楊隆良，馬瑜，郭虎林

肝癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康，對于不適合手術切除的晚期肝癌病人，分子靶向藥物的出現(xiàn)為肝癌的治療提供了新的選擇。研究表明，lncRNA 參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后，與肝癌也密切相關。LINC00858在結直腸癌組織和細胞系中均上調表達，LINC00858高表達與晚期臨床進展和不良預后顯著相關；敲低LINC00858可抑制結直腸癌細胞的增殖，遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。LINC00858 在骨肉瘤組織和細胞系中也顯著上調表達，沉默LINC00858 對骨肉瘤細胞的體外增殖、侵襲能力和體內腫瘤生長均有抑制作用。然而LINC00858 在肝癌中的表達及其對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響和機制尚不清楚。研究顯示，肝癌中miR-363-3 的低表達與腫瘤大小、淋巴結轉移和靜脈浸潤有關；miR-363-3p 的上調抑制了肝癌細胞的增殖，遷移和侵襲。miR-363-3p 過表達抑制肺癌細胞的遷移和侵襲。敲低 lncRNA MALAT1 可通過上調miR-363-3p 調 節(jié) EZH2 抑 制 結 直 腸 癌 發(fā) 展。 但LINC00858 在肝癌中的作用及其機制是否與miR-363-3p 有關還尚未可知。因此，本研究分析了LINC00858 對肝癌細胞生物學行為的影響，并以miR-363-3p為切入點分析其抗腫瘤機制。

1 材料與方法

1.1 臨床標本

選取 2017 年 1 月至 2019 年 1 月青海省第五人民醫(yī)院收治的肝癌病人30例，獲取其肝癌組織及其癌旁組織。病人術前未進行過放化療，所有病人均知情且同意。癌旁組織為距離癌組織邊緣2～5 cm處組織。

1.2 細胞與主要試劑

肝癌細胞株HCCLM3 購自南京森貝伽生物科技有限公司。qRT-PCR 試劑盒、反轉錄試劑盒、Trizol 試劑購自日本Takara 公司；CCK-8 試劑盒購自杭州仟諾生物科技有限公司；Matrigel膠、Transwell小室購自上海恒斐生物科技有限公司；雙熒光素酶報告檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；二辛可寧酸（BCA）試劑盒、RIPA蛋白裂解液購自上海羽朵生物科技有限公司；CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9 單抗、GAPDH 抗體及山羊抗兔IgG-HRP購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng)與分組

在95%濕度、5%二氧化碳、37 ℃環(huán)境條件下，用含 10%FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)肝癌HCCLM3 細胞，取對數(shù)生長期HCCLM3 細胞 ，將 pcDNA、pcDNA-LINC00858、si-NC、si-LINC00858 轉 染 至 HCCLM3 中 ，記 為 pcDNA 組 、pcDNA-LINC00858 組、si-NC 組、si-LINC00858 組；將si-LINC00858 與 anti-miR-NC 共轉染至 HCCLM3 中，記為 si-LINC00858+anti-miR-NC 組，將 si-LINC00858與anti-miR-363-3p 共轉染至HCCLM3 中，記為si-LINC00858+anti-miR-363-3p組。

1.4 RT

-

qPCR 檢

測

LINC00858 和

miR

-

363

-

3p 表達水平

提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，LINC00858、miR-363-3p 分別以GAPDH、U6 為內參，相對表達量用 2法計算。LINC00858 正向引物序列：5'-CCCAGCTCCTTACACACGTT-3'，反向引物序列：5'-TTCAGAGGCCTGCATCACTG-3'；miR-363-3p 正向引物序列：5'-CGAATTGCACGGTATCCATCT-3'，反向引物序列：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；GAPDH 正 向 引 物 序 列 ：5'-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3'，反向引物序列：5'-ACCAAATCCGTTGACTCCGA-3'；U6正向引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.5 雙熒光素酶報告實驗

構建LINC00858 野生型和突變型報告基因載體，并分別轉染miR-NC 和miR-363-3p，48 h后，檢測熒光素酶活性。

1.6 CCK

-

8 檢測細胞增殖活性

以1×10個/孔接種 HCCLM3 細胞于 96 孔板。37 ℃分別培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加入 10 μLCCK-8 試劑，檢測各組細胞在490 nm處的OD值。

1.7 Transwell 檢測細胞遷移和侵襲

遷移檢測：Transwell上室中加入200 μL細胞懸液，下室加入600 μL DMEM 培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。細胞侵襲實驗：取100 μL用DMEM培養(yǎng)液稀釋的Matrigel加到Transwell上室，凝固后，加200 μL細胞懸液于上室，培養(yǎng)24 h。擦去上室表面細胞，4%多聚甲醛固定穿膜細胞30 min，0.1%結晶紫染色30 min。于顯微鏡下計數(shù)。

1.8 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測蛋白表達

提取細胞總蛋白，進行蛋白定量。取等量變性蛋白行SDS-PAGE 電泳，并轉至PVDF 膜，25 ℃下用5%脫脂奶粉封閉1 h，按1∶1 000 稀釋一抗4 ℃孵育過夜，按1∶2 000 稀釋二抗25 ℃孵育1.5 h，顯影，定影后，Quantity One軟件分析上述蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 LINC00858 和miR

-

363

-

3p 在肝癌組織中的表達

肝癌組織中LINC00858 和miR-363-3p 分別高表達和低表達（

P

＜0.05）。見表1。

表1 LINC00858和miR-363-3p在肝癌組織中的表達/

2.2 LINC00858 靶向調控miR

-

363

-

3p 的表達

如圖 1 所示，Starbase 預測到 LINC00858 與 miR-363-3p存在互補核苷酸序列。如表2 所示，熒光素酶報告實驗顯示，與共轉染W(wǎng)T-LINC00858 和miR-NC 相比，共轉染W(wǎng)T-LINC00858 和miR-363-3p 的熒光素酶活性顯著降低（

P

＜0.05）。如表3 所示，過表達或抑制LINC0085 分別下調或上調miR-363-3p 的表達（

P

＜0.05）。

表2 熒光素酶活性檢測/

表3 LINC00858調控miR-363-3p的表達/

圖1 LINC00858與miR-363-3p的結合位點

2.3 抑制LINC00858 表達對肝癌HCCLM3 細胞增殖、遷移侵襲的影響

如圖2 和表4 所示，轉染si-LINC00858 后，LINC00858、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 表達水平降低，細胞活性、遷移、侵襲數(shù)降低，p21表達水平升高（

P

＜0.05）。

表4 抑制LINC00858表達對肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移侵襲的影響/（，n=9）

圖2 抑制LINC00858對增殖、遷移侵襲相關蛋白表達的影響

2.4 干擾miR

-

363

-

3p 表達逆轉了抑制LINC00858表達對肝癌HCCLM3 細胞增殖、遷移侵襲的作用

如圖 3 和表 5 所示，si-LINC00858 和 anti-miR-363-3p共轉染后，miR-363-3p、p21 表達水平降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9 表達水平升高，細胞活性、遷移數(shù)、侵襲數(shù)升高（

P

＜0.05）。

表5 干擾miR-363-3p逆轉了抑制LINC00858對肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移侵襲的影響/（，n=9）

圖3 干擾miR-363-3p逆轉了抑制LINC00858增殖、遷移侵襲相關蛋白表達的影響

3 討論

肝癌起病隱匿、進展快，病人在確診時多數(shù)已是晚期，傳統(tǒng)治療預后效果差，靶向藥物治療及聯(lián)合治療已成為新的治療趨勢，也給病人提供新的選擇。研究表明部分異常表達的LncRNA與腫瘤的發(fā)生、增殖、轉移、預后有關，研究LncRNA在肝癌中的作用機制，可為其早期診斷、選擇治療靶點及預后評估提供幫助。研究報道高表達的LINC00858與差分化，晚期TNM 分期和淋巴結轉移相關，LINC00858 外源性過表達促進結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并促進腫瘤生長和血管生成。LINC00858通過調控miR-422a促進非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。LINC00858過表達通過miR-3182/MMP2軸顯著促進肺癌細胞增殖、侵襲。然而 LINC00858 在肝癌中的表達及其對肝癌的影響還尚不清楚，本實驗檢測了肝癌病人組織中LINC00858 的表達水平，結果顯示，肝癌組織中LINC00858表達水平顯著升高，說明LINC00858與肝癌的進展可能相關。本實驗通過轉染si-LINC00858抑制LINC00858表達后HCCLM3細胞活性、遷移數(shù)、侵襲數(shù)降低，表明LINC00858 在肝癌中具有致癌功能。CyclinD1 和p21 是細胞增殖調控的關鍵蛋白，CyclinD1 可結合細胞周期抑制蛋白依賴性激酶（CDK）促進細胞周期轉換發(fā)揮促增殖作用，而 p21 具有相反功能。MMP-2 和 MMP-9 是一種明膠酶，其可破壞基底膜，促進細胞局部和遠處浸潤，是腫瘤細胞侵襲和轉移的主要啟動子。本研究中抑制LINC00858 表達可上調p21 表達，下調CyclinD1、MMP-2和MMP-9表達，與其抗增殖、抗遷移、抗侵襲作用吻合，表明抑制LINC00858 表達是控制肝癌轉移的潛在靶點。

miRNA表達改變與腫瘤細胞的惡性生物學行為有關，研究報道神經膠質瘤組織中miR-3663-3p表達水平升高，miR-3663-3p通過直接靶向丙酮酸脫氫酶B（pyruvate dehydrogenase B，PDHB）促進神經膠質瘤細胞生長和侵襲。miR-363-3p 通過下調 SOX4 表達抑制骨肉瘤細胞增殖和侵襲。miR-363-3p還通過靶向磷酸肌醇-3-激酶催化亞基α（PIK3CA）抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖，遷移和侵襲并誘導細胞凋亡。表明miR-363-3p在多種腫瘤中充當抑癌基因起作用。但miR-363-3p對肝癌的影響尚不清楚。本實驗結果顯示，肝癌組織中miR-363-3p 低表達，LINC00858 高表達，且LINC00858 靶向負調控miR-363-3p表達。為驗證LINC00858是否通過調控miR-363-3p 影響肝癌的進展，共轉染si-LINC00858 和anti-miR-363-3p后，細胞活性、遷移、侵襲數(shù)升高，即下調miR-363-3p 逆轉了抑制LINC00858 表達對肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲的影響。