吳蘇寧 楊溪 劉偉

口腔白斑是最重要的口腔黏膜潛在惡性疾病，是口腔鱗狀細(xì)胞癌的重要來(lái)源［1］，調(diào)查顯示國(guó)內(nèi)白斑患者的癌變率為4%～18%［2－4］。上皮異常增生是白斑重要的病理特征，從無(wú)異常增生、輕－中－重度異常增生到癌變進(jìn)程各階段較明確，白斑的發(fā)生發(fā)展到癌變是腫瘤發(fā)生的良好研究模型。血管生成是腫瘤發(fā)生的標(biāo)志事件之一，《自然》系列雜志發(fā)表通過(guò)抗血管生成預(yù)防癌癥發(fā)生和發(fā)展的綜述［5］，表明腫瘤血管生成早于組織形態(tài)學(xué)如上皮異常增生改變之前。雖然單個(gè)或幾個(gè)血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)在白斑癌變中進(jìn)行研究具有一定意義［6－8］，但是高通量的組學(xué)研究可能更具有意義。本文作者利用人轉(zhuǎn)錄組芯片研究口腔白斑患者病損發(fā)生發(fā)展中的血管生成基因表達(dá)譜，并驗(yàn)證關(guān)鍵基因的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 基本材料

標(biāo)本來(lái)源納入轉(zhuǎn)錄組芯片研究的患者組織包括3例正?？谇火つ?，8例口腔白斑，6例口腔早期鱗癌（T1-2N0M0），收集于2014年9月～2014年12月上海第九人民醫(yī)院口腔頜面頭頸腫瘤科。納入8例口腔白斑分為4例無(wú)/輕度上皮異常增生，4例中－重度上皮異常增生，分別歸為本研究中的低危白斑和高危白斑。納入差異基因的驗(yàn)證表達(dá)研究的患者組織包括6例正常黏膜，12例口腔白斑，12例口腔早期鱗癌，收集于2018年6月～2018年12月上海第九人民醫(yī)院頜面頭頸腫瘤科。以上組織病理學(xué)診斷由上海第九人民醫(yī)院口腔病理科醫(yī)師確認(rèn)。組織樣本為活檢或手術(shù)后標(biāo)本，放入裝有RNAlater液的凍存管，離體后液氮浸沒(méi)15 min，放入－80℃冰箱保存。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行化療、放療及激素等治療，且無(wú)自身系統(tǒng)性疾病和癌癥史。正常黏膜、口腔白斑和鱗癌3組間的年齡和性別等因素?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究獲得上海第九人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：［2012］21），研究對(duì)象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 總 RNA提取和質(zhì)檢 按照 TRIzol試劑盒（15596型號(hào)，Invitrogen公司，美國(guó)）常規(guī)提取組織中總RNA，利用NanoDrop 2000分光光度計(jì)（ND2000型，Thermo Scientific公司，美國(guó)）測(cè)定濃度及 A260/A280，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。納入本研究的組織樣本NanoDrop ND-2000定量并經(jīng) Agilent Bioanalyzer 2100（安捷倫2100，Agilent Technologies公司，美國(guó)）檢測(cè)RNA完整性，檢測(cè)顯示RNA的A260nm/A280nm比率均在 1.8和 2.1之間，A260nm/A230nm值均大于1.8，顯示RNA質(zhì)量良好，符合實(shí)驗(yàn)要求。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組芯片研究 樣本的標(biāo)記、轉(zhuǎn)錄組學(xué)芯片的雜交以及洗脫檢測(cè)按照Affymetrix GeneChip?Hu-man Transcriptome Array（HTA）2.0標(biāo)準(zhǔn)流程執(zhí)行。首先，總 RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈 cDNA，再進(jìn)一步合成cRNA，接著對(duì)cRNA進(jìn)行第二輪反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，片段化并與生物素標(biāo)記后與芯片雜交，洗脫和染色后利用Affymetrix Scanner3000（Affymetrix，美國(guó)）掃描得到原始圖像。采用Affymetrix GeneChip Command Console軟件處理提取原始數(shù)據(jù)和Expression Console軟件對(duì)芯片進(jìn)行g(shù)ene level的標(biāo)準(zhǔn)化，標(biāo)準(zhǔn)化算法為RMA。后續(xù)分析分成基因表達(dá)分析使用的軟件為Genespring軟件。差異基因利用t檢驗(yàn)的P值和倍數(shù)變化值進(jìn)行篩選，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0且P值＜0.05。接著，對(duì)差異基因進(jìn)行Gene ontology（GO）功能分析，以判定差異基因主要影響的生物學(xué)功能。最后，對(duì)差異基因進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類，展示差異基因在不同樣本間的表達(dá)模式。

1.2.3 熒光定量 PCR（qRT-RCR） 利用 HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（＋gDNA wiper）將待測(cè) RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用Roche LCPDS2軟件設(shè)計(jì)基因引物（表1）。利用QuantiFast?SYBR?Green PCR Kit試劑盒（Qiagen，Germany）在 LightCycler?480Ⅱ型熒光定量PCR儀（Roche，Swiss）上進(jìn)行反應(yīng)。體系：2×QuantiFast?SYBR?Green PCR Master Mix，5μL；10 μmol/L Forward primer，0.2μL；10μmol/L Reverse primer，0.2μL；cDNA，1μL；Nuclease-free H2O，3.6 μL。PCR程序：95℃5 min；95℃10 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后利用熔解曲線檢測(cè)產(chǎn)物特異性：從60℃緩慢升溫至97℃，每℃采集5次熒光信號(hào)。GAPDH作為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法測(cè)定相對(duì)表達(dá)水平，設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，計(jì)算其均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。

表1 RT-qRCR驗(yàn)證血管生成關(guān)鍵基因的引物序列Tab 1 Primer sequence for angiogenic genes

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用方差分析比較正常黏膜、白斑和鱗癌3組間基因定量表達(dá)均數(shù)差別的顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 口腔白斑發(fā)生發(fā)展中的血管生成基因表達(dá)譜

本研究將口腔白斑發(fā)生發(fā)展的節(jié)點(diǎn)分為低危（無(wú)/輕度異常增生）白斑、高危（中－重度異常增生）白斑和早期鱗癌。經(jīng)Affymetrix HTA2.0轉(zhuǎn)錄組芯片檢測(cè)，低危白斑有855個(gè)異常變化兩倍以上特有的轉(zhuǎn)錄本基因，高危白斑有399特有基因，高危白斑發(fā)展到早期鱗癌有797個(gè)特有基因。白斑各階段的差異基因進(jìn)行GO功能分析。按照GO生物學(xué)作用分類，篩選出生物學(xué)作用為血管生成（Angiogenesis）的基因（圖1）。

圖1 從白斑發(fā)生發(fā)展各階段全部基因中篩選出血管生成基因Fig 1 Angiogenic genes screened from all genes in the develop-ment and progression of leukoplakia

從正常黏膜發(fā)展到低危白斑有7個(gè)異常變化兩倍以上基因，從低危黏膜發(fā)展到高危白斑有8個(gè)基因（表2）。從高危白斑發(fā)展到鱗癌有151個(gè)基因，占比18.9%，聚類分析表達(dá)譜見(jiàn)圖2。

圖2 口腔高危白斑發(fā)展到早期鱗癌的血管生成基因表達(dá)譜Fig 2 Angiogenic gene expression profile of high-risk leukoplakia to early SCC

表2 白斑發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的血管生成差異表達(dá)基因Tab 2 Angiogenic genes in the development and progression of leukoplakia

2.2 白斑癌變血管生成關(guān)鍵基因的驗(yàn)證

本研究的芯片驗(yàn)證關(guān)注于從高危白斑發(fā)展到早期鱗癌的血管生成關(guān)鍵基因，選擇正常黏膜、口腔白斑和鱗癌的獨(dú)立樣本對(duì)VEGFA、PDGFRB、MMP1和MMP3行熒光qRT-RCR的驗(yàn)證表達(dá)研究，結(jié)果顯示VEGFA、PDGFRB、MMP1和MMP3的mRNA在正常黏膜、口腔白斑和鱗癌中的相對(duì)表達(dá)量均呈階梯式升高（圖3），這與轉(zhuǎn)錄組芯片結(jié)果基本一致。

圖3 qRT-PCR驗(yàn)證血管生成基因VEGFA、PDGFRB、MMP1和MMP3在正常黏膜、白斑和鱗癌中的差異表達(dá)（P＜0.05）Fig 3 qRT-PCR confirmation of the differential expression of VEGFA，PDGFRB，MMP1 and MMP3 in normalmucosa，leukoplakia and SCC（P＜0.05）

3 討 論

口腔黏膜白斑癌變進(jìn)程是由多基因異常參與的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能改變的多步驟過(guò)程，高危白斑的早期診斷及危險(xiǎn)評(píng)估尤為重要。目前，臨床上常用視診、觸診、常規(guī)病理學(xué)進(jìn)行口腔癌前病變的診斷和評(píng)估，而細(xì)胞基因改變發(fā)生于組織形態(tài)學(xué)改變之前，研究白斑發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中基因組學(xué)改變對(duì)癌變?cè)缙谠\斷及分子機(jī)制方面具有重要作用。組學(xué)研究比單個(gè)或幾個(gè)分子在口腔白斑及鱗癌中表達(dá)研究更有意義［6－10］。本研究選取的Affymetrix HTA2.0芯片是新一代全轉(zhuǎn)錄組芯片，該芯片設(shè)計(jì)了近700萬(wàn)條探針，可以檢測(cè)超過(guò)28萬(wàn)條全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，包括超過(guò)24萬(wàn)條編碼轉(zhuǎn)錄本RNA和超過(guò)4萬(wàn)條非編碼轉(zhuǎn)錄本RNA。

納入轉(zhuǎn)錄組芯片的階梯式病例設(shè)置是本研究的特色。針對(duì)口腔白斑的發(fā)生發(fā)展設(shè)置四組病例，設(shè)置為正常黏膜（n＝3）－低危白斑（n＝4）－高危白斑（n＝4）－早期鱗癌（n＝6）模擬白斑癌變的多步驟進(jìn)程，研究結(jié)果可反映白斑癌變不同階段的分子生物學(xué)特性。王娟等［11］對(duì)正常黏膜（n＝3）和白斑（n＝3）進(jìn)行的Affymetrix U133 plus 2.0基因芯片研究，張德保等［12］對(duì)正常黏膜（n＝10）和白斑（n＝10）進(jìn)行的Agilent基因組學(xué)芯片研究，陳顯久等［13］對(duì)白斑（n＝3）和鱗癌（n＝3）進(jìn)行的SupperArray基因芯片研究。而本研究的芯片病例設(shè)置為白斑發(fā)生發(fā)展的各階段，這是區(qū)別于既往的對(duì)白斑的芯片研究的特色之處。

血管生成是腫瘤發(fā)生的標(biāo)志事件之一。研究表明腫瘤超過(guò)1～2 mm3須依賴血管生成和氧氣，腫瘤發(fā)生是由于在腫瘤內(nèi)部的細(xì)胞不受控的快速分裂增殖，導(dǎo)致大量細(xì)胞聚集在一起，卻沒(méi)有血管可以帶來(lái)養(yǎng)分和氧氣，腫瘤內(nèi)部的細(xì)胞通常會(huì)陷入低氧環(huán)境中，從而通過(guò) HIF1α開啟或增強(qiáng)一系列基因的表達(dá)，通過(guò)VEGF等基因上調(diào)促進(jìn)血管生成，包括促進(jìn)能量物質(zhì)無(wú)氧酵解的酶，導(dǎo)致癌細(xì)胞規(guī)避失巢凋亡并啟動(dòng)遷移機(jī)制的信號(hào)通路［5］。段寧等［14］對(duì)白斑（n＝4）和鱗癌（n＝4）進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性芯片研究，異?；蛑饕挥诘?，5－9，11，13－15，17，18染色體，本項(xiàng)目篩選出的血管生成基因位點(diǎn)亦多位于這些染色體（表2）。

本研究中轉(zhuǎn)錄組芯片篩選出白斑發(fā)生發(fā)展各階段的血管生成基因。作者發(fā)現(xiàn)S100A7和PDPN分別是低危白斑和高危白斑的異?；?，Kaur等［15］發(fā)現(xiàn)S100A7是預(yù)測(cè)癌變的標(biāo)記物，本項(xiàng)目先前的研究提示PDPN亦可能是癌變標(biāo)記物［16］。VEGFA、PDGFRB、CCL2、EGFR、MMP1/3等是從高危白斑發(fā)展到早期鱗癌階段的關(guān)鍵基因，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示VEG-FA、PDGFRB、MMP1和MMP3基因發(fā)生顯著上調(diào)。國(guó)外學(xué)者報(bào)道VEGFA和EGFR免疫表達(dá)與白斑進(jìn)展和癌變相關(guān)［17－18］，CCL2與口腔鱗癌中的血管生成有關(guān)［19］，MMP1的免疫表達(dá)在白斑和正常組織有顯著差異，但作為癌變?cè)\斷指標(biāo)證據(jù)不足［20］。

目前，血管生成基因在口腔癌變進(jìn)程中分子機(jī)制研究很少，本研究結(jié)果提示VEGFA等基因上調(diào)促進(jìn)血管生成在癌變過(guò)程中具有重要作用，白斑癌變微環(huán)境中VEGFA等激活的信號(hào)通路和分子機(jī)制值得進(jìn)一步研究?？傮w上，本文以血管生成為論點(diǎn)，為白斑發(fā)病和癌變的分子機(jī)制、尋找白斑早期診斷的分子標(biāo)記的深入研究提供新依據(jù)，為白斑的發(fā)生發(fā)展機(jī)制和標(biāo)志性癌變基因探針的篩查奠定了基礎(chǔ)。