質(zhì)譜調(diào)諧液調(diào)試儀器,使儀器的靈敏度、氧化物、雙電荷和分辨率等各項指標(biāo)達到測定要求的參數(shù)如下:9Be>2 000、115In>40 000、238U>30 000、220Bkgd(background)≥3、156CeO/140Ce≤2.5%、Ce++/140Ce<3%,霧化器氣體流量、輔助氣體流量、等離子氣體流量分別為0.92、1.20、18.00 L/min,ICP射頻功率為1 600 W,模擬階段電壓、脈沖階段電壓分別為-1 800、1 100 V。
1.3.2 光譜校正液的配制
準(zhǔn)確吸取0.1 mL Rh單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的硝酸-高純水為介質(zhì)定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)儲備溶液;搖勻后,再次準(zhǔn)確吸取1 mL質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)儲備溶液于500 mL容量瓶中,用硝酸-高純水為介質(zhì)定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度為20.0 ng/mL混合內(nèi)標(biāo)溶液,室溫儲存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.3 樣品前處理
準(zhǔn)確稱取母乳樣品1.00 g于消解內(nèi)罐中,加入4 mL濃硝酸和2 mL過氧化氫溶液,蓋好內(nèi)蓋,旋緊不銹鋼外套,置于恒溫干燥箱中,于150~170 ℃保持4~5 h,冷卻至室溫后,緩慢旋松不銹鋼外套,將樣品從消解內(nèi)罐取出,在控溫電熱板上于100 ℃趕酸至液體剩余約0.5 mL,將消解液轉(zhuǎn)移至定容離心管中,用超純水洗滌消解罐3~4 次,合并洗液,定容至25 mL,搖勻、過濾后待測。同時,以同樣的方法制備空白對照組樣品、奶粉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和脫脂奶粉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)消解液。
采用Microsoft Excel 2013進行實驗數(shù)據(jù)處理,對奶粉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、脫脂奶粉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的10 種元素運用單因素方差分析后,運用同種分析方法統(tǒng)計不同泌乳階段母乳礦物元素的含量,結(jié)果以±s表示,以此判斷母乳中不同礦物元素含量隨泌乳時間的變化趨勢。
分析母乳待測元素過程中,可能受到樣品基體組分及其相關(guān)的多原子離子、氬相關(guān)多原子離子的干擾,為解決這些光譜干擾,實驗采用動態(tài)反應(yīng)池(dynamic reaction cell,DRC)法解決以上類型的光譜干擾,利用反應(yīng)氣如O2或NH3選擇性去除多原子離子,降低較高質(zhì)量信號的可能干擾。此外,分析信號會由于基體干擾而隨時間發(fā)生漂移,為了降低信號漂移造成的誤差,改善分析精度,實驗采用質(zhì)量濃度20 ng/mL的Rh單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液作為在線內(nèi)標(biāo)液監(jiān)測和校正基體效應(yīng)以減少非質(zhì)譜干擾。實驗優(yōu)化的背景等效濃度(background equivalent concentration,BEC)、檢出限(limit of detection,LOD)、反應(yīng)池四極桿參數(shù)(reaction parameter quadrupole,RPQ)等數(shù)據(jù)如表1所示。
表1 質(zhì)譜主要干擾及DRC參數(shù)Table 1 Major mass spectral interferences and DRC parameters
根據(jù)母乳中不同元素的含量,選擇合適的質(zhì)量濃度范圍繪制元素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,如表2所示,10 種元素的線性回歸方程相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999 0。按照1.3.2節(jié)的方法對母乳樣品、奶粉生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及脫脂奶粉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)平行稱量5 次進行消解處理后測定不同元素的含量,計算測定方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD),結(jié)果表明,RSD均小于5.0%,因此實驗方法的精密度良好。通過測量11 次樣品的空白組所得標(biāo)準(zhǔn)偏差的3 倍計算各元素LOD,結(jié)果顯示LOD在0.8~13.0 μg/L范圍內(nèi)。
表2 ICP-MS法檢測10 種元素的線性方程、相關(guān)系數(shù)及LODTable 2 Linear calibration equations, correlation coefficients and detection limits of ICP-MS for 10 elements
為了確定該方法的準(zhǔn)確性,實驗對奶粉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和脫脂奶粉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行驗證,結(jié)果如表3所示,所有元素測定的結(jié)果均在2 個標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)示值范圍內(nèi),其能滿足常量元素和痕量元素的分析要求。
表3 奶粉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和脫脂奶粉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的10 種元素測定結(jié)果(n=5)Table 3 Measured and actual contents of 10 elements in milk powder certified reference material and skimmed milk powder certified reference material (n= 5)
消解前,在母乳樣品中加入不同質(zhì)量濃度10 種元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個樣品分別添加3 個不同水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個質(zhì)量濃度做3 個平行樣,分別測定11 次,并計算出10 種元素含量的RSD,結(jié)果見表4。實驗的加標(biāo)回收率在80.00%~118.19%,RSD均小于10.0%,因此實驗方法準(zhǔn)確、可靠。
表4 樣品的加標(biāo)回收率及精密度(n=11)Table 4 Average recoveries and precision for 10 elements in spiked samples (n= 11)
續(xù)表4
實驗測定了我國北京地區(qū)的初乳、過渡乳、成熟乳中常量元素和微量元素的含量,共檢測了211 例母乳樣本的10 種礦物元素,其中初乳、過渡乳、成熟乳分別為22、32、157 例。如表5所示,人乳中總礦物元素的水平與泌乳階段有關(guān),隨泌乳期的延長,母乳中礦物元素的含量逐漸減小。
表5 不同泌乳階段母乳礦物元素的含量Table 5 Contents of 10 elements in breast milk at different lactation stages
實驗建立了SD-ICP-MS法測定母乳的礦物元素,并分別測定了不同泌乳階段母乳中10 種礦物元素的含量。實驗采用器皿密閉性好、待測元素不易損失、試劑用量少、消化徹底等優(yōu)點的高壓密閉消解法對母乳樣品進行前處理,因此有效避免了其他復(fù)雜的前處理步驟可能帶來交叉污染和待測元素?fù)p失的風(fēng)險,同時大幅提升了實驗通量和效率。實驗通過在線加入內(nèi)標(biāo)液和DRC法消除實驗中復(fù)雜多原子離子帶來的質(zhì)譜干擾以及其他可能出現(xiàn)的干擾,選用Rh為內(nèi)標(biāo)元素對基體效應(yīng)和信號漂移進行校正。由于樣品的測量時間為3~5 min,因此本實驗可準(zhǔn)確、快速測定批量母乳的多種元素。實驗不僅統(tǒng)計了北京地區(qū)母乳中礦物元素的含量,還為建立中國母乳數(shù)據(jù)庫提供了支持。