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        微小RNA361-5p在肺結(jié)核病人血清中水平及意義

        2021-07-28 01:00:52賈宗嶺單富強(qiáng)葛國(guó)昌趙幸娜
        安徽醫(yī)藥 2021年8期
        關(guān)鍵詞:肺結(jié)核病生物科技肺結(jié)核

        賈宗嶺,單富強(qiáng),葛國(guó)昌,趙幸娜

        肺結(jié)核是臨床常見(jiàn)的由結(jié)核分枝桿菌導(dǎo)致的嚴(yán)重傳染性疾病,其發(fā)病率和病死率極高,給病人心理及生理帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。肺結(jié)核發(fā)病除與肺部感染結(jié)核菌有關(guān)外,還與表達(dá)異常的微小RNA(microRNA,miRNA)和炎癥因子密切相關(guān)。miR-140在肺結(jié)核病人外周血中表達(dá)異常,其可能通過(guò)調(diào)節(jié)促炎因子水平參與并影響肺結(jié)核發(fā)病進(jìn)展。miR-361-5p 在肺結(jié)核病人血漿中呈高表達(dá),可作為肺結(jié)核診斷的有效標(biāo)志物。此外,結(jié)核分枝桿菌入侵人體時(shí),機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量炎癥反應(yīng)相關(guān)因子,其水平可一定程度用于篩查肺結(jié)核,炎癥反應(yīng)相關(guān)因可能在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展過(guò)程發(fā)揮重要作用。但微小RNA-361-5p(miRNA-361-5p,miR-361-5p)在肺結(jié)核血清中的表達(dá)水平及意義鮮有研究。本研究通過(guò)初步檢測(cè)miR-361-5p 在肺結(jié)核中血清中的水平,分析miR-361-5p 與炎癥相關(guān)因子的關(guān)系,以期為診治肺結(jié)核提供依據(jù)。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        選取 2017 年 3 月至 2019 年 1 月開(kāi)封市結(jié)核病防治所診治的肺結(jié)核病人136例進(jìn)行研究(肺結(jié)核組),男 76 例,女 60 例;年齡(44.01±10.52)歲,年齡范圍為 31~57 歲;體質(zhì)量指數(shù)(BMI)(20.84±2.87)kg/m,BMI 范圍為 17.01~24.86 kg/m。并以同期本院體檢正常者142 例進(jìn)行對(duì)照研究(健康對(duì)照組),男 78 例,女 64 例;年齡(43.94±10.47)歲,年齡范圍為29~56歲;BMI為(21.08±2.93)kg/m,BMI 范圍為 17.25~25.09 kg/m。兩組年齡、性別、BMI比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

        P

        >0.05)。

        納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《肺結(jié)核診斷和治療指南》中肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)者;(2)病歷資料齊全者;(3)病人本人自愿參該項(xiàng)研究,并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并糖尿病、心肝腎功能異常、肺癌者;(2)合并過(guò)敏體質(zhì)者或妊娠、哺乳期女性;(3)合并精神類障礙或其他免疫、慢性疾病者;(4)近期使用糖皮質(zhì)激素、抗感染、免疫等影響炎癥反應(yīng)藥物者。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

        1.2 方法

        1.2.1

        樣本收集 采集肺結(jié)核病人入院第二日及體檢正常者清晨空腹肘靜脈血約5~6 mL,室溫下靜置約30 min,以3 500 r/min 離心 5 min,收集上清,分裝于1.5 mL EP 管中,密封,儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中,備用。

        1.2.2

        實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)血清中miR-361-5p 表達(dá)水平 取出-80 ℃中適量血清樣本,無(wú)菌環(huán)境下,冰上解凍,按TRIzol 法提取總RNA,具體操作按TRIzol試劑(BYX1617P,常州貝源鑫生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以紫外分光光度計(jì)(Nano EX,澤尼薩爾有限公司)檢測(cè)RNA 濃度、純度,并驗(yàn)其完整性。根據(jù)miScript Reverse Transcription Kit(218061,上海北諾生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)將RNA 逆錄成cDNA。利用TaqMan? Fast Advanced Master Mix(4444557,杭州沃森生物技術(shù)有限公司)及PCR 儀(Rotor-Gene Q,凱杰企業(yè)管理有限公司)將cDNA 擴(kuò)增,qPCR 檢測(cè)。miR-361-5p以 U6 為內(nèi)參,其應(yīng)引物序列如表 1 所示。以 2法計(jì)算miR-361-5p相對(duì)表達(dá)量。

        表1 miR-361-5p及內(nèi)參U6的引物序列

        1.2.3

        血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ-干擾素(IFN-γ)水平檢測(cè) 從-80 ℃冰箱中取出分裝的血清樣本,室溫下解凍,利用人VEGF 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(貨號(hào):KHG0111,上海研卉生物科技有限公司)、TNF-α ELISA 試劑盒(OSD_H0170,長(zhǎng)沙達(dá)爾鋒生物科技有限公司)、IFN-γ ELISA 試劑盒(BS-E3748H1,廣州徠智生物科技有限公司)按ELISA 法測(cè)定血清VEGF、TNF-α、IFN-γ水平。

        2 結(jié)果

        2.1 兩組血清

        miR

        -

        361

        -

        5p、VEGF、TNF

        、IFN

        水平比較

        與健康對(duì)照組相比,肺結(jié)核組組病人血清 miR-361-5p、VEGF、TNF-α 水 平 較 高(均

        P

        <0.05),IFN-γ水平明顯較低(

        P

        <0.05)。見(jiàn)表2。

        表2 兩組血清miR-361-5p、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ-干擾素(IFN-γ)水平比較/

        2.2 肺結(jié)核病人血清miR

        -

        361

        -

        5p 水平與VEGF、TNF

        、IFN

        關(guān)系

        Pearson 法相關(guān)性分析顯示,肺結(jié)核病人血清 miR-361-5p 與 VEGF、TNF-α 水平呈正相關(guān)(

        r

        =0.585、0.539,

        P

        均<0.05),與IFN-γ 水平呈負(fù)相關(guān)(

        r

        =0.485,

        P

        <0.05)。

        2.3 影響肺結(jié)核的Logistic回歸分析

        以miR-361-5p、VEGF、TNF-α、IFN-γ水平為自變量,以肺結(jié)核是否發(fā)生為因變量,行Logistic 回歸分析,結(jié)果顯示miR-361-5p、VEGF、TNF-α 是影響肺結(jié)核發(fā)生的危險(xiǎn)因素(均

        P

        <0.05),IFN-γ 是影響肺結(jié)核發(fā)生的保護(hù)因素(

        P

        <0.05)。見(jiàn)表3。

        表3 Logistic回歸分析肺結(jié)核發(fā)生的影響因素

        2.4 血清miR

        -

        361

        -

        5p 對(duì)肺結(jié)核的診斷價(jià)值

        ROC曲線顯示,血清miR-361-5p 水平對(duì)肺結(jié)核發(fā)生診斷的曲線下面積(Area Under Curve,AUC)為 0.898(95%

        CI

        :0.860~0.936),截?cái)嘀禐?.44,其靈敏度、特異度分別為83.82%、88.03%。見(jiàn)圖1。

        圖1 血清miR-361-5p表達(dá)水平預(yù)測(cè)肺結(jié)核發(fā)生的ROC曲線

        3 討論

        肺結(jié)核是一種傳染性較強(qiáng)的肺部感染疾病,以乏力、午后低熱、盜汗、咯血為主要臨床癥狀,可導(dǎo)致肺癌。因此,尋找可高效診治肺結(jié)核的指標(biāo),對(duì)提高肺結(jié)核病人生活和生存質(zhì)量極具重要意義。

        miRNA 是廣泛分布于人體外周血的非編碼小RNA,可參與調(diào)控新陳代謝、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等過(guò)程,與肺炎、肺結(jié)核、肺纖維化、肺癌等肺部損傷類疾病。miR-133a 在肺纖維化中表達(dá)失調(diào),其可能參與并影響肺纖維化發(fā)展進(jìn)程,miR-133a 有望成為治療肺纖維化的靶標(biāo)。miR-423-5p 在肺結(jié)核病人血清中表達(dá)上調(diào),其可通過(guò)調(diào)節(jié)自噬小體-溶酶體融合,進(jìn)而在肺結(jié)核中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用,可作為肺結(jié)核診斷的有效指標(biāo)。miR-130b 在肺癌中呈高表達(dá),其可能參與肺癌發(fā)生發(fā)展,miR-130b 具有診斷肺癌的潛在價(jià)值。此外,Ndzi 等研究發(fā)現(xiàn)miR-361-5p 在肺結(jié)核中表達(dá)異常,其有望成為診斷肺結(jié)核的生物指標(biāo)。miR-361-5p 在肺癌中異常表達(dá),其可能在非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展中起一定調(diào)控作用,且可作為非小細(xì)胞肺癌預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。本研究中肺結(jié)核組病人血清miR-361-5p 水平明顯高于健康對(duì)照組,提示miR-361-5p 可能在肺結(jié)核發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中起一定作用。

        肺結(jié)核發(fā)展過(guò)程與免疫細(xì)胞分泌的多種炎癥相關(guān)因子有關(guān)。其中,VEGF 是機(jī)體內(nèi)促血管生長(zhǎng)的重要因子,可由肺單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌,影響結(jié)核結(jié)節(jié)、干酪樣壞死,與多種炎性疾病緊密相關(guān)。TNF-α 是多功能細(xì)胞因子,可與巨噬細(xì)胞一起抵抗結(jié)核桿菌的感染,對(duì)機(jī)體釋放其他抵抗結(jié)核細(xì)胞因子具有關(guān)鍵作用。此外,IFN-γ 可激活免疫細(xì)胞,在抗結(jié)核過(guò)程發(fā)揮重要作用,肺結(jié)核病人血清中TNF-α、VEGF 水平升高,IFN-γ 水平降低;經(jīng)結(jié)核藥聯(lián)合利福噴丁治療后,TNF-α、VEGF 水平降低,IFN-γ 水平升高,TNF-α、VEGF、IFN-γ 均可能參與且影響肺結(jié)核發(fā)病進(jìn)展。本研究中肺結(jié)核組病人血清VEGF、TNF-α 水平均明顯高于健康對(duì)照組,IFN-γ 水平明顯低于健康對(duì)照組,提示炎癥相關(guān)因子TNF-α、VEGF、IFN-γ可能在肺結(jié)核發(fā)病過(guò)程中起一定作用。

        miR-361-5p 在冠心病中可調(diào)節(jié)VEGF 表達(dá),這種調(diào)節(jié)方式適用于血管新生、缺血性相關(guān)疾病。本研究中肺結(jié)核病人血清miR-361-5p 與VEGF、TNF-α 水平呈正相關(guān),與 IFN-γ 水平呈負(fù)相關(guān),提示miR-361-5p可能與VEGF、TNF-α、IFN-γ等炎癥相關(guān)因子相互作用,共同影響肺結(jié)核發(fā)生與發(fā)展。本研究顯示,miR-361-5p、VEGF、TNF-α 是影響肺結(jié)核發(fā)生的危險(xiǎn)因素,IFN-γ 是影響肺結(jié)核發(fā)生的保護(hù)因素,提示miR-361-5p、VEGF、TNF-α 水平升高、IFN-γ水平降低,均可能使肺結(jié)核患病風(fēng)險(xiǎn)升高,及時(shí)監(jiān)測(cè)miR-361-5p、VEGF、TNF-α、IFN-γ 水平有利于及早診治肺結(jié)核。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),血清miR-361-5p水平對(duì)肺結(jié)核發(fā)生診斷的AUC 為0.898,當(dāng)血清miR-361-5p 相對(duì)表達(dá)量高于1.44 時(shí),肺結(jié)核發(fā)病幾率增加,提示血清miR-361-5p 對(duì)肺結(jié)核有較高診斷價(jià)值。

        綜上所述,肺結(jié)核病人血清miR-361-5p 表達(dá)上調(diào),miR-361-5p 與炎癥相關(guān)因子具有一定相關(guān)性,其可能與炎癥因子共同影響肺結(jié)核疾病病變過(guò)程。本研究存在樣本較少,可能引起實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)誤差,此外,本研究未比較miR-361-5p與VEGF、TNF-α、IFN-γ 及各項(xiàng)聯(lián)合診斷肺結(jié)核的價(jià)值,后續(xù)將擴(kuò)大樣本比較上述各指標(biāo)診斷肺結(jié)核的價(jià)值及其與肺結(jié)核類型的關(guān)系。

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