李敏，龔亞，曹健，邢茂

磺胺嘧啶魚(yú)肝油滴鼻劑為陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院的自制制劑［中國(guó)人民解放軍中央軍委后勤部衛(wèi)生局非標(biāo)準(zhǔn)制劑，批準(zhǔn)文號(hào)：總制字（2018）F705015］，其主要成分為磺胺嘧啶、魚(yú)肝油，用于治療鼻黏膜糜爛性潰瘍，鼻中隔手術(shù)后促進(jìn)肉芽生長(zhǎng)，加速傷口愈合，并有潤(rùn)滑鼻黏膜的作用。根據(jù)《中國(guó)藥典》（2015 年版）規(guī)定，對(duì)含抑菌成分的制劑進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，應(yīng)先消除供試品相應(yīng)成分的抑菌活性，再依法進(jìn)行檢查，以保證方法的適用性。該制劑因含有磺胺類(lèi)抑菌成分，無(wú)法通過(guò)簡(jiǎn)單一種方法進(jìn)行試驗(yàn)，因此需要采用多種方法進(jìn)行研究及比較，并選取最優(yōu)且符合中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行其微生物限度檢查。本研究擬通過(guò)采用平皿法、培養(yǎng)基稀釋法和中和法，降低或消除其抑菌作用，建立磺胺類(lèi)藥物科學(xué)的微生物限度檢查方法。也為其他有類(lèi)似抑菌性的藥品建立微生物限度方法學(xué)驗(yàn)證提供相應(yīng)的借鑒。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BP-Ⅱ型架盤(pán)天平（上海醫(yī)用激光儀器廠）；LRH-70 型生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；M0ST-T24-B 型臺(tái)式滅菌器（山東新華有限公司）；CS101-2ABN 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（重慶永生有限公司）；BSC-1000-Ⅱ-A2 型生物安全柜（蘇州華宇有限公司）。

1.2 供試品

磺胺嘧啶魚(yú)肝油滴鼻劑（批次190422，190730，191223），為陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院自制。

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］由中國(guó)食品藥品檢定研究院菌種保藏中心提供，均為1代冷凍保存菌株；黑曲霉［CMCC（F）98003］由北京三藥科技提供，為4代冷凍保存菌株。

1.4 培養(yǎng)基、試劑及稀釋液

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批次180427）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批次171218）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批次170316）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批次161118）、麥康凱液體培養(yǎng)基（批次170313）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批次171211）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（批次181227）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批次180326）均購(gòu)自北京陸橋有限公司，經(jīng)過(guò)適應(yīng)性試驗(yàn)驗(yàn)證符合《中國(guó)藥典》2015 年版四部規(guī)定；聚山梨酯-80（成都市科隆化學(xué)品有限公司，批次2017091901）、對(duì)氨基苯甲酸（上?；瘜W(xué)試劑總廠，批次82-12-01）；稀釋液為0.9 %氯化鈉注射液（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批次M18050704）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試液的制備

取磺胺嘧啶魚(yú)肝油滴鼻劑10 mL，加入10 mL 聚山梨酯-80，用稀釋液逐級(jí)稀釋制成1∶10、1∶100供試液。

2.2 菌液的制備

按照《中國(guó)藥典》2015 年版四部通則1105 和1106 中規(guī)定的菌液制備方法，制成適宜濃度的各菌懸液。

2.3 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法的適用性試驗(yàn)

取上述磺胺嘧啶魚(yú)肝油滴鼻劑供試液9.9 mL 于滅菌試管中，加入金黃色葡萄球菌菌懸液0.1 mL，使供試液中含試驗(yàn)菌不大于100 cfu/mL，同法制備含銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉不大于100 cfu/mL 的供試液。平皿法：分別取各供試液1 mL，置無(wú)菌平皿中，每皿1 mL；培養(yǎng)基稀釋法：分別取供試液1 mL，置2 個(gè)或5 個(gè)無(wú)菌平皿中，使每皿 0.5 mL 或 0.2 mL。注入 15～20 mL 溫度不超過(guò)45 ℃熔化的瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基于32.5 ℃培養(yǎng)2 d，作需氧菌計(jì)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基于22.5 ℃下培養(yǎng)3 d，作霉菌和酵母菌計(jì)，作為試驗(yàn)組。供試品對(duì)照組以稀釋液代替菌液，菌液對(duì)照組以稀釋液代替供試液，乳化劑對(duì)照組以聚山梨酯-80 代替供試品，其余均同試驗(yàn)組操作。每株試驗(yàn)菌平行制備兩組。該操作在C級(jí)背景下的A級(jí)單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。

磺胺嘧啶魚(yú)肝油滴鼻劑的三個(gè)不同批次進(jìn)行試驗(yàn)，計(jì)算回收率：試驗(yàn)組的回收率=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)）/菌液對(duì)照組平均菌落數(shù)；乳化劑對(duì)照組的回收率=乳化劑對(duì)照組平均菌落數(shù)/菌液對(duì)照組平均菌落數(shù)。從表1 可以看出，平皿法（1 毫升/皿）適用于磺胺嘧啶魚(yú)肝油滴鼻劑的霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)檢查，但無(wú)法消除其需氧菌計(jì)數(shù)檢查中枯草芽孢桿菌的檢查；培養(yǎng)基稀釋法（0.2 毫升/皿）適用于磺胺嘧啶魚(yú)肝油滴鼻劑的需氧菌計(jì)數(shù)檢查。10%的聚山梨酯-80 不會(huì)干擾上述各菌株的生長(zhǎng)。

表1 需氧菌、霉菌和酵母菌各試驗(yàn)菌株的回收率（n=2）

2.4 控制菌檢查方法的適用性試驗(yàn)

取1∶10 磺胺嘧啶魚(yú)肝油滴鼻劑供試液10 mL，及不大于100 cfu/mL的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌或銅綠假單胞菌菌懸液1 mL，分別加至適宜體積、含適宜濃度對(duì)氨基苯甲酸的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，照《中國(guó)藥典》2015年版四部（通則）1106項(xiàng)下控制菌檢查方法進(jìn)行檢查，作為試驗(yàn)組。供試品對(duì)照組以稀釋液代替菌液，陰性對(duì)照組以稀釋液代替供試液和菌液，陽(yáng)性對(duì)照組以稀釋液代替供試液，乳化劑對(duì)照組以聚山梨酯-80 代替供試品，其余均同試驗(yàn)組操作；中和劑對(duì)照組以含適宜濃度對(duì)氨基苯甲酸的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基代替胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，其余同陽(yáng)性對(duì)照組操作。該操作在C級(jí)背景下的A 級(jí)單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。

如表2 所示，磺胺嘧啶魚(yú)肝油滴鼻劑的控制菌檢查中銅綠假單胞菌采用直接接種法、培養(yǎng)基稀釋法（200 mL）、中和法（0.5%對(duì)氨基苯甲酸，下同）可檢出，大腸埃希菌采用培養(yǎng)基稀釋法（400 mL）、中和法可檢出，金黃色葡萄球菌采用中和法可檢出。綜合上述結(jié)果，控制菌檢查采用中和法適用于磺胺嘧啶魚(yú)肝油滴鼻劑的控制菌大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌檢查，且乳化劑及中和劑對(duì)3種菌種均無(wú)毒性。

表2 控制菌檢查的適用性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

《中國(guó)藥典》2015 年版規(guī)定，微生物限度檢查應(yīng)在不低于D 級(jí)背景下的B級(jí)單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，本試驗(yàn)在C 級(jí)背景下的A 級(jí)單向流空氣區(qū)域內(nèi)操作；鼻用制劑可接受的最大需氧菌總數(shù)為200 cfu/mL，最大霉菌和酵母菌總數(shù)為20 cfu/mL，即需氧菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)檢查時(shí)供試品稀釋級(jí)分別高于1∶200、1∶20 時(shí)無(wú)意義。本品為磺胺類(lèi)藥物，抗菌譜廣，對(duì)大多數(shù)細(xì)菌如金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、大腸桿菌、芽孢桿菌等有良好的抗菌活性，試驗(yàn)中通過(guò)稀釋供試品的方法無(wú)法消除其抑菌活性。當(dāng)供試品因其抑菌活性無(wú)法選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用適宜的方法對(duì)供試液進(jìn)一步處理。如果供試品對(duì)微生物的抑制作用無(wú)法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過(guò)中和、稀釋或薄膜過(guò)濾處理后再加入試驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。前期試驗(yàn)證明，薄膜過(guò)濾法對(duì)于混懸劑適用性差，易造成薄膜堵塞。

本試驗(yàn)采用平皿法無(wú)法消除該藥對(duì)需氧菌中枯草芽孢桿菌的抑菌作用，采用培養(yǎng)基稀釋法可消除其抑菌活性，各菌株的回收率均符合規(guī)定。本品對(duì)真菌的抗菌活性較弱，結(jié)果證明，采用平皿法試驗(yàn)，白色念珠菌和黑曲霉的回收率范圍在0.5～2.0，即進(jìn)行霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)檢查時(shí)可采用平皿法進(jìn)行適用性試驗(yàn)。本品對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用相對(duì)較弱，故控制菌檢查采用直接接種法即可進(jìn)行銅綠假單胞菌的適用性檢查，但不適用于大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的檢查。根據(jù)中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)，磺胺類(lèi)藥物對(duì)大腸埃希菌耐藥率高于50%，而對(duì)金黃色葡萄球菌（包括甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌）耐藥率低于20%，因此通過(guò)培養(yǎng)基稀釋法，培養(yǎng)基體積增大到400 mL時(shí)可消除其對(duì)大腸埃希菌的抑制作用，但即使體積增加至1 000 mL 時(shí)，也無(wú)法消除其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。磺胺類(lèi)藥物主要通過(guò)與對(duì)氨基苯甲酸競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合二氫蝶酸合成酶，阻斷細(xì)菌葉酸的合成而干擾細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，這種抑菌作用可被對(duì)氨基苯甲酸逆轉(zhuǎn)，且這種逆轉(zhuǎn)作用呈現(xiàn)濃度依賴性。本研究對(duì)中和劑對(duì)氨基苯甲酸的濃度進(jìn)行了篩選，將供試品接種至含0.5%對(duì)氨基苯甲酸的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL，可消除本品對(duì)控制菌金黃色葡萄球菌的抑制作用。經(jīng)驗(yàn)證，此法同樣適用于控制菌大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的適用性檢查。

因此，微生物計(jì)數(shù)檢查中需氧菌計(jì)數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法，霉菌及酵母菌采用平皿法；控制菌檢查采用中和法，適用于磺胺嘧啶魚(yú)肝油滴鼻劑微生物限度檢查。本試驗(yàn)所建立的方法簡(jiǎn)單可行，結(jié)果準(zhǔn)確有效，為其他磺胺類(lèi)藥物微生物限度檢查方法的建立提供參考。