劉 根，王培龍，高 慧

(淮北師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000)

化學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)作為化學(xué)理論課的重要支撐，是理論應(yīng)用于實(shí)踐的重要環(huán)節(jié)，目的在于培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度，提高學(xué)生分析解決問題的能力以及主動(dòng)實(shí)踐能力[1]。開放實(shí)驗(yàn)作為高等院校實(shí)驗(yàn)課程的重要補(bǔ)充部分，往往能夠激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，提高學(xué)生探索求知的能動(dòng)性。就化學(xué)類開放實(shí)驗(yàn)而言，往往承載提升學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作能力，培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立思考和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)等科研素質(zhì)的重大任務(wù)[2-3]。

機(jī)器視覺就是用機(jī)器代替人眼來做測(cè)量和判斷。機(jī)器視覺系統(tǒng)是指通過機(jī)器視覺產(chǎn)品(工業(yè)相機(jī)或科研相機(jī))將被攝取目標(biāo)轉(zhuǎn)換成圖像信號(hào)，傳送給專用的圖像處理系統(tǒng)，根據(jù)像素分布和亮度、顏色等信息，轉(zhuǎn)變成數(shù)字化信號(hào)；圖像系統(tǒng)提取相關(guān)信息后進(jìn)行分析應(yīng)用[4-5]。

電致化學(xué)發(fā)光(ECL)是指通過施加一定的電壓在電極的表面產(chǎn)生電生物質(zhì)，這些物質(zhì)彼此之間或與體系中某些組分(共反應(yīng)劑)之間以電子傳遞的方式形成激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的物質(zhì)返回基態(tài)釋放能量的同時(shí)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象[6-8]。電致化學(xué)發(fā)光是化學(xué)發(fā)光與電化學(xué)技術(shù)相結(jié)合的一種分析方法，它在繼承二者的優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)還具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。醫(yī)院對(duì)癌癥標(biāo)志物進(jìn)行免疫檢測(cè)，利用的就是在ECL羅氏技術(shù)，因?yàn)殡娭禄瘜W(xué)發(fā)光無需激發(fā)光源從而避免了外加光的干擾，并且由于檢測(cè)信號(hào)為光信號(hào)，這就排除了電化學(xué)反應(yīng)中電的干擾，具有接近于零的背景信號(hào)，提高了信噪比，從而具有高的選擇性、靈敏度[9-10]。關(guān)于電化學(xué)分析和光學(xué)分析的理論知識(shí)，大學(xué)生已在“儀器分析”課程中學(xué)習(xí)，但在大學(xué)生的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中，很少有兩種方法相結(jié)合的分析檢測(cè)試驗(yàn)。

在分析化學(xué)類專業(yè)中，開設(shè)機(jī)器視覺電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的開放實(shí)驗(yàn)，將電化學(xué)和光學(xué)的理論知識(shí)與具體的實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，使學(xué)生深刻了解電化學(xué)發(fā)光的工作原理、材料的制備方法和ECL檢測(cè)過程。引導(dǎo)學(xué)生搜索、分析、篩選相關(guān)材料，自主設(shè)計(jì)電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)平臺(tái)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出相關(guān)結(jié)論。實(shí)驗(yàn)過程中，不僅可以讓學(xué)生掌握現(xiàn)代儀器分析的專業(yè)知識(shí)，了解電化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，還可以讓學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過程中具體學(xué)習(xí)到納米材料制備、表征及性能測(cè)試的方法，培養(yǎng)學(xué)生查閱文獻(xiàn)和論文寫作等方面能力。

本開放實(shí)驗(yàn)適用于材料化學(xué)類，應(yīng)用化學(xué)類和化學(xué)師范類本科生，學(xué)生應(yīng)當(dāng)了解當(dāng)前ECL技術(shù)和光學(xué)成像技術(shù)的研究進(jìn)展，熟悉ECL成像在現(xiàn)代分析化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。參與實(shí)驗(yàn)的學(xué)生要掌握常見ECL探針的制備方法，能夠獨(dú)立設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單的納米材料并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室合成。機(jī)器視覺電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)開放實(shí)驗(yàn)的開設(shè)，能夠讓學(xué)生學(xué)會(huì)設(shè)計(jì)可視化ECL平臺(tái)，同時(shí)了解材料表征的常見方法，從而提高學(xué)生自主思考、自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和分析解決問題的能力。

一、實(shí)驗(yàn)具體教學(xué)要求

實(shí)驗(yàn)教學(xué)要求具體有以下幾點(diǎn)：第一，了解電化學(xué)發(fā)光的工作原理、發(fā)展歷史及現(xiàn)階段研究趨勢(shì)；第二，掌握常見材料的合成方法和目標(biāo)物檢測(cè)方式。學(xué)生通過收集相關(guān)文獻(xiàn)，討論并初步制定實(shí)驗(yàn)方案和相關(guān)實(shí)驗(yàn)步驟；第三，教師對(duì)學(xué)生的方案進(jìn)行研判，指導(dǎo)學(xué)生優(yōu)化方案，提高實(shí)驗(yàn)的可行性；第四，了解掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)等常規(guī)測(cè)試儀器的工作原理和用途，通過對(duì)所合成的材料進(jìn)行表征，學(xué)生能夠?qū)Σ牧系钠焚|(zhì)進(jìn)行描述和評(píng)判，進(jìn)一步培養(yǎng)學(xué)生解決實(shí)際問題的能力；第五，待測(cè)物質(zhì)造成ECL信號(hào)的變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物質(zhì)的定性和定量分析。該過程中，訓(xùn)練學(xué)生自身的儀器操作能力，學(xué)以致用，獲得合理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提高學(xué)生對(duì)數(shù)據(jù)的分析能力。

二、開放實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

(一)生物酶功能化的大金球的合成

1 M H2SO4加入5g/L Na3Au(SO3)2溶液中，反應(yīng)十分鐘，大尺寸金球顆粒形成并沉淀到試管底部。然后，用二次去離子水反復(fù)洗滌沉淀物。緊接著，在37℃的溫度下，金球顆粒、磷脂酶D(PLD，5 U/mL)和葡萄糖氧化酶(COD，2 U/mL)一起孵育24小時(shí)。在Au-S的作用下，PLD和COD自組裝到金球表面。最后，使用二次去離子水對(duì)生物酶功能化的金球進(jìn)行徹底沖洗，除去沒有吸附到金球上的PLD和COD。

圖1 金球的SEM圖(A)和TEM圖(B)

(二)材料表征

利用SEM和TEM對(duì)金球的形貌和性能進(jìn)行表征。圖1(A)和(B)分別是金球的SEM和TEM圖，很容易看出，金球大小不一，尺寸分布在100 nm～2μm之間，而且金球表面粗糙，這表明本方法合成的金球有效表面積較大以及催化活性位點(diǎn)較多。通過SEM和TEM測(cè)試，使學(xué)生掌握表征材料形貌的方法，在實(shí)驗(yàn)中提高了學(xué)生分析和評(píng)價(jià)材料性能的能力。

(三)機(jī)器視覺下磷脂酰膽堿的檢測(cè)

在含有發(fā)光劑L012和待測(cè)物磷脂酰膽堿(PdtCho)的溶液中，施加一定電壓，進(jìn)行ECL圖像采集。學(xué)生在分析成像數(shù)據(jù)后，發(fā)現(xiàn)金球在發(fā)光時(shí)存在個(gè)體性差異，但金球群體的發(fā)光強(qiáng)度滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)律。如圖2(A)所示，金球在ECL場(chǎng)中基本上都發(fā)光，但發(fā)光強(qiáng)度不均一，如圖2(B)，發(fā)光強(qiáng)度在116.3 a.u.左右浮動(dòng)。進(jìn)一步考察平均ECL強(qiáng)度與金球數(shù)目的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)隨著金球數(shù)目增多，平均ECL強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，30個(gè)及以上數(shù)目金球的平均ECL強(qiáng)度十分相近。因此，本實(shí)驗(yàn)至少采集30個(gè)金球的平均ECL信號(hào)作為檢測(cè)信號(hào)。

圖2 在含有L012和PdtCho溶液中的金球的ECL圖(A)和ECL強(qiáng)度的表面3D偽彩圖(B)

優(yōu)化條件之后，對(duì)不同濃度的PdtCho進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)原理如下，金球表面吸附有PLD和COD，兩種酶協(xié)同催化PdtCho產(chǎn)生H2O2，H2O2又是ECL試劑L012的共反應(yīng)劑。因此，PdtCho濃度越大，金球表面產(chǎn)生的H2O2就越多，收集到ECL信號(hào)就越強(qiáng)，據(jù)此可以建立待測(cè)物PdtCho的濃度與ECL強(qiáng)度的關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)PdtCho的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)中，隨著PdtCho濃度增加，30個(gè)金球的平均ECL強(qiáng)度增加，并且在0.5～10mM的濃度范圍內(nèi)滿足一定的線性關(guān)系，線性方程為I=20.23C+16.04，r=0.9916，檢出限為0.05mM。同學(xué)們通過ECL成像實(shí)驗(yàn)獲得單個(gè)金球的ECL圖像，通過觀察和討論，發(fā)現(xiàn)金球發(fā)光的個(gè)體性差異和統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)律，提高了學(xué)生自身的歸納總結(jié)的能力。對(duì)PdtCho進(jìn)行定量分析，進(jìn)一步驗(yàn)證這種統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)律的有效性，同時(shí)建立ECL成像檢測(cè)PdtCho的新方法。此過程有助于提高學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題，分析問題，解決問題的能力。

三、討論和思考

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，需討論、思考以下幾個(gè)問題：

問題一：常見的ECL試劑有哪些？為什么選擇L012作為成像試劑？

通過調(diào)研國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，學(xué)生發(fā)現(xiàn)大多數(shù)ECL實(shí)驗(yàn)利用的是含有共反應(yīng)劑ECL體系。該體系反應(yīng)過程涉及到電生物質(zhì)的產(chǎn)生、均相化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生、激發(fā)態(tài)的形成以及激發(fā)態(tài)衰減時(shí)的光輻射等。其中，以三聯(lián)吡啶釕-三丙胺和魯米諾-過氧化氫的ECL體系最為經(jīng)典。近十年來，以量子點(diǎn)、類石墨相氮化碳和鈣鈦礦材料為代表ECL體系也得到了很大發(fā)展。L012是魯米諾的衍生物，具有魯米諾相似的發(fā)光特性，但其發(fā)光強(qiáng)度是魯米諾的100倍，且L012的生物毒性較低，有利于生物酶催化活性的保持，所以本實(shí)驗(yàn)選擇L012作為成像試劑。

問題二：H2SO4和Na3Au(SO3)2的化學(xué)反應(yīng)方程式可能是什么？

Na3Au(SO3)2是非氰化學(xué)鍍領(lǐng)域的重要金源，學(xué)生通過分析試劑商提供的《化學(xué)品安全技術(shù)說明書》，得知Na3Au(SO3)2在強(qiáng)酸溶液中容易生成SO2和單質(zhì)金。所以可能的化學(xué)反應(yīng)為：2[Au(SO3)2]3-+4H+==2Au+3SO2+SO42-+2H2O

問題三：金球在成像過程中起到什么作用？

學(xué)生對(duì)這一問題進(jìn)行分組討論，他們歸納了各種尺寸的金球的合成方法。根據(jù)文獻(xiàn)得知，納米級(jí)的金球比較常見，但大小普遍在100nm以下；大尺寸金球比較難以合成，微米級(jí)金球更是少見。由于本實(shí)驗(yàn)是光學(xué)顯微成像，阿貝衍射極限要求金球的尺寸必須在200nm以上，而想獲得空間可分辨的成像效果，學(xué)生們選擇合成微米級(jí)金球。由于PLD和COD含有巰基，很容易形成Au-S鍵，使生物酶負(fù)載到金球上，這樣金球就成為ECL反應(yīng)的場(chǎng)所。

問題四：如何提高ECL強(qiáng)度？

增敏ECL的方法很多，和老師交流之后，學(xué)生了解到可以考慮電極表面“內(nèi)殼層”和“外殼層”催化的兩種形式。對(duì)于魯米諾-過氧化氫體系而言，重點(diǎn)是提高反應(yīng)過程中活性氧的產(chǎn)量，可以使用二茂鐵這樣的電生催化劑，也可以使用血紅素、碳納米管這樣的可以修飾到電極表面的催化劑。

問題五：如果不采用大量金球的平均ECL強(qiáng)度，而是使用單個(gè)金球的ECL強(qiáng)度作為檢測(cè)信號(hào)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果將會(huì)產(chǎn)生什么樣的影響？

學(xué)生在明場(chǎng)和ECL場(chǎng)中考察了200個(gè)金球的成像情況，10個(gè)和20個(gè)金球的平均ECL強(qiáng)度相對(duì)較大，30個(gè)，50個(gè)，100個(gè)和200個(gè)金球的平均ECL強(qiáng)度十分相近，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%。如果只收集單個(gè)金球的ECL信號(hào)，異質(zhì)性使得規(guī)律性不明顯，低濃度PdtCho的ECL強(qiáng)度有可能小于、等于甚至大于高濃度PdtCho的ECL強(qiáng)度。依靠單個(gè)金球建立準(zhǔn)確的線性關(guān)系是非常困難的。

四、教學(xué)探討

開放實(shí)驗(yàn)要求學(xué)生掌握和了解相關(guān)專業(yè)知識(shí)，理論與實(shí)踐相結(jié)合，拓寬學(xué)生的視野。適當(dāng)增加實(shí)驗(yàn)的難度，一方面增加學(xué)生對(duì)科研的興趣，另一方面讓學(xué)生深入?yún)⑴c探索求知的過程，積極發(fā)揮主觀能動(dòng)性和創(chuàng)造力。

該實(shí)驗(yàn)中，學(xué)生將機(jī)械視覺和材料科學(xué)相結(jié)合，借助于機(jī)器視覺對(duì)材料的發(fā)光情況進(jìn)行分析，學(xué)生對(duì)一些現(xiàn)象進(jìn)行歸納總結(jié)，建立起對(duì)磷脂酰膽堿的檢測(cè)的新方法。

但在開放實(shí)驗(yàn)過程中，也存在一些問題：

第一，機(jī)器視覺檢測(cè)是分析化學(xué)中新興的檢測(cè)手段，大學(xué)教材中并未涉及，大學(xué)生缺乏對(duì)一些前沿的專業(yè)知識(shí)的了解。大學(xué)生調(diào)研文獻(xiàn)存在一定的盲目性，在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案時(shí)，創(chuàng)新性明顯，但可行性較差。

第二，大多數(shù)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)記錄不夠規(guī)范，有些重要的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)被忽略，在分析問題時(shí)缺乏可參考的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

第三，在操作過程中，有些學(xué)生缺乏耐性，急于求成，獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想。使用儀器時(shí)，對(duì)儀器的保護(hù)意識(shí)淡薄，存在超限使用的問題。

第四、機(jī)器視覺檢測(cè)的化學(xué)原理基本明確，但相關(guān)的視覺軟件代碼編寫存在困難，需要加強(qiáng)計(jì)算機(jī)相關(guān)技能學(xué)習(xí)，實(shí)現(xiàn)多學(xué)科知識(shí)的綜合應(yīng)用。

因此，在日后實(shí)驗(yàn)過程中，指導(dǎo)老師應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì)專業(yè)性較強(qiáng)的理論知識(shí)的講授，引導(dǎo)學(xué)生關(guān)注前沿課題，抓住關(guān)鍵問題，設(shè)計(jì)出既有理論支持，又切合實(shí)際的實(shí)驗(yàn)方案。發(fā)現(xiàn)問題，分析問題，解決問題是一個(gè)連貫性過程，實(shí)驗(yàn)過程中每一個(gè)細(xì)節(jié)都有可能影響問題的分析與解決。因此，有必要要求學(xué)生認(rèn)真做好實(shí)驗(yàn)記錄，指導(dǎo)老師也要定時(shí)檢查學(xué)生的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，及時(shí)幫助學(xué)生分析問題，參與相關(guān)討論。分析化學(xué)講究的是“慢工出細(xì)活”，浮躁的情緒往往會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)該懂得自我調(diào)整，加強(qiáng)科研素質(zhì)的培養(yǎng)。