王征，張浩，李偉漢，翟曉建，宋春峰，郭滿

橋本甲狀腺炎（Hashimoto’s thyroiditis，HT）又稱慢性淋巴細胞性甲狀腺炎，它是一種自身免疫性疾病，且是引起甲狀腺功能減退的病因之一。HT病人的遺傳易感性使機體易發(fā)生自體免疫反應，與女性卵巢功能異常甚至不孕均存在關聯，且HT 與乳頭狀甲狀腺癌的高發(fā)病率有明顯相關性，因此尋找用于HT 早期診斷的臨床指標十分必要。微小RNA（miRNA）是一類非編碼小分子單鏈RNA，進化中高度保守，在許多疾病發(fā)生的過程中均有異常表達，是調控細胞增殖、代謝、凋亡等生物活動的關鍵調節(jié)分子。許多miRNA 被證實在炎癥性自身免疫疾病過程中發(fā)揮抗炎或促炎作用。研究表明miR-142-3p、miR-150 均在類風濕關節(jié)炎等慢性自身免疫炎癥性疾病中表達異常。但目前同時檢測甲狀腺組織和外周血單個核細胞中miR-142-3p、miR-150 表達水平，同時探討兩者水平變化與HT 病人病情關系的研究較少。

因此，本研究通過檢測HT 病人甲狀腺組織和外周血單個核細胞中miR-142-3p、miR-150 表達水平，探討二者表達水平在HT 病人中的臨床意義，為miR-142-3p、miR-150 在 HT 疾病中應用提供一定的參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年3月至2019年6月于南陽市中心醫(yī)院住院進行甲狀腺手術切除并經病理確診為HT的87例病人為研究對象（HT組），男36例，女51例，年齡（44.26±16.41）歲，年齡范圍為27～61歲；均因甲狀腺腫出現氣管壓迫癥狀或疑診為甲狀腺癌施行手術，術后病理證實為HT；同期選取73 例于南陽市中心醫(yī)院進行甲狀腺腺瘤切除術的非癌病人作為對照（對照組），男29例，女44例，年齡（42.38±17.54）歲，年齡范圍為25～60歲。兩組之間性別、年齡均差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05），具有可比性。

納入標準：①均符合 HT 診斷標準；②有甲狀腺功能減退的體征；③典型的臨床癥狀，如可觸及彌漫性甲狀腺腫大且出現氣管壓迫癥狀、伴峽部錐體葉腫大、質地較韌等；④病歷資料清晰完整者；⑤甲狀腺B超回聲不均。排除標準：①精神異常者；②伴有肝炎、腎病、糖尿病、結核病等其他內科疾病；③患有慢性炎癥性疾病、急性感染性疾病者；④嚴重的肝腎功能不全者；⑤妊娠或哺乳期婦女。所有研究對象均自愿參加，并簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學協會赫爾辛基宣言》的相關要求。

1.2 研究方法

1.2.1

樣品采集及保存 清晨抽取兩組空腹外周靜脈血樣，3 000 r/min 離心15 min 后收集血清，置于-80 ℃保存待測；取甲狀腺手術切除后的甲狀腺組織標本，對照組取甲狀腺腺瘤旁的“正常”甲狀腺組織，置于-80 ℃保存待測。

1.2.2

單個核細胞的分離及處理 （1）稀釋：將采集血樣置于離心管中并加入同等體積的PBS液充分混勻；（2）加樣：將混勻的血樣緩慢、貼壁加入盛有外周血淋巴細胞分離液的離心管中，以細胞分離液同血樣明顯分層為佳，切忌破壞界面；（3）離心：將樣品放入離心機中2 000 r/min 水平離心20 min；可見離心管中出現明顯分層。最上層為淡黃色血清，第二層為乳白色淋巴細胞層，第三層為分離液層，最下層為紅細胞層。第二層中的白色薄層即為外周血單個核細胞層；（4）樣品收集：收集第二層到EP管，2 000 r/min 低溫離心5 min。棄上清，收集乳白色細胞；（5）PBS 沖洗：加入大約 5 倍體積的 PBS 緩沖液，吹懸數次，1 000 r/min 低溫離心10 min，棄上清，重復2～3次，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?p>1.2.3

qRT-PCR 法檢測甲狀腺組織和外周血單個核細胞中miR-142-3p、miR-150 水平 采用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法檢測兩組甲狀腺組織和外周血單個核細胞中miR-142-3p、miR-150 水平。采用 RNA 提取試劑盒提取甲狀腺組織和外周血單個核細胞總RNA，反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA，步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。采用qRT-PCR 儀對miR-142-3p、miR-150 進行擴增，qRT-PCR 反應體系共 10 μL：miScript SYBRGreen Mix 5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA（50 ng/μL）1 μL，ddHO 3.0 μL，引物由上海生工生物公司合成。miR-142-3p 反應條件：95 ℃，90 s；95 ℃、10 s，60℃、30s，40 個循環(huán)。miR-150 反應條件：95 ℃，5 min；95 ℃、15 s，58 ℃、60 s，40 個循環(huán)。miR-142-3p、miR-150 及內參 U6 的引物序列見表 1。采用 2法對血清 miR-142-3p、miR-150表達水平進行定量分析。

表1 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）引物序列

1.2.4

檢測甲狀腺功能參數和相關細胞因子水平采用電化學發(fā)光法檢測游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）、游離甲狀腺素（Free Thyroxine，FT4）、促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）水平。采用酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測細胞因子白細胞介素17（interleukin 17，IL-17）、白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的水平。操作方法嚴格按試劑盒及儀器使用說明書進行。

1.3 主要試劑與儀器

人外周血淋巴細胞分離液（貨號P8900），購自北京索來寶公司；RNA 提取試劑盒（貨號：DP419），購自于北京天根生化有限公司；miScript SYBRGreen qPCR Kit（貨號218073），購自德國 QIAGEN 公司。CFX96 型 qRT-PCR 儀，購自美國Bio-Rad 公司；E170型電化學發(fā)光免疫分析儀，購自瑞士Roche公司。

2 結果

2.1 兩組一般資料及甲狀腺功能參數比較

兩組年齡、性別、體質量指數（BMI）比較，均差異無統(tǒng)計學意義（

P＞

0.05）。兩組甲狀腺功能參數比較，均差異有統(tǒng)計學意義，HT 組TSH、TPOAb 水平顯著高于對照組（

P

＜0.05），FT、FT水平顯著低于對照組（

P

＜0.05）。見表2。

表2 兩組一般資料及甲狀腺功能參數比較

2.2 兩組甲狀腺組織和外周血單個核細胞中miR

-

142

-

3p、miR

-

150 水平比較

HT 組甲狀腺組織和外周血單個核細胞中miR-142-3p、miR-150 表達水平均顯著高于對照組（

P

＜0.05）。見表3。

表3 兩組甲狀腺組織和外周血單個核細胞中微小RNA-142-3p（miR-142-3p）、微小 RNA-150（miR-150）水平比較/

2.3 兩組相關細胞因子水平比較

兩組相關細胞因子水平比較，均差異有統(tǒng)計學意義，HT 組IL-17、IL-6、IFN-γ、TGF-β1水平顯著高于對照組（

P

＜0.05）。見表4。

表4 兩組相關細胞因子水平比較（/ng/L，）

2.4 HT 病人甲狀腺組織和外周血單個核細胞中miR

-

142

-

3p、miR

-

150 水平相關性

Pearson 法分析結果顯示，HT病人甲狀腺組織和外周血單個核細胞中miR-142-3p、miR-150 水平均呈正相關（

r

=0.605、0.632，均

P

＜0.05）。見圖1，2。

圖1 HT病人甲狀腺組織中miR-142-3p、miR-150水平相關性

圖2 HT病人外周血單個核細胞中miR-142-3p、miR-150水平相關性

2.5 HF 病人

miR

-

142

-

3p、miR

-

150 水平與甲狀腺功能參數及相關細胞因子相關性

HF 病人甲狀腺組織和外周血單個核細胞中miR-142-3p、miR-150水平與 FT、FT均 呈負相關（

P

＜0.05），與 TSH、TPOAb、IL-17、IL-6、IFN-γ、TGF-β1 均呈正相關（

P

＜0.05）。見表5。

表5 HT病人miR-142-3p、miR-150 水平與甲狀腺功能參數及相關細胞因子相關性

3 討論

HT是最常見的自身免疫性甲狀腺疾病，也是一種器官特異性疾病。HT 病人可能出現典型的甲狀腺功能亢進或低下，主要表現為：手抖、心悸、易便秘、女性月經不規(guī)律等。HT 可能會進一步引發(fā)乳頭狀甲狀腺癌等疾病，對病人身心健康造成威脅，使其生活質量下降，醫(yī)療費用增多，不良結局發(fā)生率升高。HT 發(fā)病因素具有多樣性且早期發(fā)病癥狀不十分明顯，因此尋找早期評價HT 的指標對于降低患病率具有重要意義。

miRNA 在細胞凋亡、生物發(fā)育等過程中發(fā)揮重要的調控作用，且有研究表明，miRNA 水平的異常變化與炎癥性免疫疾病、腫瘤等的發(fā)生、發(fā)展有關，如類風濕性關節(jié)炎、代謝綜合征、炎癥性腸病等。因此，miRNA 在炎癥性免疫疾病中的檢測和鑒定也迅速發(fā)展為熱門研究領域。而HT 作為第一個器官特異性自身免疫性疾病，至今較少有文獻報道其相關miRNA 表達水平情況。對miR-142-3p、miR-150目前的研究主要集中在癌癥方面，關于自身免疫性疾病的研究較少，然而有研究報道其在自身免疫性疾病中表達顯著升高，且與疾病嚴重程度相關，提示miR-142-3p、miR-150 可能在免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。張順霞等采用miRNA芯片技術對HT 和正常甲狀腺組織中miRNA 的表達進行比較，發(fā)現與正常甲狀腺相比，HT 中miR-142-3p、miR-150 等基因表達上調，miR-654-5p、miR-610 等基因表達下調。本研究結果表明，HT組甲狀腺組織和外周血單個核細胞中miR-142-3p、miR-150 表達水平均顯著高于對照組，且均呈正相關。提示HT 病人中miR-142-3p、miR-150 表達水平高于正常人群，二者可能與HT 疾病發(fā)生有密切聯系，臨床上可將其作為早期診斷HT 的參考指標密切監(jiān)測其水平變化，對降低患病率可能有重要作用。進一步研究發(fā)現兩組甲狀腺功能參數比較，均差異有統(tǒng)計學意義，HT 組 TSH、TPOAb 水平顯著高于對照組，FT、FT水平顯著低于對照組；兩組相關細胞因子水平比較，均差異有統(tǒng)計學意義，HT 組IL-17、IL-6、IFN-γ、TGF-β1 水平顯著高于對照組。已有研究表明，FT、TSH 及 IL-17、IL-6 等參數是 HT 診治過程中的常用手段，也是表征甲狀腺功能的重要指標。因此本研究中各指標水平異常變化反映了HT 病人中甲狀腺功能可能受損。HF 病人甲狀腺組織和外周血單個核細胞中 miR-142-3p、miR-150 水平與FT、FT均呈負相關，與 TSH、TPOAb、IL-17、IL-6、IFN-γ、TGF-β1 均呈正相關。提示 miR-142-3p、miR-150 水平的升高可能與機體甲狀腺功能受損，繼而導致的炎癥反應有關，表明miR-142-3p、miR-150 可能參與HT疾病的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，HT病人甲狀腺組織和外周血單個核細胞中miR-142-3p、miR-150 呈高表達。猜測miR-142-3p、miR-150 水平升高可能是由于機體甲狀腺功能受損，進而導致機體的炎癥免疫反應加速HT病情的發(fā)生、發(fā)展，二者聯合使用對早期HT 診斷有一定臨床參考價值。但機體甲狀腺功能受損以及由此引發(fā)的炎癥反應具體如何影響miR-142-3p、miR-150 水平尚需進行下一步探討，且本研究中樣本數量較小，范圍局限，需加大樣本量進一步研究。