賈宗嶺，單富強(qiáng)，葛國(guó)昌，趙幸娜

肺結(jié)核是臨床常見(jiàn)的由結(jié)核分枝桿菌導(dǎo)致的嚴(yán)重傳染性疾病，其發(fā)病率和病死率極高，給病人心理及生理帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。肺結(jié)核發(fā)病除與肺部感染結(jié)核菌有關(guān)外，還與表達(dá)異常的微小RNA（microRNA，miRNA）和炎癥因子密切相關(guān)。miR-140在肺結(jié)核病人外周血中表達(dá)異常，其可能通過(guò)調(diào)節(jié)促炎因子水平參與并影響肺結(jié)核發(fā)病進(jìn)展。miR-361-5p 在肺結(jié)核病人血漿中呈高表達(dá)，可作為肺結(jié)核診斷的有效標(biāo)志物。此外，結(jié)核分枝桿菌入侵人體時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量炎癥反應(yīng)相關(guān)因子，其水平可一定程度用于篩查肺結(jié)核，炎癥反應(yīng)相關(guān)因可能在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展過(guò)程發(fā)揮重要作用。但微小RNA-361-5p（miRNA-361-5p，miR-361-5p）在肺結(jié)核血清中的表達(dá)水平及意義鮮有研究。本研究通過(guò)初步檢測(cè)miR-361-5p 在肺結(jié)核中血清中的水平，分析miR-361-5p 與炎癥相關(guān)因子的關(guān)系，以期為診治肺結(jié)核提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取 2017 年 3 月至 2019 年 1 月開(kāi)封市結(jié)核病防治所診治的肺結(jié)核病人136例進(jìn)行研究（肺結(jié)核組），男 76 例，女 60 例；年齡（44.01±10.52）歲，年齡范圍為 31～57 歲；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）（20.84±2.87）kg/m，BMI 范圍為 17.01～24.86 kg/m。并以同期本院體檢正常者142 例進(jìn)行對(duì)照研究（健康對(duì)照組），男 78 例，女 64 例；年齡（43.94±10.47）歲，年齡范圍為29～56歲；BMI為（21.08±2.93）kg/m，BMI 范圍為 17.25～25.09 kg/m。兩組年齡、性別、BMI比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《肺結(jié)核診斷和治療指南》中肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)者；（2）病歷資料齊全者；（3）病人本人自愿參該項(xiàng)研究，并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并糖尿病、心肝腎功能異常、肺癌者；（2）合并過(guò)敏體質(zhì)者或妊娠、哺乳期女性；（3）合并精神類障礙或其他免疫、慢性疾病者；（4）近期使用糖皮質(zhì)激素、抗感染、免疫等影響炎癥反應(yīng)藥物者。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法

1.2.1

樣本收集 采集肺結(jié)核病人入院第二日及體檢正常者清晨空腹肘靜脈血約5～6 mL，室溫下靜置約30 min，以3 500 r/min 離心 5 min，收集上清，分裝于1.5 mL EP 管中，密封，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中，備用。

1.2.2

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測(cè)血清中miR-361-5p 表達(dá)水平 取出-80 ℃中適量血清樣本，無(wú)菌環(huán)境下，冰上解凍，按TRIzol 法提取總RNA，具體操作按TRIzol試劑（BYX1617P，常州貝源鑫生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以紫外分光光度計(jì)（Nano EX，澤尼薩爾有限公司）檢測(cè)RNA 濃度、純度，并驗(yàn)其完整性。根據(jù)miScript Reverse Transcription Kit（218061，上海北諾生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)將RNA 逆錄成cDNA。利用TaqMan? Fast Advanced Master Mix（4444557，杭州沃森生物技術(shù)有限公司）及PCR 儀（Rotor-Gene Q，凱杰企業(yè)管理有限公司）將cDNA 擴(kuò)增，qPCR 檢測(cè)。miR-361-5p以 U6 為內(nèi)參，其應(yīng)引物序列如表 1 所示。以 2法計(jì)算miR-361-5p相對(duì)表達(dá)量。

表1 miR-361-5p及內(nèi)參U6的引物序列

1.2.3

血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、γ-干擾素（IFN-γ）水平檢測(cè) 從-80 ℃冰箱中取出分裝的血清樣本，室溫下解凍，利用人VEGF 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（貨號(hào)：KHG0111，上海研卉生物科技有限公司）、TNF-α ELISA 試劑盒（OSD_H0170，長(zhǎng)沙達(dá)爾鋒生物科技有限公司）、IFN-γ ELISA 試劑盒（BS-E3748H1，廣州徠智生物科技有限公司）按ELISA 法測(cè)定血清VEGF、TNF-α、IFN-γ水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清

miR

-

361

-

5p、VEGF、TNF

-α

、IFN

-γ

水平比較

與健康對(duì)照組相比，肺結(jié)核組組病人血清 miR-361-5p、VEGF、TNF-α 水 平 較 高（均

P

＜0.05），IFN-γ水平明顯較低（

P

＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組血清miR-361-5p、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、γ-干擾素（IFN-γ）水平比較/

2.2 肺結(jié)核病人血清miR

-

361

-

5p 水平與VEGF、TNF

-α

、IFN

-γ

關(guān)系

Pearson 法相關(guān)性分析顯示，肺結(jié)核病人血清 miR-361-5p 與 VEGF、TNF-α 水平呈正相關(guān)（

r

=0.585、0.539，

P

均＜0.05），與IFN-γ 水平呈負(fù)相關(guān)（

r

=0.485，

P

＜0.05）。

2.3 影響肺結(jié)核的Logistic回歸分析

以miR-361-5p、VEGF、TNF-α、IFN-γ水平為自變量，以肺結(jié)核是否發(fā)生為因變量，行Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示miR-361-5p、VEGF、TNF-α 是影響肺結(jié)核發(fā)生的危險(xiǎn)因素（均

P

＜0.05），IFN-γ 是影響肺結(jié)核發(fā)生的保護(hù)因素（

P

＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 Logistic回歸分析肺結(jié)核發(fā)生的影響因素

2.4 血清miR

-

361

-

5p 對(duì)肺結(jié)核的診斷價(jià)值

ROC曲線顯示，血清miR-361-5p 水平對(duì)肺結(jié)核發(fā)生診斷的曲線下面積（Area Under Curve，AUC）為 0.898（95%

CI

：0.860～0.936），截?cái)嘀禐?.44，其靈敏度、特異度分別為83.82%、88.03%。見(jiàn)圖1。

圖1 血清miR-361-5p表達(dá)水平預(yù)測(cè)肺結(jié)核發(fā)生的ROC曲線

3 討論

肺結(jié)核是一種傳染性較強(qiáng)的肺部感染疾病，以乏力、午后低熱、盜汗、咯血為主要臨床癥狀，可導(dǎo)致肺癌。因此，尋找可高效診治肺結(jié)核的指標(biāo)，對(duì)提高肺結(jié)核病人生活和生存質(zhì)量極具重要意義。

miRNA 是廣泛分布于人體外周血的非編碼小RNA，可參與調(diào)控新陳代謝、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等過(guò)程，與肺炎、肺結(jié)核、肺纖維化、肺癌等肺部損傷類疾病。miR-133a 在肺纖維化中表達(dá)失調(diào)，其可能參與并影響肺纖維化發(fā)展進(jìn)程，miR-133a 有望成為治療肺纖維化的靶標(biāo)。miR-423-5p 在肺結(jié)核病人血清中表達(dá)上調(diào)，其可通過(guò)調(diào)節(jié)自噬小體-溶酶體融合，進(jìn)而在肺結(jié)核中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，可作為肺結(jié)核診斷的有效指標(biāo)。miR-130b 在肺癌中呈高表達(dá)，其可能參與肺癌發(fā)生發(fā)展，miR-130b 具有診斷肺癌的潛在價(jià)值。此外，Ndzi 等研究發(fā)現(xiàn)miR-361-5p 在肺結(jié)核中表達(dá)異常，其有望成為診斷肺結(jié)核的生物指標(biāo)。miR-361-5p 在肺癌中異常表達(dá)，其可能在非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展中起一定調(diào)控作用，且可作為非小細(xì)胞肺癌預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。本研究中肺結(jié)核組病人血清miR-361-5p 水平明顯高于健康對(duì)照組，提示miR-361-5p 可能在肺結(jié)核發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中起一定作用。

肺結(jié)核發(fā)展過(guò)程與免疫細(xì)胞分泌的多種炎癥相關(guān)因子有關(guān)。其中，VEGF 是機(jī)體內(nèi)促血管生長(zhǎng)的重要因子，可由肺單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌，影響結(jié)核結(jié)節(jié)、干酪樣壞死，與多種炎性疾病緊密相關(guān)。TNF-α 是多功能細(xì)胞因子，可與巨噬細(xì)胞一起抵抗結(jié)核桿菌的感染，對(duì)機(jī)體釋放其他抵抗結(jié)核細(xì)胞因子具有關(guān)鍵作用。此外，IFN-γ 可激活免疫細(xì)胞，在抗結(jié)核過(guò)程發(fā)揮重要作用，肺結(jié)核病人血清中TNF-α、VEGF 水平升高，IFN-γ 水平降低；經(jīng)結(jié)核藥聯(lián)合利福噴丁治療后，TNF-α、VEGF 水平降低，IFN-γ 水平升高，TNF-α、VEGF、IFN-γ 均可能參與且影響肺結(jié)核發(fā)病進(jìn)展。本研究中肺結(jié)核組病人血清VEGF、TNF-α 水平均明顯高于健康對(duì)照組，IFN-γ 水平明顯低于健康對(duì)照組，提示炎癥相關(guān)因子TNF-α、VEGF、IFN-γ可能在肺結(jié)核發(fā)病過(guò)程中起一定作用。

miR-361-5p 在冠心病中可調(diào)節(jié)VEGF 表達(dá)，這種調(diào)節(jié)方式適用于血管新生、缺血性相關(guān)疾病。本研究中肺結(jié)核病人血清miR-361-5p 與VEGF、TNF-α 水平呈正相關(guān)，與 IFN-γ 水平呈負(fù)相關(guān)，提示miR-361-5p可能與VEGF、TNF-α、IFN-γ等炎癥相關(guān)因子相互作用，共同影響肺結(jié)核發(fā)生與發(fā)展。本研究顯示，miR-361-5p、VEGF、TNF-α 是影響肺結(jié)核發(fā)生的危險(xiǎn)因素，IFN-γ 是影響肺結(jié)核發(fā)生的保護(hù)因素，提示miR-361-5p、VEGF、TNF-α 水平升高、IFN-γ水平降低，均可能使肺結(jié)核患病風(fēng)險(xiǎn)升高，及時(shí)監(jiān)測(cè)miR-361-5p、VEGF、TNF-α、IFN-γ 水平有利于及早診治肺結(jié)核。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-361-5p水平對(duì)肺結(jié)核發(fā)生診斷的AUC 為0.898，當(dāng)血清miR-361-5p 相對(duì)表達(dá)量高于1.44 時(shí)，肺結(jié)核發(fā)病幾率增加，提示血清miR-361-5p 對(duì)肺結(jié)核有較高診斷價(jià)值。

綜上所述，肺結(jié)核病人血清miR-361-5p 表達(dá)上調(diào)，miR-361-5p 與炎癥相關(guān)因子具有一定相關(guān)性，其可能與炎癥因子共同影響肺結(jié)核疾病病變過(guò)程。本研究存在樣本較少，可能引起實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)誤差，此外，本研究未比較miR-361-5p與VEGF、TNF-α、IFN-γ 及各項(xiàng)聯(lián)合診斷肺結(jié)核的價(jià)值，后續(xù)將擴(kuò)大樣本比較上述各指標(biāo)診斷肺結(jié)核的價(jià)值及其與肺結(jié)核類型的關(guān)系。