崔 敏，劉軼寧，莊旻羽，呂佳璐，金瑤瑤，張永杰*

1南京醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)系，2衰老及相關(guān)疾病研究重點實驗室，3第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 211166

B淋巴瘤Mo-MLV 插入?yún)^(qū)1（B cell-specific MLV integration site-1，Bmi-1）是轉(zhuǎn)錄抑制因子多梳基因家族成員［1］，可通過抑制p16INK4a/Rb 和p19AFR/p53 途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞衰老［2-3］，并在各種細(xì)胞的抗氧化防御中發(fā)揮重要作用［4-7］。Bmi-1在各類神經(jīng)細(xì)胞（包括神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞等）中均有表達，并在腦發(fā)育過程中具有重要作用［8-9］。既往研究顯示，Bmi-1 在老年人腦和老年小鼠腦中表達下調(diào)，提示Bmi-1與大腦衰老有關(guān)［4］。通過對利用基因重組技術(shù)建立的Bmi-1基因敲除（Bmi-1-/-）小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，Bmi-1 缺乏的小鼠出現(xiàn)成熟前衰老的表型，神經(jīng)系統(tǒng)和造血功能缺陷［10］，抗氧化能力降低［2］。

細(xì)胞周期檢查點激酶2（cell-cycle checkpoint kinase 2，Chk2）是重要的DNA 損傷檢查點調(diào)節(jié)器［11］，當(dāng)Chk2 被激活時，能夠迅速通過磷酸化，阻滯細(xì)胞周期進程，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生程序性死亡［12-13］。先前研究表明，敲除Chk2基因（Chk2-/-）可以改善小鼠Bmi-1 缺失引起的多器官表型，并延長其生存時間［13-14］，但Chk2 基因敲除是否能糾正Bmi-1 缺失小鼠的腦衰老表型，尚未見文獻報道。因此，我們通過配籠生成Bmi-1 和Chk2 雙基因敲除小鼠（Bmi1-/-Chk2-/-），比較同窩WT、Bmi1-/-、Chk2-/-和Bmi1-/-Chk2-/-小鼠不同腦區(qū)的表型及抗氧化酶等的表達變化，以進一步驗證Chk2 敲除是否可通過中斷DNA損傷應(yīng)答途徑，增強抗氧化能力，從而改善由Bmi-1缺失所致的小鼠腦衰老表型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物

實驗用2 月齡Bmi1-/-小鼠、Chk2-/-小鼠、Bmi1-/-Chk2-/-小鼠及同窩野生型（wild type，WT）對照小鼠各6只，雌雄不限。動物飼養(yǎng)、管理及使用均嚴(yán)格按照南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物管理規(guī)范進行（IACUC：1809007）。

1.1.2 試劑

兔抗NeuN 單克隆抗體（Abcam 公司，英國），小鼠抗GFAP 單克隆抗體（Millipore 公司，美國），兔抗Iba1單克隆抗體（Abcam 公司，英國），兔抗p16多克隆抗體（Santa Cruz 公司，美國），鼠抗GAPDH 單克隆抗體（Proteintech 公司，美國），兔抗SOD1、SOD2單克隆抗體（Abcam 公司，英國）。羊抗鼠、羊抗兔IgG（武漢博士德公司），羊抗兔IgG-HRP、羊抗小鼠IgG-HRP（KPL 公司，美國），Elite ABC Kit（Vector 公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 動物基因型鑒定

將新生仔鼠剪尾（約5 mm），參見Miao等［2，13］方法結(jié)合PCR反應(yīng)，鑒定小鼠基因型，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequences of PCR primers

1.2.2 組織取材及切片

采用3%戊巴比妥鈉（4 mg/100 g 體重）深度麻醉小鼠后，經(jīng)心臟行生理鹽水灌洗，取腦，沿大腦縱裂切開分左右兩半，左側(cè)半腦經(jīng)4%多聚甲醛固定后，梯度酒精脫水、石蠟包埋后行矢狀位石蠟切片，片厚5 μm，右側(cè)半腦分腦區(qū)凍存，用于提取組織蛋白進行Western blot實驗。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片經(jīng)37 ℃30 min烘干后，行常規(guī)脫蠟水化，然后用3%過氧化氫處理30 min 以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，10%正常羊血清封閉1 h，滴加一抗兔抗NeuN 單克隆抗體（1∶200）、小鼠抗GFAP 單克隆抗體（1∶200）、兔抗Iba1 單克隆抗體（1∶200）、兔抗p16多克隆抗體（1∶200），4 ℃孵育過夜，加生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶100）、羊抗兔IgG（1∶100）室溫孵育1 h，滴加Elite ABC 混合液室溫孵育30 min，加DAB 底物（武漢博士德公司）室溫避光孵育5～8 min，蘇木精復(fù)染20 s，1%鹽酸酒精分色2～3 s，流水藍化3 min，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。正置顯微鏡采集圖像，用Image Pro Plus 6.0 軟件分析NeuN、Iba1、p16陽性細(xì)胞百分率（%），GFAP陽性面積百分率（%），每個動物每個相應(yīng)腦區(qū)至少計數(shù)3張切片，結(jié)果取平均值。

1.2.4 Western blot實驗

組織按質(zhì)量/體積比約1∶20加入RIPA后剪碎、勻漿，冰上靜置30 min，13 000 r/min 4 ℃離心15 min，提取蛋白并用BCA法進行定量，100 ℃金屬浴10 min，使蛋白變性后置-80 ℃冰箱保存。10%SDS-PAGE膠，每組蛋白加樣20 μg，110 V 恒壓電泳2 h 后，280 mA 恒流轉(zhuǎn)膜90 min，蛋白濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，含5%脫脂奶粉的PBST 37 ℃封閉1 h，加入適量一抗：鼠抗GAPDH 單克隆抗體（1∶2 000）、兔抗SOD1、SOD2單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗p16多克隆抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，PBST洗滌后，加入相應(yīng)特異性二抗（1∶2 000），搖床室溫反應(yīng)1 h。洗膜后，滴加ECL發(fā)光混合液，自動成像儀曝光，保存顯影圖像。采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行分析，

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析及作圖。各組計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行多組間數(shù)據(jù)比較，多組間數(shù)據(jù)兩兩比較用SNK 法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Chk2敲除可促進Bmi-1-/-小鼠不同腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育以及神經(jīng)元的分化與成熟

為了明確Chk2敲除對Bmi-1-/-小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育以及神經(jīng)元分化、成熟的影響，我們采用免疫組化的方法檢測小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1、神經(jīng)元特異性核蛋白NeuN的表達，分析比較了2月齡Bmi1-/-、Chk2-/-、Bmi1-/-Chk2-/-及同窩WT 對照小鼠大腦皮層、海馬及下丘腦區(qū)Iba1、NeuN陽性細(xì)胞百分率的變化。結(jié)果顯示，與同窩WT 小鼠相比，Iba1 和NeuN 陽性細(xì)胞百分率在Chk2-/-小鼠海馬區(qū)及下丘腦區(qū)明顯增加，而在大腦皮層雖有增加趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；Bmi1-/-小鼠以上腦區(qū)的Iba1 和NeuN 陽性率明顯減少；與Bmi1-/-小鼠相比，Bmi1-/-Chk2-/-小鼠以上腦區(qū)的Iba1 和NeuN 陽性率明顯增加，但尚未達到WT小鼠水平（圖1、2）。這些結(jié)果說明Chk2敲除能夠促進Bmi1-/-小鼠大腦皮層、海馬及下丘腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育及神經(jīng)元的分化與成熟。

圖1 Chk2敲除對Bmi-1-/-小鼠大腦皮層、海馬、下丘腦區(qū)神經(jīng)元發(fā)育的影響Figure 1 Effects of Chk2 knockout on neuronal development in the cerebral cortex，hippocampus and hypothalamus of Bmi-1-/- mice

2.2 Chk2敲除可通過增強抗氧化能力緩解由Bmi-1缺失所致的小鼠腦衰老表型

為了研究Chk2敲除對Bmi-1-/-小鼠腦衰老表型的影響以及可能機制，我們采用免疫組化的方法檢測了2月齡Bmi1-/-、Chk2-/-、Bmi1-/-Chk2-/-及同窩WT對照小鼠腦中輕度反應(yīng)型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP及衰老指標(biāo)p16的表達情況。結(jié)果顯示，與同窩WT 小鼠相比，Bmi1-/-小鼠、Bmi1-/-Chk2-/-小鼠海馬和下丘腦區(qū)均出現(xiàn)GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，且胞體肥大、表達增強，而Bmi1-/-Chk2-/-小鼠的GFAP 陽性率明顯低于Bmi1-/-小鼠，但尚未達到WT小鼠水平（圖3）。與WT 小鼠相比，p16 陽性細(xì)胞百分率及蛋白表達量在Chk2-/-小鼠大腦皮層、海馬區(qū)及下丘腦區(qū)雖有減少趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而Bmi1-/-小鼠以上腦區(qū)的p16陽性率及蛋白表達量均明顯增加；與Bmi1-/-小鼠相比，Bmi1-/-Chk2-/-小鼠以上腦區(qū)的p16陽性率顯著降低，但尚未達到WT小鼠水平（圖4、5）。這些結(jié)果說明Chk2 敲除能夠緩解由Bmi-1缺失所致的小鼠衰老表型。

圖3 Chk2敲除對Bmi-1-/-小鼠海馬、下丘腦區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的影響Figure 3 Effects of Chk2 knockout on astrocyte development in hippocampus and hypothalamus of Bmi-1-/-mice

圖4 Chk2敲除對Bmi-1-/-小鼠大腦皮層、海馬、下丘腦區(qū)p16表達的影響Figure 4 The effect of Chk2 knockout on p16 expression in cerebral cortex，hippocampus and hypothalamus of Bmi-1-/-mice

采用Western blot驗檢測2月齡Bmi1-/-、Chk2-/-、Bmi1-/-Chk2-/-及同窩WT對照小鼠大腦皮層SOD1及SOD2 的表達量，結(jié)果顯示，與同窩WT 小鼠相比，SOD1 和SOD2 蛋白表達量在Chk2-/-小鼠腦內(nèi)明顯增加，而在Bmi1-/-小鼠和Bmi1-/-Chk2-/-小鼠腦內(nèi)則明顯減少（圖5）；與Bmi1-/-小鼠相比，Bmi1-/-Chk2-/-小鼠腦內(nèi)的SOD1和SOD2蛋白表達量顯著上調(diào)，但尚未達到WT小鼠水平（圖5）。以上結(jié)果說明，Chk2敲除可通過增強抗氧化能力緩解由Bmi-1缺失所致的小鼠腦衰老表型。

圖5 p16、SOD1、SOD2蛋白在2月齡WT、Bmi-1-/-、Chk2-/-、Bmi-1-/-Chk2-/-小鼠腦中的表達Figure 5 The expression of p16，SOD1，SOD2 protein in the brain of 2-month-old WT，Bmi-1-/-，Chk2-/-，and Bmi-1-/-Chk2-/-mice

3 討論

衰老在生命進程中是一個不可逆的過程，但有希望通過增強或減弱某些基因的功能來延緩它的進程［15］。既往研究表明，Chk2 敲除可以部分挽救Bmi-1缺失小鼠的相關(guān)表型［16］，但對于Bmi-1缺失小鼠腦衰老表型的影響尚不明確。故本實驗中，我們通過比較Bmi-1和Chk2雙基因敲除的Bmi1-/-Chk2-/-小鼠與Bmi1-/-、Chk2-/-及同窩WT小鼠不同腦區(qū)的腦衰老表型，探索Chk2敲除對Bmi-1缺失小鼠腦衰老的影響。

在腦衰老的研究中，大腦皮層［17-18］、海馬［19-21］、下丘腦［22-23］等腦區(qū)的形態(tài)與功能變化在腦衰老過程中具有重要意義，故本研究首先將上述腦區(qū)作為研究目標(biāo)區(qū)域。研究結(jié)果顯示，Iba1和NeuN陽性細(xì)胞率在Bmi1-/-小鼠的上述腦區(qū)均明顯減少。與Bmi1-/-小鼠相比，Bmi1-/-Chk2-/-小鼠以上腦區(qū)的Iba1 和NeuN陽性細(xì)胞率明顯增加，但仍未達野生型小鼠水平。這些結(jié)果說明Chk2 敲除可促進Bmi1-/-鼠大腦皮層、海馬及下丘腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育及神經(jīng)元的分化與成熟。

輕度反應(yīng)型星形膠質(zhì)細(xì)胞增生表明星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，是腦衰老的病理學(xué)特征之一［6，24］。同樣，既往研究已證明p16的表達上調(diào)與激活是衰老的重要標(biāo)志之一［25］。本研究研究結(jié)果顯示，在2月齡時，與同窩WT小鼠相比，Bmi-1基因敲除小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育、神經(jīng)元的發(fā)育與成熟均受到阻礙，輕度反應(yīng)型星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，即活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞增多（因皮質(zhì)區(qū)GFAP陽性纖維分布極為稀疏，故本研究中未對該區(qū)GFAP 陽性纖維進行分析），p16 陽性細(xì)胞百分率及蛋白表達量均明顯上升，與既往研究發(fā)現(xiàn)的Bmi1-/-小鼠成熟前衰老表型相一致。本研究結(jié)果同時表明與Bmi1-/-小鼠相比，Bmi1-/-Chk2-/-小鼠的相應(yīng)腦衰老表型得到明顯改善，說明Chk2敲除能較好地改善Bmi-1缺失小鼠的腦衰老表型。

研究表明，衰老進程中，體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平會相應(yīng)增加［26］，而超氧化物歧化酶SOD1、SOD2均為重要的抗氧化酶，具有清除體內(nèi)過剩ROS 的功能［27］。為進一步明確Chk2 敲除是否能夠通過對細(xì)胞抗氧化能力的調(diào)節(jié)來延緩Bmi-1 缺失對腦衰老的影響，我們檢測了2 月齡Bmi1-/-、Chk2-/-、Bmi1-/-Chk2-/-及同窩WT對照小鼠腦內(nèi)的抗氧化指標(biāo)SOD1、SOD2 的表達變化。結(jié)果顯示，與同窩WT小鼠相比，SOD1和SOD2蛋白表達量在Chk2-/-小鼠腦中明顯增加，Bmi1-/-Chk2-/-小鼠腦中SOD1 和SOD2 蛋白表達量較Bmi1-/-小鼠顯著增多，但尚未達WT小鼠水平。結(jié)果說明，Chk2敲除對Bmi-1-/-小鼠腦內(nèi)降低的抗氧化能力有明顯的糾正作用，說明Chk2敲除可通過增強抗氧化能力而改善小鼠的腦衰老表型。

圖2 Chk2敲除對Bmi-1-/-小鼠大腦皮層、海馬、下丘腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的影響Figure 2 Effects of Chk2 knockout on microglia development in the cerebral cortex，hippocampus and hypothalamus of Bmi-1-/-mice

綜上所述，本研究結(jié)果證實Chk2 敲除可緩解Bmi-1缺失所致腦內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育障礙及增強其腦內(nèi)的抗氧化能力，進而在延緩Bmi-1 缺失所致的腦衰老中起重要作用。本研究將為延緩腦衰老進程的研究與臨床藥物研發(fā)提供新的靶點及初步的實驗依據(jù)。