沈旭晨，蔡培泉*，糜祖煌，王春新，趙 琪

1南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，江蘇 無錫 214023；2無錫市克隆遺傳技術研究所，江蘇 無錫 214026；3南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，江蘇 無錫 214023

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）通常存在于上呼吸道及腸道，是常見的條件致病菌。在近年的醫(yī)院細菌耐藥監(jiān)測中，KP 檢出率居第2 位［1-2］。高毒力型肺炎克雷伯菌（hypervirulentKlebsiella pneumoniae，hvKP）合并多重耐藥在國內已有多次報道［3-5］，甚至新生兒也常有感染耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的報道［6］。KP對各種年齡段人群造成威脅，使臨床治療面臨艱巨挑戰(zhàn)。盡管目前國內外有大量hvKP 的研究報道［7-9］，但是缺乏肺炎克雷伯菌肺炎患者KP 分離株的毒力基因分布與臨床特征相關性研究。本研究選定了與KP 主要毒力因子菌毛、莢膜、鐵載體密切相關的fimH、mrkD、wabG、uge、ureA、entB、clbA、ybtA 這8 種毒力基因進行檢測，并分析其與患者臨床特征的相關性，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象

選取2019 年8—9 月南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院住院患者各種臨床標本中分離出KP 菌株的50 例肺部感染患者作為研究對象。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 細菌鑒定與藥敏分析

細菌鑒定與藥敏分析采用法國生物梅里埃公司VITEK-2全自動細菌鑒定及藥敏分析儀。

1.2.2 靶基因檢測

細菌DNA 提取采用非離子去污劑Triton X-100裂解加蛋白酶K 消化法。菌株先作純培養(yǎng)，然后挑取單個菌落置入已預混好的Triton X-100 與蛋白酶K 溶液中，55 ℃溫浴120 min，再95 ℃溫浴10 min。-20 ℃保存待檢。

PCR 檢測毒力基因。每種毒力基因檢測PCR擴增的反應系統(tǒng)均為：耐熱DNA聚合酶（TaKaRa 公司，日本）1 U（0.2 μL），耐熱DNA聚合酶匹配的10×緩沖液2 μL；P1 引物2 μL（1.0 μmol/L），P2 引物2 μL（1.0 μmol/L），dNTPs 2 μL（各種濃度均2 mmol/L），超純水7 μL，菌株DNA 提取液4.8 μL，合計總反應體積20 μL，引物序列見表1。PCR檢測擴增熱循環(huán)為：95 ℃預變性3 min，然后95 ℃變性0.5 min，55 ℃復性0.5 min，72 ℃延伸1.0 min，30 個循環(huán)，最后一輪延伸72 ℃延長至5 min。經2%瓊脂糖凝膠電泳20 min，紫外線儀下凝膠上出現與陽性對照分子量相同的條帶即判別為陽性。

表1 8種靶毒力基因PCR擴增引物序列

1.2.3 臨床特征分析

回顧性分析菌株來源患者的臨床資料，包括性別、年齡、科室分布、住院時間、菌株來源、基礎疾病、臨床癥狀、侵入性操作、肺炎嚴重指數（PSI）評分、預后情況、耐藥情況，并根據毒力基因檢測結果進行分組比較。

2 結果

2.1 患者臨床資料

KP菌株來自50例肺部感染患者，其中男36例，女14例。年齡分布在1～4歲及33～103歲，平均年齡（63.72±19.49）歲，60歲以上的老年患者占72%。標本來源為痰液48 份，血液1 份，肺泡灌洗液1 份。29 例社區(qū)獲得性感染，21例醫(yī)院獲得性感染?？傋≡簳r間分布在5～185 d，平均為（31.86±37.27）d?；加腥橄侔?、肺癌、食管癌等腫瘤疾病7 例，糖尿病9 例。34例進行氣管內插管，19例進行深靜脈置管，18 例留置尿管，23 例留置胃管。根據藥敏結果，40%分離株為多重耐藥菌株?？咕幬锬退幝史謩e為碳青霉烯類14%，青霉素類+酶抑制劑12%～40%，三代頭孢10%～38%，四代頭孢24%，氨基糖苷類8%～18%，喹諾酮類36%，超廣譜β內酰胺酶陽性率30%?；颊咚诳剖抑?，呼吸科、ICU患者共占50%，各外科及其余內科占比均在10%以下（圖1）。

圖1 50例肺炎克雷伯菌肺炎患者的臨床科室分布

26 例因感染相關癥狀（如咳嗽咳痰發(fā)熱等）入院，19 例因其他主訴入院。病程中，37 例（74%）出現咳嗽、咳痰，29 例（58%）出現發(fā)熱，27 例（54%）出現胸悶、氣短。

2.2 靶基因檢測陽性率及電泳圖

本研究分離自肺炎患者的50 株KP 菌株對fimH、mrkD、wabG、uge、ureA、entB、ybtA、clbA這8種毒力基因進行檢測，其中wabG、uge、clbA 基因未檢出，fimH、mrkD、ureA、entB、ybtA 均有檢出（表2）。同時檢測出2 種及以上毒力基因的菌株占100%，3種及以上占98%，4種及以上92%，5種及以上56%。

表2 50株肺炎克雷伯菌8種靶基因檢測的陽性率

2.3 毒力基因分布與臨床特征比較

如表3 所示，根據毒力基因檢測陽性的結果進行分組比較，共計6 組，在各組內分別計算各比例。fimH+mrkD+ureA+entB+ybtA 組合例數達28 例，明顯多于其余各組。比較發(fā)現，攜帶fimH基因分組的患者更常出現咳嗽咳痰、胸悶氣短的癥狀。fimH+mrkD+ureA+entB+ybtA組合的患者臨床表現（咳嗽咳痰、胸悶氣短）明顯，但病死率并不高，僅14.29%。攜帶mrkD+ureA+entB 及fimH+mrkD+ureA+entB 組合的患者病死率高，同時多重耐藥菌比例也較高。

50 例患者總體病死率為20%。將患者根據毒力基因陽性的數目分為4組，分析顯示，隨著毒力基因種類數目的增加，檢測出3種、4種、5 種毒力基因陽性患者的病死率分別為33.33%、27.78%、14.29%，呈現下降趨勢（表4）。

表4 毒力基因種類與臨床特征 ［n（%）］

3 討論

KP 作為條件致病菌，易導致危重癥和免疫缺陷患者的肺部感染、泌尿道感染、血流感染、肝膿腫等［7］，hvKP甚至引起眼內炎、腦膜炎，導致患者的高致死率、高致殘率。近年來KP感染率顯著提高［10］。本研究中fimH、mrkD、ureA、entB、ybtA 基因均有不同程度的檢出，clbA、wabG、uge基因未檢出。

將患者根據檢測毒力基因陽性的情況進行分組，性別、年齡、科室分布、住院時間、菌株來源等基礎情況未見明顯差異，但患者以中老年人為主要群體。34%菌株來自進行氣管內插管的患者，符合既往研究機械通氣是KP 感染的高危因素的結論［11-13］。26%菌株來自ICU，24%來自呼吸科，與相關文獻報道ICU、呼吸科易檢出KP［14］的結果一致。fimH、mrkD、entB、ureA 均高表達，陽性率＞85%，提示這些基因可能是KP 引起感染所必備的。咳嗽、咳痰為最主要表現（74%），其次為發(fā)熱（58%）、胸悶氣短（54%）。

所檢測的基因組合中，fimH+mrkD+ureA+entB、fimH+mrkD+ureA+entB+ybtA 組合患者出現咳嗽咳痰、胸悶氣短癥狀的比例高于mrkD+ureA+entB、mrkD+ureA+entB+ybtA 組合，且住院天數更長。fimH 基因編碼的FimH 是Ⅰ型菌毛尖端的黏附素，能與宿主細胞表面含甘露醇的糖蛋白特異性結合，使細菌黏附在氣道上皮，通過TLR4/NF-κB 途徑誘導巨噬細胞分泌白細胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和IL-6，產生炎癥刺激［15-16］，使患者受刺激后產生咳嗽，氣道分泌更多痰液，具有fimH 基因的菌株更易使患者出現咳嗽咳痰。

fimH+mrkD+ureA+entB+ybtA 組合為本次研究最常見的組合，咳嗽、咳痰癥狀比例較高，病死率較低，PSI 評分均值為Ⅲ級。隨著毒力基因種類的增多，其表達的各種毒力因子也增多，使得患者臨床癥狀增多并且明顯。但毒力基因的種類增加，并未引起病死率的增加，毒力基因之間可能會相互影響，毒力基因種類增多引起各基因表達下降，導致其相應的毒力因子表達下降，病死率下降。既往研究發(fā)現免疫抑制狀態(tài)的患者更易感染經典型肺炎克雷伯菌（cKP），免疫功能正常的患者更易感染hvKP［11］。隨著毒力基因種類增多，各組檢出例數增加，患有腫瘤及糖尿病的比例卻降低了；毒力基因種類較少的菌株更易感染腫瘤及糖尿病患者，病死率更高。毒力基因種類的數目、相互作用及其與hvKP的產生之間的關系仍待進一步探討。

具有較少種類毒力基因的組合患者常出現發(fā)熱，本研究中檢出率在95%以上的mrkD、ureA、entB基因在這一過程中也許具有較重要作用，特別是entB 基因。鐵離子對細菌和宿主都是至關重要的，當宿主處于炎癥反應中時，患者吸收鐵能力減弱，因此通過鐵調素減少細胞內的鐵離子外流，使得患者體內的鐵穩(wěn)態(tài)出現異常，引起貧血并且免疫力減弱［16］。entB 作為鐵載體腸桿菌素相關基因，能夠幫助菌株競爭性結合血清中的游離鐵，增強菌株毒性。同時，鐵代謝與炎癥反應的關系較為復雜，但近年來的研究發(fā)現，調節(jié)全身鐵穩(wěn)態(tài)重要因子的鐵調素對于炎癥的反應極為劇烈，而強烈的炎癥反應常引起發(fā)熱。

mrkD+ureA+entB、mrkD+ureA+entB+ybtA 組合患者PSI 評分均值都達到Ⅳ級，入住ICU 比例最高。mrkD+ureA+entB 組合在各組合中病死率最高（50%），以發(fā)熱為共有特征，有侵入性操作史。mrkD+ureA+entB+ybtA 組合出現咳嗽咳痰、胸悶氣短、發(fā)熱等癥狀的比例較低，病死率為0%。mrkD+ureA+entB 組合均為醫(yī)院獲得性感染，mrkD+ureA+entB+ybtA 組合增加了ybtA 基因，以社區(qū)獲得性感染為主。相似的是，fimH+mrkD+ureA+entB 組合與fimH+mrkD+ureA+entB+ybtA 組合相比，后者毒力基因多了ybtA，社區(qū)感染比例更高。由此可知，ybt 基因可能與社區(qū)獲得性肺炎相關。

以往認為細菌會為了獲得耐藥基因而丟棄一些毒力基因［17］，以獲得更好的適應性，但是本次研究中檢測出帶有3 種、4 種、5 種毒力基因的菌株其多重耐藥比例分別為33.33%、33.33%、42.86%，隨著毒力基因數目的增加，多重耐藥比例也呈上升趨勢。這提示所選取菌株中很可能存在高毒力高耐藥的“超級細菌”。死亡患者感染菌株檢出的毒力基因組合分別為mrkD+ureA+entB、fimH+mrkD+ureA+entB、fimH+mrkD+ureA+entB+ybtA，臨床需對帶有這些毒力基因組合的菌株提高警惕。

綜上所述，KP 容易引起老年群體的肺部感染，特別是合并腫瘤或糖尿病的群體，當這些易患人群感染帶有毒力基因并多重耐藥的菌株，抗感染治療變得困難，可導致呼吸衰竭、全身多臟器衰竭等嚴重并發(fā)癥，即使采取呼吸機輔助呼吸，但患者的基礎肺功能差，最后有可能脫機困難，總體預后欠佳。在本研究中患者總體病死率達20%，1 例罹患肺間質纖維化而行右肺移植術后患者，所感染的KP分離株檢出基因為fimH+mrkD+ureA+entB+ybtA，且藥敏結果為多重耐藥菌，予以氣管內插管，反復調整抗感染治療方案，最終在住院111 d 后好轉出院。因此，攜帶多種毒力基因的多重耐藥KP 引起的感染對患者和醫(yī)院都提出了很大挑戰(zhàn)，建議臨床科室尤其是ICU、呼吸科注重病原學檢測及耐藥機制的研究，密切關注患者病原菌感染情況，并加強院感監(jiān)控。對于重癥肺炎患者，感染、凝血及免疫功能相關指標均與病情和預后密切相關，需及早進行監(jiān)測，幫助改善患者預后［18］。本研究在國內首次就肺炎克雷伯菌肺炎患者分離株進行了fimH、mrkD、wabG、uge、ureA、entB、ybtA、clbA 等8 種毒力基因檢測，且對其分布及臨床特征的相關性進行分析，為國內同行提供了基礎數據作為參考。由于本研究的樣本量較小，此次研究中wabG、uge、clbA基因均未檢出，且mrkD+ureA、fimH+mrkD+ureA 組合毒力基因檢測陽性的人數偏少，關于毒力基因與臨床癥狀的進一步對應關系仍需要進行更多的研究。