李一娟，邵開生，張 娜，孟迎平，陶雪瑩，周穎鈺，魏 華,2，張志鴻,2,

（1.南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學 中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

隨著抗生素的濫用，超級細菌及環(huán)境污染問題日益嚴重，迫切需要開發(fā)有效、綠色無污染的抗生素替代品。羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）作為一種廣泛存在于脊椎動物腸道的共生微生物，是腸道微生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌群，長期作為益生菌使用，在預防腹瀉[1]、改善膽固醇代謝[2]、緩解抑郁癥[3]及降低嬰幼兒哭鬧[4]等方面具有重要功能。Reuterin是羅伊氏乳桿菌代謝甘油產(chǎn)生的一種特有廣譜抗菌物質(zhì)，它是一種復雜混合物，主成分為3-羥基丙醛，對多種病原微生物均有較強的抑制作用，在生物防腐方面極具潛力[5]。

動物宿主中分離的羅伊氏乳桿菌在進化過程中會形成菌株適應(yīng)性，依據(jù)多位點序列分析，可分為6 種家系，分別對應(yīng)不同動物類型[6]，其中第6種家系的菌株主要來自家禽或人體，攜帶pdu基因簇概率高。該基因簇的一個重要作用是編碼產(chǎn)生具有抗菌作用的Reuterin，而第6種家系的菌株利用甘油代謝產(chǎn)Reuterin的量高于其他家系[7]。目前，國內(nèi)外多數(shù)研究報道從雞、豬、鼠、嬰兒和成人的糞便中分離到羅伊氏乳桿菌，而從健康家禽糞便中篩選產(chǎn)Reuterin的羅伊氏乳桿菌的報道相對較少。為此，本研究利用選擇培性養(yǎng)基從健康家禽糞便中定向篩選產(chǎn)Reuterin的羅伊氏乳桿菌，并評價其生物學活性，以期為益生菌的開發(fā)和利用提供候選菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮家禽（雞、鴨和鴿）糞便樣品取自當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場，數(shù)量分別為4、2、2 份；大腸埃希氏桿菌O157:H7、鼠傷寒沙門氏菌ATCC13311、單核細胞性李斯特菌CMCC54007、金黃色葡萄球菌CMCC26003為實驗室保藏的菌株。

MRS培養(yǎng)基 英國Oxoid公司；DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）培養(yǎng)基 北京索萊寶生物科技有限公司；抗生素（用于試紙擴散法） 浙江省溫州市康泰生物科技有限公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-50A型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅醫(yī)療生物儀器有限公司；Anaerobic IV型多功能厭氧培養(yǎng)箱 美國GeneScience公司；H1650-W型臺式離心機長沙湘儀離心機儀器有限公司；DYY-6C凝膠水平電泳儀北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基及試劑的配制

羅伊氏乳桿菌選擇性培養(yǎng)基（L.reuteriisolation medium，LRIM）：稱取15.0 g棉子糖、15.0 g乙酸鈉、10.0 g蛋白胨、6.0 g磷酸二氫鉀、5.0 g酵母提取物、2.0 g醋酸銨、1.32 mL冰醋酸、1.0 g吐溫80、0.57 g硫酸鎂、0.12 g硫酸錳、0.003 g硫酸亞鐵，加蒸餾水定容至1 000 mL，固體培養(yǎng)基需加入15 g瓊脂，121 ℃高壓滅菌15 min[8]；模擬胃液：3.0 g/L胃蛋白酶，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶解，pH值調(diào)至3.0；模擬十二指腸液：10.0 g/L牛膽鹽，PBS溶解，pH值調(diào)至8.0；模擬腸液：1.0 g/L胰蛋白酶，3.0 g/L牛膽鹽，PBS溶解，pH值調(diào)至8.0，分別過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆肹9-10]。

1.3.2 乳酸菌分離

稱取新鮮家禽糞便1 g，加入9 mL無菌PBS，振蕩充分混勻后，依次進行10 倍梯度稀釋，分別取100 μL的10－3～10－5梯度稀釋液涂布于LRIM平板上，將平板倒置于厭氧培養(yǎng)箱中45 ℃培養(yǎng)48 h[8]，顯微鏡觀察并記錄形態(tài)[11]。

1.3.3 16 S rDNA同源性分析

選取形態(tài)為桿狀的單菌落進行后續(xù)菌落聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），利用16S rRNA通用引物27F和1492R（表1）進行基因片段擴增，產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測定核酸序列，將測定結(jié)果中的堿基序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，初步確定菌株種屬，進一步與數(shù)據(jù)庫中菌屬比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其具體種屬。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR

1.3.4 羅伊氏乳桿菌編碼Reuterin基因的篩查

Reuterin是羅伊氏乳桿菌pdu基因簇編碼產(chǎn)生的，利用pduC特異性引物（表1）構(gòu)建PCR特異性識別體系，10 μL 2×TaqPCR Master Mix，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，雙蒸水補充至總體積為20 μL，石蠟油液封。反應(yīng)條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32 次循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，擴增產(chǎn)物長度為121 bp。其中，羅伊氏乳桿菌的基因組DNA的提取方法為熱裂解法[12]，提取后－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 羅伊氏乳桿菌甘油發(fā)酵產(chǎn)Reuterin

Reuterin的產(chǎn)生方法參照文獻[15]。將活化好的羅伊氏乳桿菌以1%的量接種于MRS培養(yǎng)液中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，4 000 r/min離心5 min，棄上清液，PBS洗滌菌體一次，用250 mmol/L甘油重懸菌體（～109CFU/mL），37 ℃孵育2 h，12 000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，4 ℃保存，備用。

1.3.6 Reuterin的定量

采用比色法定量Reuterin[15]，取100 μL上述濾液，加入75 μL色氨酸溶液（0.01 mol/L色氨酸溶于0.05 mol/L HCl溶液中），接著加入300 μL濃HCl，37 ℃條件下孵育30 min后呈紫色，于560 nm波長處測定OD值，蒸餾水代替濾液作為陰性對照。以0、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0 mg/mL的丙烯醛溶液代替濾液進行上述反應(yīng)，以質(zhì)量濃度為橫坐標，OD560nm為縱坐標繪制標準曲線，用于定量Reuterin。

1.3.7 羅伊氏乳桿菌的耐受性

1.3.7.1 耐酸耐膽鹽能力

將羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液于4 000 r/min、4 ℃條件下離心3 min，棄上清液，PBS洗滌菌體2 次，以1%的量接種于pH值分別為2.5、3.5的MRS培養(yǎng)液中，37 ℃厭氧培養(yǎng)，分別于0、3、6 h取樣并進行活菌計數(shù)。同樣將羅伊氏乳桿菌接種于牛膽鹽質(zhì)量濃度為1.5 g/L的MRS培養(yǎng)液中，分別于0、3、6 h取樣后進行活菌計數(shù)。

1.3.7.2 耐受模擬消化道環(huán)境能力

參考Nikolic等[16]的方法，并稍加改進。取羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液于8 000 r/min、4 ℃離心4 min，PBS洗滌菌體2 次，重懸于1.9 mL模擬胃液和0.1 mL 10%脫脂乳中，37 ℃有氧培養(yǎng)90 min后（胃與呼吸道相連，有部分氧氣存在），取100 μL菌液進行活菌計數(shù)；離心后，用1.9 mL模擬十二指腸液重懸菌體，厭氧培養(yǎng)10 min后，取100 μL菌液進行活菌計數(shù)；離心后，用1.8 mL模擬腸液重懸菌體，厭氧條件下培養(yǎng)2 h后，取100 μL菌液進行活菌計數(shù)。

1.3.7.3 耐受過氧化氫能力

參照Shi Yunjia等[17]的方法，將羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液于4 000 r/min、4 ℃條件下離心3 min，棄上清液，PBS洗滌菌體2 次，以1%的量接種于過氧化氫濃度分別為0.6、1.0 mmol/L的MRS培養(yǎng)液中，分別于0、3、6 h取樣，并進行活菌計數(shù)。

1.3.8 抗生素敏感性

依照文獻報道的試紙擴散法（K-B法）[18]，將羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液濃度調(diào)整至105～106CFU/mL，取100 μL均勻涂布于MRS平板上，待平板表面稍干，將抗生素藥敏紙片均勻放置于表面，輕輕按壓使紙片貼合，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，測量透明圈直徑。

1.3.9 甘油發(fā)酵上清液的抑菌能力

利用牛津杯法評估羅伊氏乳桿菌發(fā)酵甘油后的抑菌活性[19]。將羅伊氏乳桿菌接種于含250 mmol/L甘油的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，取過夜培養(yǎng)的指示菌懸液200 μL，濃度約為107CFU/mL，均勻涂布于LB固體平板上，室溫晾干后，均勻放置3 個牛津杯（直徑為（7.8±0.1）mm），輕輕加入200 μL羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液上清液，將平板移至恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)12 h后，測量抑菌圈大小。非甘油發(fā)酵的上清液為對照組，即羅伊氏乳桿菌在不加甘油的MRS培養(yǎng)液中培養(yǎng)后的上清液。

1.3.10 羅伊氏乳桿菌黏附能力

將貼壁HT-29細胞轉(zhuǎn)移至含10%胎牛血清和雙抗（100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素）的DMEM細胞培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至細胞形態(tài)和生長狀態(tài)良好。根據(jù)文獻報道方法[20]，評價羅伊氏乳桿菌的黏附能力，首先調(diào)整細胞濃度至2.5×105個/孔（6 孔板），待細胞形成單細胞層，用HANK’S清洗細胞2 次，每孔加2 mL用不含雙抗的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整的羅伊氏乳桿菌懸液（～108CFU/mL），孵育2 h，棄培養(yǎng)液，HANK’S沖洗2 次，胰蛋白酶進行消化，接著用MRS培養(yǎng)液沖洗細胞至脫落，梯度稀釋后進行菌落計數(shù)。黏附率以黏附于細胞上的羅伊氏乳桿菌數(shù)對數(shù)與初始細菌總數(shù)對數(shù)之比表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗均重復3 次，采用GraphPad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計分析，各組總體均數(shù)采用雙因素方差分析（Two-way ANOVA）進行顯著性比較（P＜0.05，差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離株的鑒定及其產(chǎn)Reuterin能力

對采用選擇性培養(yǎng)基分離得到的潛在乳桿菌進行16S rDNA同源性分析，并經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對，初步鑒定其中4 株菌為羅伊氏乳桿菌，進一步與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知序列的羅伊氏乳桿菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1所示，4 株菌均與已知菌株的序列同源性在99%以上，均可確定為目標羅伊氏乳桿菌，命名為WLRE01、WLRE02、WLRE03、WLRE04（分別來自于鴨、鴨、鴿、鴿的糞便）。針對編碼Reuterin的pduC基因構(gòu)建特異性PCR，驗證4 株羅伊氏乳桿菌是否攜帶pduC基因，結(jié)果如圖2所示，WLRE01、WLRE03和WLRE04均攜帶pduC基因，而WLRE02（泳道4）和陰性對照（泳道C）均無特異性條帶，說明不攜帶pduC基因。對篩選到的4 株羅伊氏乳桿菌進行甘油發(fā)酵，只有3 株攜帶pduC基因的菌株發(fā)酵甘油后產(chǎn)Reuterin，且WLRE04產(chǎn)量最高，達（9.722±0.168）mg/mL（表2）。這與文獻報道的家禽源羅伊氏乳桿菌絕大部分攜帶pdu基因簇并能代謝甘油產(chǎn)具有抗菌活性物質(zhì)Reuterin的結(jié)果一致[21]，這也證實本研究定向篩選產(chǎn)Reuterin的羅伊氏乳桿菌的方法有效。

圖1 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建羅伊氏乳桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of L.reuteri based on 16S rDNA gene sequences

圖2 驗證pduC基因的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis pattern of PCR amplified pduC gene

表2 羅伊氏乳桿菌發(fā)酵甘油產(chǎn)Reuterin能力Table 2 Ability of L.reuteri to produce reuterin from glycerol

2.2 耐酸耐膽鹽能力

益生乳酸菌具有較強耐受酸和膽鹽能力是進入腸道并發(fā)揮益生功能的前提。由圖3A可知，在pH 2.5條件下處理3 h后，3 株菌均維持在106～107CFU/mL，而WLRE04活菌數(shù)與對照組相比顯著降低（P＜0.05）；處理6 h后，3 株菌活菌數(shù)相比對照組均顯著降低（P＜0.05），其中WLRE04活菌數(shù)下降最明顯，達1 個數(shù)量級（P＜0.000 1），這與賈丹等[22]報道的羅伊氏乳桿菌ZL2a的結(jié)果一致。在pH 3.5條件下（圖3B）處理3 h或6 h后，3 株菌活菌數(shù)變化較少，均維持在106～107CFU/mL，只有WLRE01在6 h后的活菌數(shù)相比對照組顯著下降（P＜0.05）。由圖3C可知，在膽鹽質(zhì)量濃度為1.5 g/L的環(huán)境條件下，3 株菌活菌數(shù)隨孵育時間延長呈逐漸下降的趨勢，處理3 h后，WLRE03活菌數(shù)基本維持初始水平，WLRE01、WLRE04活菌數(shù)均顯著下降（P＜0.000 1）；處理6 h后，WLRE01、WLRE04活菌數(shù)繼續(xù)下降至106CFU/mL。

圖3 羅伊氏乳桿菌在pH 2.5（A）、pH 3.5（B）和1.5 g/L膽鹽（C）環(huán)境中的耐受性Fig.3 Tolerance of L.reuteri to pH 2.5 (A), pH 3.5 (B) and 1.5 g/L bile salt (C)

由于正常人的胃液pH值在2～3之間波動，而膽鹽質(zhì)量濃度在0.3 g/100 mL左右，因此，定向篩選的菌株具有良好的耐酸耐膽鹽能力，菌株在pH 2.5或1.5 g/L膽鹽質(zhì)量濃度條件下孵育6 h仍維持較高質(zhì)量濃度，為其在腸道進一步發(fā)揮益生作用提供了保證。

2.3 耐過氧化氫能力

過氧化氫是一種強氧化劑，長時間作用于細胞和組織，可造成機體氧化損傷[23]。因此，對過氧化氫的耐受性是評價菌株抗氧化能力的重要指標。從圖4A可以看出，3 株菌在含0.6 mmol/L過氧化氫的MRS培養(yǎng)基中狀態(tài)良好，甚至有活菌數(shù)升高的趨勢，尤其是WLRE03、WLRE04在處理6 h后活菌數(shù)與對照組相比顯著升高（P＜0.000 1）；當過氧化氫濃度為1 mmol/L時，處理3 h后，只有WLRE01活菌數(shù)顯著下降（P＜0.000 1）；而處理6 h后，3 株菌活菌數(shù)相比對照組均顯著下降（P＜0.000 1），其中WLRE01活菌數(shù)下降約2 個數(shù)量級，而WLRE03、WLRE04活菌數(shù)下降不足1 個數(shù)量級（圖4B）。由此說明，3 株菌均有比較好的抗氧化能力，而WLRE03和WLRE04表現(xiàn)最佳。

圖4 羅伊氏乳桿菌對0.6 mmol/L（A）和1 mmol/L（B）過氧化氫的耐受力Fig.4 Tolerance of L.reuteri to 0.6 mmol/L (A) and 1 mmol/L (B)hydrogen peroxide

2.4 模擬胃腸液耐受力

乳酸菌在經(jīng)胃、腸消化過程中，除了胃酸和膽鹽，各種消化酶也會影響菌體最終到達腸道的活菌數(shù)[24]。圖5結(jié)果表明，WLRE03模擬十二指腸液消化后，與對照組相比活菌數(shù)有明顯下降（P＜0.01），在模擬腸液中消化2 h后，活菌數(shù)雖有明顯下降，但仍保持了較高的水平（2.11×108CFU/mL）；WLRE01、WLRE04經(jīng)過模擬胃液和十二指腸液消化后，活菌數(shù)基本保持不變，經(jīng)過模擬腸液消化2 h后，與對照組相比，活菌數(shù)均顯著下降（P＜0.001，P＜0.000 1），但不足1 個數(shù)量級，這與張如春等[25]報道羅伊氏乳桿菌JF036的結(jié)果一致，其經(jīng)模擬胃腸液處理后，活菌數(shù)仍高于1.0×108CFU/mL。該結(jié)果說明，本研究3 株菌對模擬胃腸液均具有良好的耐受性。相比于單純的酸環(huán)境，菌株在模擬胃液中的活菌數(shù)水平更高，這可能與胃蛋白酶削弱了酸對菌體的脅迫有關(guān)[26]。模擬腸液對3 株菌的活力均產(chǎn)生負面影響，這可能是受到膽鹽作用的影響。

圖5 羅伊氏乳桿菌在模擬胃腸液中的存活情況Fig.5 Survival of L.reuteri in simulated gastrointestinal juice

2.5 抗生素敏感性

乳酸菌抗生素敏感性測試是評估菌株安全性的一項重要指標，由表3可知，篩選的羅伊氏乳桿菌對不同種類的抗生素表現(xiàn)出不同的敏感程度。它們對慶大霉素、氯霉素和利福平均比較敏感，對環(huán)丙沙星、紅霉素、四環(huán)素和卡那霉素具有抗性。特別地，不同來源的羅伊氏乳桿菌常表現(xiàn)出不同的抗生素敏感性，如賈丹等[22]報道豬源羅伊氏乳桿菌ZL2a對氯霉素不敏感以及朱振軍等[27]發(fā)現(xiàn)老人源的羅伊氏乳桿菌對紅霉素和四環(huán)素敏感，對氯霉素具有抗性，這與本研究結(jié)果相反；張如春等[25]發(fā)現(xiàn)狐源羅伊氏乳桿菌對氯霉素敏感，對環(huán)丙沙星不敏感，這與本研究結(jié)果具有一致性，這種差異性可能是由于質(zhì)粒攜帶的抗性基因不同決定的。

表3 羅伊氏乳桿菌對不同抗生素的敏感性Table 3 Sensitivity of L.reuteri to different antibiotics

2.6 甘油發(fā)酵上清液的抑菌能力評估

在已有結(jié)果證實定向篩選的羅伊氏乳桿菌能發(fā)酵甘油產(chǎn)Reuterin的基礎(chǔ)上，進一步證明甘油發(fā)酵上清液對常見食源致病菌的抑制作用，為其在腸道健康方面的應(yīng)用開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。如表4所示，甘油發(fā)酵液上清液對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較高的抑制能力，這與池海波等[28]的研究結(jié)果一致。與非甘油發(fā)酵相比，WLRE01、WLRE03和WLRE04的抑菌圈直徑分別增大了14、20、17 mm，說明金黃色葡萄球菌對Reuterin非常敏感；單核細胞性李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌也表現(xiàn)出較強的Reuterin敏感性；特別的是，甘油發(fā)酵上清液對大腸桿菌無明顯的抑菌能力，推測該菌可能含有相關(guān)抗性基因。李文靜[29]和朱振軍[27]等報道了羅伊氏乳桿菌發(fā)酵上清液中酸性物質(zhì)具有一定的抑菌作用，但其對金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的抑制效果均不及本研究Reuterin的效果；池海波等[28]研究結(jié)果表明了羅伊氏乳桿菌發(fā)酵甘油上清液的抑菌性能較一次發(fā)酵液（MRS培養(yǎng)液中生長）有明顯提高。羅伊氏乳桿菌產(chǎn)生具有抗菌特性的Reuterin將為其在自然環(huán)境、宿主體內(nèi)競爭提供保證，對提高菌株的適應(yīng)性具有重要意義[21]。

表4 羅伊氏乳桿菌甘油發(fā)酵上清液對食源性致病菌的抑菌圈直徑Table 4 Inhibition of reuterin produced by L.reuteri on foodborne pathogens mm

綜上結(jié)果，本研究篩選的羅伊氏乳桿菌可產(chǎn)Reuterin，并具有較強的抑制病原微生物的能力，為進一步挖掘其在預防腸道感染方面的功效奠定基礎(chǔ)。

2.7 黏附腸上皮細胞的能力

腸上皮細胞黏附能力是評價乳酸菌益生功能的一項重要指標，也是其定植于腸道發(fā)揮益生功能的前提條件。本研究定向篩選的羅伊氏乳桿菌均具有良好的腸上皮細胞黏附能力，黏附率在72%以上（圖6）。其中WLRE01黏附率高達81%，這與張紫薇等[30]研究報道的羅伊氏乳桿菌J1的黏附性能相似，其黏附率為87.93%。由于其來源于家禽腸道，其是否能在其他宿主腸道黏附定植并長期發(fā)揮其益生功能有待進一步探究。

圖6 羅伊氏乳桿菌對HT-29細胞的黏附力Fig.6 Adhesion capacity of L.reuteri to HT-29 cells

3 結(jié) 論

本研究采用選擇性培養(yǎng)基從健康家禽新鮮糞便定向篩選到4 株羅伊氏乳桿菌，經(jīng)生理生化及分子生物學技術(shù)證明其是需要的目標菌株，命名為WLRE01、WLRE02、WLRE03、WLRE04。通過菌株發(fā)酵代謝實驗說明其中WLRE01、WLRE03、WLRE04能產(chǎn)抗菌物質(zhì)Reuterin，且WLRE04的產(chǎn)量高達（9.722±0.168）mg/mL，其甘油發(fā)酵上清液對一些食源致病菌具有很強的抑制能力，而對金黃色葡萄球菌的抑制圈直徑達（28.1±1.2）mm；它們能在pH 2.5、pH 3.5和1.5 g/L膽鹽條件下維持較高活菌數(shù)達6 h，且能受模擬胃腸液消化而保持穩(wěn)定的細胞濃度；同時，它們還表現(xiàn)出良好的抗氧化活性以及腸上皮細胞黏附能力。由此，可推測這些菌株均可以順利通過胃腸道的極端環(huán)境條件，并黏附定植于胃腸道。它們可作為腸道益生菌候選菌株，供進一步研究。