張來鑫，謝大偉，李青松，邢家輝，錢偉萍

骨肉瘤是一種原發(fā)性骨骼惡性腫瘤，常見于兒童、青少年和老年人，約占所有骨骼惡性腫瘤的15%。其多發(fā)于四肢管狀骨，導致關節(jié)活動受限、骨折，甚至發(fā)生肺部轉移，發(fā)病率高，預后較差。近年來盡管手術和術后輔助化療在一定程度上提高了骨肉瘤病人生存率，但復發(fā)或轉移性骨肉瘤病人的5 年生存率僅為30%。因此，探索新的治療靶點對骨肉瘤病人的治療至關重要。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長度大于200 nt 轉錄本RNA，在腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲過程中起著重要的調控作用。研究顯示lncRNA 前列腺癌相關轉錄因子6（prostate cancer associated transcript 6，PCAT6）在結腸癌組織中上調表達，促進結直腸癌細胞的生長，抑制細胞凋亡。lncRNA PCAT6 在肺癌中也呈高表達，下調PCAT6 能夠誘導肺癌細胞早期凋亡，抑制其增殖和轉移。然而，其在骨肉瘤中的作用尚未被研究。生物信息學分析顯示，PCAT6 可能與miR-139-3p 之間存在相互作用。miR-139-3p 已被證實可在骨肉瘤中具有增殖抑制和凋亡誘導作用。于是推測PCAT6可能靶向miR-139-3p 參與骨肉瘤進展。因此，本研究擬通過檢測骨肉瘤組織以及瘤旁組織中PCAT6 和miR-139-3p 的表達水平，旨在揭示PCAT6 調控miR-139-3p對骨肉瘤細胞增殖和凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取 2016 年 1 月至 2018 年 1 月秦皇島市中醫(yī)醫(yī)院收治的骨肉瘤病人20 例為研究對象。其中男性14例，女性6例，年齡25歲，年齡范圍為10～55 歲。選取活檢得到的腫瘤組織及癌旁組織，腫瘤標本經病理診斷均為骨肉瘤，癌旁組織為正常組織。納入標準：病人術前均未接受放療、化療或其他治療；于我院擬采取新輔助化療后手術治療。入組病人均同意使用組織樣本，且簽訂知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》的相關要求。

骨肉瘤細胞SAOS2 購于中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所；含有青鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)液購于美國Hyclone 公司；脂質體Lipofectamine2000 購于美國 Invitrogen 公司；PCAT6 小干擾 RNA（si-PCAT6）、小干擾 RNA 陰性對照（si-NC）、抑制物陰性對照（anti-miR-NC）、miR-139-3p模擬物（miR-139-3p mimics）、模擬物陰性對照（miRNC）、空載體質粒（pcDNA）、miR-139-3p 抑制物（anti-miR-139-3p）、PCAT6 過 表 達 載 體（pcDNAPCAT6）、含miR-139-3p 結合位點的野生型PCAT6熒光素酶報告基因載體（WT-PCAT6）、突變型熒光素酶報告基因載體（MUT-PCAT6）購自上海吉瑪制藥公司；實時熒光定量PCR 試劑盒（Real-time fluorescent quantitative PCR kit，RT-qPCR）試劑盒購于大連TAKARA 公司；RIPA 裂解液購于北京索萊寶公司；細胞計數(shù)試劑盒（Cell Counting Kit 8，CCK-8）試劑盒購于美國MCE 公司；兔源磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、P21、B 細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukaemia -2，Bcl-2）、細胞周期素 D1（Cyclin D1）以及 Bcl-2 相關 X 蛋白（Bax）抗體購于美國 Abcam 公司；山羊抗兔Ⅱ抗購于南京金斯瑞生物科技有限公司；膜聯(lián)蛋白異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）雙染細胞凋亡檢測試劑盒購于杭州貝博生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1

細胞培養(yǎng)和實驗分組 SAOS2 細胞采用DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃、5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每2 d換液1次，待細胞貼壁達到80%時，采用胰酶消化傳代。收集5×10個生長狀態(tài)良好的第 3～5 代對數(shù)期 SAOS2 細胞接種 96 孔板，參照Lipofectamine2000 試劑盒步驟進行瞬時轉染。將si-PCAT6、si-NC、miR-139-3p mimics、miR-NC 分別轉染至60%融合的SAOS2 細胞，并標記為si-PCAT6組、si-NC 組、miR-139-3p 組、miR-NC 組。轉染 6 h 后更換新鮮細胞培養(yǎng)液，轉染48 h 收集各組細胞，檢測lncRNA PCAT6 和miR-139-3p 的表達、以及細胞的增殖活力及凋亡情況。為驗證lncRNA PCAT6 是通過調控miR-139-3p 表達進而影響SAOS2 細胞的增殖和凋亡，將si-PCAT6 分別與anti-miR-NC、antimiR-139-3p 共轉染至SAOS2 細胞，并標記為si-PCAT6+anti-miR-NC 組 、si-PCAT6+anti-miR-139-3p組，轉染48 h檢測細胞活力和凋亡情況。

1.2.2

RT-qPCR 檢 測 lncRNA PCAT6 和 miR-139-3p 的表達 以TRIzol 法分別提取骨肉瘤組織和各組SAOS2細胞的總RNA 后，參照逆轉錄試劑盒說明書步驟合成cDNA，參照RT-qPCR 試劑盒說明書以cDNA 為模板進行PCR 擴增。其中PCR 引物由上海生工公司合成。序列如下（5’-3’）：PCAT6正向引物CAGGAACCCCCTCCTTACTC， 反 向 引 物CTAGGGATGTGTCCGAAGGA；GAPDH 正 向 引 物GGGAGCCAAAAGGGTCAT， 反 向 引 物GAGTCCTTCCACGATACCAA。miR-139-3p 上游引物 pGGAGACGCGGCCCTGTTGGAGT；U6 正向引物上游引物ACGCAAATTCGTGAAGCGTT；miR-139-3p 和U6 反向引物為試劑盒提供的通用引物。采用2法 檢 測 骨 肉 瘤 組 織 和 各 組 SAOS2 細 胞 中 lncRNA PCAT6和miR-139-3p的表達水平。

1.2.3

CCK-8試劑盒檢測細胞活力 將5×10cells/孔接種到 96 孔板，分別在轉染 24、48、72 h 取10 μL的CCK-8試劑加到96孔板各孔細胞中，緩慢晃動培養(yǎng)板，混勻后繼續(xù)孵育2 h，在450 nm 處檢測各孔的吸光度值。

1.2.4

流式細胞術檢測細胞凋亡 用1×結合緩沖液調整轉染48 h細胞濃度為1×10cells/mL。分別取5 μL 的 Annexin V-FITC 和 5 μL 的 PI 加入 100 μL 細胞懸液中，避光條件下孵育15 min，1 h 內上機檢測各組SAOS2細胞凋亡情況。

1.2.5

蛋白質印跡法（Western blotting）檢測Cyclin D1、Bcl-2、P21 和 Bax 蛋白的表達 利用 RIPA 裂解液提取各組SAOS2細胞總蛋白。蛋白定量后，將2×蛋白上樣緩沖液以1：1比例與蛋白樣品混合，100 ℃孵育5 min 變性細胞蛋白，配制分離膠和濃縮膠后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后濕法轉移蛋白到硝酸纖維素膜。用5%脫脂牛奶在25℃封閉膜1 h，TBST 洗膜 2 min，加入Ⅰ抗室溫孵育 2 h，TBST 洗膜10 min，洗滌 3 次，加入Ⅱ抗在25 ℃孵育1 h，TBST洗膜10 min，洗滌3 次后，用化學發(fā)光試劑于暗盒內顯色，應用ImageJ 軟件測定各組SAOS2 細胞目的蛋白灰度值。GAPDH作為內參。

1.2.6

雙熒光素酶報告基因實驗驗證lncRNA PCAT6 和miR-139-3p 的靶向關系 采用生物信息學分析工具LncBase Predicted v.2 進行靶基因預測顯示，lncRNA PCAT6 和 miR-139-3p 之間存在部分特異性結合位點，推測lncRNA PCAT6 和miR-139-3p 存在相互作用。將WT-PCAT6 與miR-139-3p mimics、WT-PCAT6 與 miR-NC、MUT-PCAT6 與 miR-139-3p mimics、MUT-PCAT6 與 miR-NC 分別共轉染SAOS2 細胞，轉染48 h 時檢測各組SAOS2 細胞的熒光素酶活性。為驗證lncRNA PCAT6 對miR-139-3p的調控作用，分別將pcDNA、pcDNA-PCAT6、si-NC、si-PCAT6 轉染 SAOS2 細胞，轉染 48 h，參照上述 RT-qPCR方法檢測各組細胞miR-139-3p的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0 進行統(tǒng)計學分析。每組實驗均設置3 個復孔或平行實驗并重復3次，實驗數(shù)據(jù)以ˉx±s表示。兩組間比較行獨立樣本

t

檢驗，多組間比較行單因素方差分析和SNK-q檢驗。

P

＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 骨肉瘤組織中l(wèi)ncRNA PCAT6 和miR

-

139

-

3p的表達

骨肉瘤組織中PCAT6 表達水平顯著高于癌旁組織，miR-139-3p 表達水平顯著低于癌旁組織（

P

＜0.05）。見表1。

表1 骨肉瘤組織中長鏈非編碼RNA（LncRNA）前列腺癌相關轉錄因子6（PCAT6）和微小RNA-139-3p（miR-139-3p）的表達/

2.2 抑制lncRNA PCAT6 表達對骨肉瘤SAOS2 細胞增殖和凋亡的影響

轉染si-PCAT6 后SAOS2 細胞 PCAT6 表達、CyclinD1 和 Bcl-2 蛋白表達、細胞活力（48、72 h）顯著降低，p21 蛋白表達、細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著升高（

P

＜0.05）。見表2。

表2 抑制長鏈非編碼RNA（LncRNA）前列腺癌相關轉錄因子6（PCAT6）表達對骨肉瘤SAOS2細胞增殖和凋亡的影響/（，n=9）

2.3 lncRNA PCAT6 靶

向 調 控

miR

-

139

-

3p 的

表達

采用生物信息學分析工具LncBase Predicted v.2 進行靶基因預測顯示PCAT6 和miR-139-3p 之間存在互補序列，見圖1。雙熒光素酶報告實驗顯示，同與 WT-PCAT6 共轉染，轉染 miR-139-3p mimics 與轉染miR-NC 比較SAOS2 細胞熒光素酶活性顯著降低（

P

＜0.05），見表 3。RT-qPCR 檢測顯示，過表達PCAT6 后 SAOS2 細胞 miR-139-3p 的表達水平顯著降低；抑制PCAT6后SAOS2細胞miR-139-3p的表達水平顯著升高，見表4。

表3 雙熒光素酶報告實驗/（，n=9）

表4 長鏈非編碼RNA（LncRNA）前列腺癌相關轉錄因子6（PCAT6）調控miR-139-3p/（，n=9）

圖1 前列腺癌相關轉錄因子6（PCAT6）和miR-139-3p預測結合位點

2.4 miR

-

139

-

3p 過表達對骨肉瘤SAOS2 細胞增殖和凋亡的影響

轉染miR-139-3p mimics 后SAOS2細胞 miR-139-3p 表達、p21 和 Bax 蛋白表達、細胞凋亡率顯著升高，CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表達、細胞活力（48、72 h）顯著降低（

P

＜0.05）。見表5。

表5 miR-139-3p過表達對骨肉瘤SAOS2細胞增殖和凋亡的影響/（，n=9）

2.5 抑制miR

-

139

-

3p 減弱了抑制lncRNA PCAT6對骨肉瘤SAOS2 細胞增殖和凋亡的作用

與si-PCAT6 組比較，si-PCAT6 組 SAOS2 細胞 miR-139-3p表達、p21 和Bax 蛋白表達、細胞凋亡率顯著升高，CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表達、細胞活力（48、72 h）顯著降低；與si-PCAT6+anti-miR-NC 組比較，si-PCAT6+anti-miR-139-3p 組 SAOS2 細 胞 miR-139-3p表達、p21 和Bax 蛋白表達、細胞凋亡率顯著降低，CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表達、細胞活力（48、72 h）顯著升高，凋亡率顯著降低（

P

＜0.05）。見表6。

表6 抑制miR-139-3p減弱了抑制lncRNA PCAT6對骨肉瘤SAOS2細胞增殖和凋亡的作用/（，n=9）

3 討論

lncRNA 廣泛參與細胞生長、分化和代謝等生物學過程，與骨肉瘤等多種疾病的進展關系密切。本研究旨在揭示lncRNA PCAT6 在骨肉瘤進展中的作用。

腫瘤中異常表達的lncRNA 在調節(jié)腫瘤細胞惡性生物表型中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA PCAT6 在卵巢癌組織中表達上調，與遠處轉移或淋巴結轉移密切相關，干擾PCAT6 表達后卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著降低。胃癌中l(wèi)ncRNA PCAT6 高表達與胃癌病人預后、胃癌轉移、臨床病理分期呈負相關，過表達PCAT6 增加了胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，而減少了胃癌細胞的凋亡。此外，lncRNA PCAT6 高表達與宮頸浸潤深度及淋巴結轉移呈正相關，與總生存期和無病生存期呈負相關，lncRNA PCAT6 高表達是宮頸癌病人不良預后的生物標志物。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA PCAT6 在骨肉瘤組織中表達較低，提示lncRNA PCAT6 可能在骨肉瘤的進展中發(fā)揮重要作用。進一步研究顯示抑制PCAT6 表達可下調骨肉瘤細胞CyclinD1和Bcl-2蛋白表達，降低細胞活力，上調p21和Bax 蛋白表達，誘導細胞凋亡。提示lncRNA PCAT6在骨肉瘤進展中發(fā)揮癌基因作用。

研究表明lncRNA 具有miRNA 分子海綿吸附作用，從而參與對多種腫瘤進展的調控。例如lncRNA PCAT6通過調控miR-330-5p促進了膽管癌細胞的增殖和侵襲。lncRNA PCAT6 還可通過與miR-204 相互作用調節(jié)結直腸癌細胞對5-氟尿嘧啶的耐藥性。為揭示lncRNA PCAT6 在骨肉瘤中的作用機制，利用在線生物信息學分析工具發(fā)現(xiàn)miR-139-3p 和PCAT6 之間存在部分連續(xù)結合位點。研究發(fā)現(xiàn)miR-139-3p 表達水平與骨肉瘤組織中PCAT6 表達呈負相關，并證實miR-139-3p 是lncRNA PCAT6 的靶基因，且 miR-139-3p 的表達受到lncRNA PCAT6 負性調控。研究報道m(xù)iR-139-3p 過表達可抑制膠質母細胞瘤細胞的生長和轉移。此外，miR-139-3p 在乳腺癌和結腸癌中也發(fā)揮抑癌基因作用，miR-139-3p 表達下降與乳腺癌和結腸病人預后較差顯著相關，是乳腺癌和結腸病人潛在預后標志物。本研究發(fā)現(xiàn)過表達miR-139-3p 可下調骨肉瘤細胞CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表達，上調p21和Bax 蛋白表達，降低胞活力，誘導細胞凋亡，與前人研究結論相吻合。進一步研究顯示抑制miR-139-3p 表達可逆轉抑制PCAT6 對骨肉瘤細胞的增殖抑制和凋亡促進作用。以上結果提示在骨肉瘤中l(wèi)ncRNA PCAT6 通過靶向負性調控miR-139-3p 發(fā)揮其致癌作用。

綜上所述，lncRNA PCAT6 在骨肉瘤中表達上調，miR-139-3p 表達下調。抑制 lncRNA PCAT6 通過靶向miR-139-3p 可抑制骨肉瘤細胞增殖并誘導細胞凋亡，lncRNA PCAT6 是骨肉瘤的潛在治療靶點。