鄒學(xué)紅，汪俊，王芳，謝環(huán)

子宮內(nèi)膜癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，但關(guān)于子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制仍不明確。有研究發(fā)現(xiàn)紫杉醇（paclitaxel，PTX）可抑制乳腺癌等腫瘤細(xì)胞，PTX 可聯(lián)合順鉑用于子宮內(nèi)膜癌的治療。有多項研究表明miRNAs 可影響癌細(xì)胞對PTX 藥物敏感性，如miRNA-101 增強(qiáng)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞對PTX 的藥物敏感性。有報道稱 miR-338-3p 可靶向 FOXP4 抑制肝癌細(xì)胞的增殖，miR-338-3p 通過調(diào)控 ZEB2 和MACC1 信號通路影響胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，但關(guān)于miR-338-3p 在子宮內(nèi)膜癌的表達(dá)相關(guān)研究仍較少。有研究發(fā)現(xiàn)高遷移率蛋白B1（high-mobilitygroupboxprotein-1，HMGB1）在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮促癌基因作用。但 miR-338-3p 是否通過調(diào)控HMGB1 表達(dá)增強(qiáng)子宮內(nèi)膜癌對PTX 的敏感性仍未可知。本研究自2019年1-6月通過流式細(xì)胞術(shù)和CCK-8 實驗，探討miR-338-3p 調(diào)控人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B 和ishikawa 對PTX 敏感性的影響分子機(jī)制，為深入探討人子宮內(nèi)膜癌發(fā)病和耐藥機(jī)制以及改善子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

DMEM 培養(yǎng)基（C11965500BT）、青霉素和鏈霉素（15140122）為美國Gibco 公司產(chǎn)品；ECL 試劑（P0018）、RIPA 蛋白裂解液（P0013B）、HMGB1 抗體（AF1174）和蛋白印跡法（Western blottingting）所用試劑為碧云天公司產(chǎn)品；β-肌動蛋白（β-actin）為德國Merck 公司產(chǎn)品（A4700）；Trizol 試劑為英濰捷基公司產(chǎn)品（15596026）；CCK-8 試劑盒（CA1210）為索萊寶公司產(chǎn)品；mirPremiemicro RNA Isolation Kit（SNC50）為德國 Merck 公司產(chǎn)品；一步法miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（D1801）為新?；蚬井a(chǎn)品；mirVana實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）miRNA detection Kit（AM1558）為賽默飛公司產(chǎn)品；雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒（E1751）為美國Promega 公 司 產(chǎn) 品 ；Annexin V-FITC/PI 檢 測 試 劑（CA1020）、CCK8 試劑盒（CA1210）為北京 Solarbio公司產(chǎn)品；PTX（33069-62-4，純度≥98%）為成都德銳可生物科技有限公司；實驗中所用引物、質(zhì)粒均由江蘇金唯智公司合成制備。

1.2 方法

1.2.1

細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa 細(xì)胞株由中國人民解放軍武漢總醫(yī)院醫(yī)院婦產(chǎn)科實驗室保存，人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞ESC和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1B 購于北京細(xì)胞中心，細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基中，在 37 ℃、5%二氧化碳及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；將細(xì)胞分為如下5組：miR-338-3p組（轉(zhuǎn)染miR-338-3p mimics組）、miR-NC（轉(zhuǎn)染miRNA陰性對照組）、si-HMGB1組（轉(zhuǎn)染干擾RNA）、si-NC 組（轉(zhuǎn)染siRNA 陰性對照）和miR-338-3p+HMGB1 組（共轉(zhuǎn)染 miR-338-3pmimics和pcDNA3.0 HMGB1 組），將各組用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至 Ishikawa 和 HEC-1B 細(xì)胞，培養(yǎng) 6 h 后更換為完全培養(yǎng)基用于后續(xù)實驗。

1.2.2

Ishikawa 和 HEC-1B 細(xì) 胞 PTX 敏 感 性 的 檢測 將上述轉(zhuǎn)染組細(xì)胞接種至96孔板中，細(xì)胞密度為 8×10個/mL，24 h 后，各孔加入相應(yīng)濃度的 PTX（終濃度分別為 0 、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)基，加入完全培養(yǎng)基100 μL 和10 μL CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)1 h，按照1.2.4 中方法檢測細(xì)胞增殖，并計算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，繪制擬合曲線。

1.2.3

RT-qPCR 檢測 miR-338-3p mRNA 水平 采用 TRIZOL 法提取細(xì)胞總 RNA，mirPremiemicro RNA Isolation Kit 分離miRNA，利用一步法miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用mirVanaqRT-PCR miRNA detection 試劑盒進(jìn)行RT-qPCR 檢測，以U6為內(nèi)參，2法檢測 miR-338-3p mRNA 水平，步驟參照各試劑盒方法。MiRNA-338-3p（退火溫度為60 ℃）的SRT 引物：TCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAAT-TCAGTTGAGCAACAA；特異性性引物：AUGACUCAGGCGACTCCAGC-ATCAGTGATT；通用引物：TGGTGTCGTGGAGTCG；U6（退火溫度為58 ℃）引 物 ：F：GCGGTCTGCGCGATCAAG，R：TTCCCCTCGAGCTCATTGCC。

1.2.4

CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖 將上述處理組細(xì)胞消化后接種至96 孔板中，每孔100 μL，每孔細(xì)胞為 6×10個，每組設(shè)置 5 個復(fù)孔，待細(xì)胞培養(yǎng) 0 、24、48、72 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在酶標(biāo)儀選擇450 nm 波長，測定并記錄各孔吸光度值（OD），實驗重復(fù)3 次，求平均值，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.5

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?采用TargetScan預(yù)測HMGB1 可能是miR-338-3p 的靶基因。分別將含有與 miR-338-3p 結(jié)合位點的 HMGB1 3’UTR 片段及突變體插入到pGL3 熒光報告載體基因下游，分別記為HMGB1-WT（野生型）和HMGB1-Mut（突變型）。將測序鑒定正確的HMGB1-WT 和HMGB1-Mut 質(zhì)粒分別與 miR-NC 和 miR-338-3p mimics 共轉(zhuǎn)染 Ishikawa 和 HEC-1B 細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng) 24 h 后，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書步驟進(jìn)行檢測。

1.2.6

Annexin V-FITC/PI 檢測細(xì)胞凋亡 收集上述處理組細(xì)胞，用胰蛋白酶將細(xì)胞消化，取1×10個細(xì)胞，加入 300 μL 的 DMEM 重懸細(xì)胞，加入 5 μL Annexin V-FITC，室溫避光孵育 15 min，加入 5 μL PI 混勻，再補(bǔ)加 200 μL 的 DMEM 后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，重復(fù)3次，求平均值。

1.2.7

Western blotting 檢測HMGBI 蛋白表達(dá) 將上述處理組細(xì)胞用預(yù)冷PBS 洗滌3 遍，加入含有PMSF（100 倍稀釋）的細(xì)胞裂解液，利用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用5% 脫脂奶粉4 ℃過夜封閉，用HMGB1和β-actin的一抗進(jìn)行4 ℃過夜孵育，用辣根過氧化物標(biāo)記山羊抗鼠二抗進(jìn)行37 ℃溫箱孵育，PBST 洗膜3 次，用混好的ECL 化學(xué)發(fā)光液滴加至膜上，化學(xué)發(fā)光成像儀下掃描并拍照，同時以β-actin 為內(nèi)參，對目的蛋白HMGB1做相對定量分析。

2 結(jié)果

2.1 miR

-

338

-

3p 在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中低表達(dá)

RT-qPCR 檢測miR-338-3p 在人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞ESC 及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B 和Ishikawa 的表達(dá)，結(jié)果顯示，與人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞ESC相比，miR-338-3p 在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B 和Ishikawa 中表達(dá)顯著下調(diào)［（1.00±0.10）比（0.51±0.04），（0.46±0.04），

F

=182.114，

P

=0.000；

t

=13.649，

P

=0.000，

t

=15.041，

P

=0.000］。

2.2 過表達(dá)miR

-

338

-

3p 抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡和增加子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對PTX 的敏感性

將miR-338-3p mimics 轉(zhuǎn)染至HEC-1B 和Ishikawa 細(xì)胞中，RT-qPCR 檢測結(jié)果顯示，miR-338-3p 在HEC-1B［（1.00±0.10）比（4.87±0.31），

t

=35.643，

P

=0.000］和Ishikawa［（1.00±0.09）比（6.11±0.43），

t

=34.895，

P

=0.000］細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)；CCK-8 法檢測結(jié)果和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：與miR-NC 組相比，miR-338-3p 組細(xì)胞的增殖能力降低（表1），而細(xì)胞凋 亡 率 顯 著 增 加［HEC-1B ：（10.02±0.86 ） 比（23.10±1.86），

t

=19.149，

P

=0.001；Ishikawa ：（10.01±0.91）比（25.43±2.01），

t

=20.966，

P

=0.000］；不同濃度的PTX 聯(lián)合miR-338-3p 對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖能力的影響：CCK-8 實驗結(jié)果顯示，HEC-1B 和Ishikawa 細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)隨著紫杉醇濃度的增加而逐漸下降，與miR-NC 組相比，miR-338-3p 組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)均明顯下降（HEC-1B：

t

=1.401，

P

=0.925，

t

=1.234，

P

=0.051，

t

=5.152，

P

=0.006，

t

=14.787，

P

=0.004，

t

=14.482 ，

P

=0.004，

t

= 15.614，

P

=0.000，

t

=14.221，

P

=0.003，

t

=0.152，

P

=0.473），（Ishikawa：

t

=1.663，

P

=0.825，

t

=3.35，

P

=0.041，

t

=6.176，

P

=0.012，

t

=7.944，

P

=0.008，

t

=15.013 ，

P

=0.001，

t

=16.063，

P

=0.000，

t

=15.022，

P

=0.001，

t

=0.676，

P

=0.758）。

表1 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活力/（，n=9）

2.3 miR

-

338

-

3p 的

靶

基

因

HMGB1

RT-qPCR 檢測HMGB1 表達(dá)，與人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞ESC相比，HMGB1 在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B 和ishikawa 中表達(dá)上調(diào)［（1.00±0.10）比（4.31±0.32）、（3.24±0.26），

F

=64.240，

P

=0.000］；生物學(xué)在線預(yù)測分析軟件 Targetscan 預(yù) 測 到 miR-338-3p 與 HMGB1 的 3’UTR 存在結(jié)合位點（圖1A）；雙熒光素報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-338-3p 與HMGB1 之間的靶向關(guān)系，結(jié)果顯示：miR-338-3p 能顯著降低野生型HMGB1-3’UTR WT 的 熒 光 活 性［HEC-1B：（1.00±0.11 ） 比（0.44±0.03），

t

=17.709，

P

=0.000；ishikawa：（1.00±0.11）比（0.47±0.04），

t

=13.584，

P

=0.000］，但卻不影響 HMGB1-3’UTR MUT 的熒光活性［HEC-1B：（1.00±0.12）比（1.01±0.10），

t

=0.212，

P

=0.835；ishikawa：（1.00±0.12 ） 比（1.01±0.10），

t

=0.192，

P

=0.850］；Western blotting 檢測結(jié)果顯示，與 miR-NC組相比，過表達(dá)miR-338-3p 可顯著降低HMGB1 在HEC-1B［（1.00±0.10）比（0.44±0.03），

t

=16.091，

P

=0.000］和 ishikawa［（1.02±0.11）比（0.47±0.04），

t

=14.097，

P

=0.000］細(xì)胞中的表達(dá)（圖1B）。

圖1 miR-338-3p與HMGB1之間的靶向關(guān)系驗證：A為miR-338-3p與HMGB1的3’UTR存在結(jié)合位點；B為過表達(dá)miR-338-3p對HMGB1表達(dá)的影響

2.4 敲低HMGB1 抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡和增加子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對PTX 的敏感性

將si-HMGB1 轉(zhuǎn)染至 HEC-1B 和 ishikawa 細(xì)胞，Western blotting 結(jié)果顯示，與 si-NC 組相比，si-HMGB1 組細(xì)胞中HMGB1 表達(dá)顯著降低［HEC-1B：（1.00±0.10）比（0.44±0.03），

t

=16.091，

P

=0.000；ishikawa：（1.00±0.09）比（0.48±0.04），

t

=15.839，

P

=0.000］；CCK-8法檢測結(jié)果和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：與si-NC 組相比，si-HMGB1 組細(xì)胞的增殖能力降低（表2），而細(xì)胞 凋 亡 率 顯 著 增 加［HEC-1B：（10.02±0.91 ） 比（24.30±1.96），

t

=19.825，

P

=0.000，ishikawa：（10.01±1.01）比（22.72±1.76），

t

=18.791，

P

=0.000］；不同濃度的PTX 聯(lián)合si-HMGB1 對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖能力的影響：CCK-8 實驗結(jié)果顯示，HEC-1B 和Ishikawa 細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)隨著紫杉醇濃度的增加而逐漸下降，與si-NC組相比，si-HMGB1組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)均明顯下降（HEC-1B：

t

=1.332，

P

=0.657，

t

=1.742，

P

=0.146，

t

=5.243，

P

=0.024，

t

=5.342，

P

=0.011，

t

=14.522，

P

=0.000，

t

=16.162，

P

=0.001，

t

=13.594，

P

=0.001，

t

=0.152，

P

=0.421；Ishikawa：

t

=1.356，

P

=0.745，

t

=3.321，

P

=0.086，

t

=6.313，

P

=0.016，

t

=8.224，

P

=0.016，

t

=15.175，

P

=0.000，

t

=16.394，

P

=0.000，

t

=14.943，

P

=0.001，

t

=0.974，

P

=0.343）。

表2 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活力/（，n=9）

2.5 HMGB1 部分逆轉(zhuǎn)miR

-

338

-

3p 對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、凋亡及對PTX 敏感性的影響

將miR-338-3p 和 pcDNA3.0HMGB1 共 轉(zhuǎn) 染 至 HEC-1B 和ishikawa 細(xì)胞，與 miR-338-3p 組相比，miR-338-3p+HMGB1 組細(xì)胞增殖能力升高（表3），細(xì)胞凋亡率降低（表4）；不同濃度的PTX 聯(lián)合pcDNA3.0 HMGB1和miR-338-3p mimics 對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖能力的影響：CCK-8 實驗結(jié)果顯示，HEC-1B 和 Ishikawa細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)隨著紫杉醇濃度的增加而逐漸下降，與miR-338-3p組相比，miR-338-3p+HMGB1組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)升高（HEC-1B：

F

=1.021，

P

=0.6425，

F

=0.493，

P

=0.326，

F

=22.943，

P

=0.000，

F

=42.070，

P

=0.000，

F

=85.374，

P

=0.000，

F

=188.411，

P

=0.000，

F

=90.020，

P

=0.000，

F

=0.682，

P

=0.216；ishikawa ：

F

=1.011，

P

=0.689，

F

=0.301，

P

=0.281，

F

=19.020，

P

=0.000，

F

=35.882，

P

=0.000，

F

=83.360，

P

=0.000，

F

=243.824，

P

=0.000，

F

=127.017，

P

=0.000，

F

=0.694，

P

=0.846）。

表3 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活力/（，n=9）

表4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡/（，n=9）

3 討論

MiRNAs 是 一類長度 約為 19 至 23 個 nt 的 高 度保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，能夠通過與靶基因的mRNA 的3’UTR 不完全互補(bǔ)配對進(jìn)而影響mRNA 的降解或抑制其翻譯。研究表明有多種miRNAs 通過調(diào)控子宮內(nèi)膜癌的增殖，遷移侵襲和凋亡等種生物學(xué)過程，參與癌癥的發(fā)生發(fā)展。miR-338-3p 在多種癌癥中發(fā)揮多種調(diào)控作用，如Ju等發(fā)現(xiàn) miR-338-3p 可抑制胃癌細(xì)胞的發(fā)展，Peng等發(fā)現(xiàn)miR-338-3p 可通過IRS2 抑制非小細(xì)胞肺癌的增殖和侵襲，但 miR-338-3p 在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的研究較少。本研究以人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B和ishikawa為研究對象，RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞ESC 相比，miR-338-3p 在HEC-1B 和ishikawa 細(xì)胞中的表達(dá)顯著下調(diào)，提示我們miR-338-3p 可能在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。后續(xù)研究中在HEC-1B 和ishikawa 細(xì)胞中過表達(dá)miR-338-3p，檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-338-3p 可抑制 HEC-1B 和 ishikawa 細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，提示miR-338-3p 可能成為子宮內(nèi)膜癌潛在的治療靶點。PTX 是一種來自紫衫樹皮的提取物，通過影響腫瘤細(xì)胞的有絲分裂和細(xì)胞周期發(fā)揮作用，是臨床一線抗腫瘤藥物，不斷有研究表明PTX 可聯(lián)合其它化療藥物抑制子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展。在本研究中，首先檢測了不同濃度的PTX 聯(lián)合miR-338-3p對HEC-1B和ishikawa細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果與前人研究一致，隨著 PTX 的提高，HEC-1B 和 ishikawa 細(xì)胞的增殖能力降低，表明PTX 可抑制HEC-1B 和ishikawa 細(xì)胞的增殖，同時，與 miR-NC 組相比，miR-338-3p 組的細(xì)胞增殖能力降低，表明過表達(dá)miR-338-3p 可增加 HEC-1B 和 ishikawa 細(xì)胞對 PTX 的敏感性。

有研究表明HMGB1 參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程。本研究首先檢測了HMGB1在HEC-1B和ishikawa 細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與人正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞 ESC 相比，HMGB1 在 HEC-1B 和 ishikawa 細(xì)胞中的表達(dá)顯著上調(diào)，提示我們HMGB1 可能在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。而HMGB1 對其他癌癥的影響前人早有報道，如miR34a可靶向HMGB1抑制人宮頸癌和結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，HMGB1 促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡。這些數(shù)據(jù)表明HMGB1在多種癌癥中可能扮演著促癌基因的角色。為了驗證miR-338-3p 是否可靶向HMGB1 參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展以及其對PTX 的敏感性，本研究通過生物信息學(xué)在線分析軟件預(yù)測到HMGB1 的3’UTR與miR-338-3p 存在結(jié)合位點，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實HMGB1 是miR-338-3p 的靶基因，且過表達(dá)miR-338-3p 可抑制HMGB1 表達(dá)，表明miR-338-3p 可靶向并負(fù)性調(diào)節(jié)HMGB1 表達(dá)。后續(xù)研究中在HEC-1B 和 ishikawa 細(xì) 胞 中 敲 低 HMGB1，敲 低HMGB1 可抑制 HEC-1B 和 ishikawa 細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，同時增加HEC-1B和ishikawa細(xì)胞對PTX的敏感性，與過表達(dá)miR-338-3p結(jié)果相一致。HMGB1和miR-338-3p共轉(zhuǎn)染至HEC-1B和ishikawa細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HMGB1 可部分逆轉(zhuǎn)miR-338-3p 對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖，凋亡以及對PTX敏感性的影響。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-338-3p 靶向HMGB1可促進(jìn)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B和ishikawa凋亡、抑制增殖，同時增加其對PTX 的敏感性，為臨床上miR-338-3p 聯(lián)合PTX 治療人子宮內(nèi)膜癌提供了理論依據(jù)。