羅剛，喻堅(jiān)柏，陳濤，唐寧，李春輝

膠質(zhì)瘤年發(fā)病率約為0.06%，目前用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的常規(guī)療法包括手術(shù)，放射和化學(xué)療法。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人的總生存期僅為12～15個(gè)月，與腫瘤復(fù)發(fā)和整體預(yù)后不良有關(guān)，老年病人的預(yù)后更差。替莫唑胺是一種烷化劑，可在多個(gè)位置引起DNA 堿基甲基化，導(dǎo)致DNA 損傷和細(xì)胞凋亡。由于其在血腦屏障通透性方面的表現(xiàn)及其治療效果，替莫唑胺已成為膠質(zhì)瘤治療的首選化療藥物。然而，抗輻射和替莫唑胺化療是治療惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的一個(gè)日益嚴(yán)重的問題，極大地影響了這些病人的預(yù)后。2008年，超過70%的原發(fā)性膠質(zhì)瘤和繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)了異檸檬酸脫氫酶1/2（IDH1/2）的突變。IDH 突變的病人被認(rèn)為比IDH 野生型（IDH1-WT）腫瘤的病人預(yù)后更好。特別是，IDH1 占 IDH 突變病例的最大比例，IDH1 中超過90%的突變被歸類為R132H突變。Arg132的其他IDH1突變發(fā)生在較低頻率，包括R132S和R132L。功能上，IDH1催化異檸檬酸轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸（α-KG），并在細(xì)胞質(zhì)和過氧化物酶體中產(chǎn)生尼古丁腺嘌呤二磷酸核苷酸（NADPH）。IDH1參與了許多細(xì)胞功能，包括葡萄糖感應(yīng)，脂肪生成和細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)。本研究自2019年1—5月探究IDH1基因突變對替莫唑胺干預(yù)下腦膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞凋亡的影響，以期深入了解其生物學(xué)特性及其化療敏感性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

60 只成年雄性健康SD 小鼠，體質(zhì)量范圍為150～200 g，購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。飼養(yǎng)室溫度（22±2）°C，相對濕度（50±10）%，自由進(jìn)食和飲水，所有實(shí)驗(yàn)動物均在相同條件下飼養(yǎng)，本研究符合一般動物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.2 裸鼠模型及實(shí)驗(yàn)分組

將60 只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分成3 組：野生 IDH1 基因（wIDH1）組 20只，在裸鼠背部皮下注射wIDH1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞（5×10個(gè)細(xì)胞）；突變IDH1 基因（mIDH1）組20 只，在裸鼠背部皮下注射mIDH1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞（5×10個(gè)細(xì)胞）；對照組20只，在裸鼠背部皮下注射對照膠質(zhì)瘤細(xì)胞（5×10個(gè)細(xì)胞）。

通過細(xì)胞注射處理雄性裸鼠并喂食14 d，根據(jù)小鼠的表面區(qū)域通過胃管飼法用替莫唑胺（75 mg/d）處理5 d。隨后的觀察期持續(xù)21 d。根據(jù)函數(shù)V（mm）=π（ab）/6 計(jì)算腫瘤大小（a 為寬，b 為長度）。根據(jù)函數(shù)S（m）=0.06×m（kg）2/3計(jì)算表面積。計(jì)算腫瘤形成率和總化療效率。皮下荷瘤小鼠見圖1。

圖1 皮下荷瘤小鼠

1.3 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)

人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，U87 細(xì)胞和U251 細(xì)胞購自上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。將所有這些細(xì)胞系維持在高葡萄糖（Gibco，USA）的DMEM 培養(yǎng)基中，補(bǔ)充有10%胎牛血清（Gibco，USA），2 mmol/L 谷氨酰胺（Sigma，USA），抗生素（青霉素）100 U/mL 和鏈霉素100 μg/mL，在37°C的5%二氧化碳中。通過胰蛋白酶方法收集細(xì)胞。

1.4 載體和穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建

wIDH1 或mIDH1的載體通過DNA 重組技術(shù)構(gòu)建。攜帶wIDH1、mIDH1或空p-EGFP-C1載體的U87細(xì)胞系基礎(chǔ)上的穩(wěn)定細(xì)胞系通過轉(zhuǎn)染方法分別構(gòu)建，并通過G418方法最終選擇。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（應(yīng)用WB 檢測 wIDH1、mIDH1 的表達(dá)）確定，篩選成功表達(dá)wIDH1或mIDH1蛋白的細(xì)胞系。

1.5 細(xì)胞增殖和活力測定

為了檢測三種細(xì)胞系的增殖能力，使用胰蛋白酶消化和細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。將相同數(shù)量的細(xì)胞在常規(guī)條件下培養(yǎng)48 h，然后通過胰蛋白酶方法收集并在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)。通過最終細(xì)胞數(shù)與初始細(xì)胞數(shù)的比率計(jì)算增殖率。增殖抑制率的檢測基于CCK-8 方法。將細(xì)胞以2×10個(gè)細(xì)胞/ 毫升（100 微克/孔）的密度接種在96 孔板中，使其生長48 h，使零劑量細(xì)胞生長48 h，作為相應(yīng)的對照組。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，向培養(yǎng)基中加入10 μL CCK-8 液體，將細(xì)胞培養(yǎng) 4 h。在 450 nm 處測量吸光度。細(xì)胞的增殖抑制率通過（1―Acontrol/A 替莫唑胺）×100%來評估。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)用于評估細(xì)胞凋亡。用400 μmol/L 替莫唑胺處理細(xì)胞72 h。將未經(jīng)替莫唑胺處理的細(xì)胞作對照組。然后，收集細(xì)胞并用膜聯(lián)蛋白V-FITC 凋亡檢測試劑盒（Keygen Biotech）處理。將細(xì)胞用PBS洗滌3次并重懸于400 μL 結(jié)合緩沖液中，然后在室溫下在黑暗中與 5 μL 膜聯(lián)蛋白 V-FITC 和 5 μL PI 一起溫育 15 min。最后，使用流式細(xì)胞術(shù)（Gallios，Beckman-coulter，USA）在1 h內(nèi)檢測細(xì)胞凋亡。

1.7 Transwell 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)步驟：①基質(zhì)膠準(zhǔn)備：將凍存于-80°C冰箱的BD matrigel 4°C過夜，變成液態(tài)；②取300 μL 無血清培養(yǎng)基，加入60 μL 每室Matrigel ，混勻，4 ℃操作；放入37 ℃培養(yǎng)箱中，孵育5 h。③消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗3 次，計(jì)數(shù)，配成細(xì)胞懸液；④用無血清培養(yǎng)基洗 Matrigel洗1次；每孔加入100 μL細(xì)胞懸液；⑤下腔室中加入500 μL含有20%FBS條件培養(yǎng)基；⑥37 ℃培養(yǎng)箱中，孵育24 h；⑦取出transwell 用PBS 洗2 遍，5%戊二醛固定，4 ℃；⑧結(jié)晶紫（0.1%）染色，室溫0.5 h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面細(xì)胞，顯微鏡下觀察。

1.8 蛋白質(zhì)印跡分析

將細(xì)胞在冰冷的RIPA 裂解緩沖液中裂解。根據(jù)制造商的方案使用Bio-Rad 蛋白質(zhì)測定法估計(jì)蛋白質(zhì)濃度。通過SDS-PAGE 分離細(xì)胞裂解物并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將印跡在含有5%脫脂奶粉的TBS緩沖液中在室溫下封閉1 h。將膜在4 ℃下與第一抗體一起溫育過夜。洗滌膜并與辣根過氧化物酶綴合的第二抗體在室溫下孵育1 h，洗滌。在每次用抗體處理后，用含有Tween20的tris緩沖鹽水充分洗滌膜。根據(jù)制造商的說明，通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光進(jìn)行抗體結(jié)合的檢測。使用發(fā)光圖像分析儀進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和處理。剝離相同的印跡并用抗β-肌動蛋白或抗GAPDH重新探測以用作內(nèi)部對照。

1.9 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)

采用ELISA 法將樣本加入預(yù)冷的PBS（臨用前加入蛋白酶抑制劑）勻漿，勻漿時(shí)置于冰上或冰浴中。吸取勻漿液到離心管，4 ℃、5 000×

g

離心5～10 min，取上清，-20 ℃或-80 ℃保存，避免反復(fù)凍融。按照說明書中操作步驟對三組半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 相關(guān)蛋白（Bax）表達(dá)水平進(jìn)行測定。

2 結(jié)果

2.1 mIDH1 顯著增加對替莫唑胺的化學(xué)敏感性

在細(xì)胞集落形成測定中，wIDH1 組、對照組和mIDH1 組之間細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。將 wIDH1 組、對照組和 mIDH1 組細(xì)胞暴露于替莫唑胺72 h，以評估其化學(xué)敏感性。結(jié)果顯示，mIDH1 組U87 細(xì)胞在CCK-8 測定中顯示出對替莫唑胺的敏感性，mIDH1 組細(xì)胞增殖和細(xì)胞活力較wIDH1組和對照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。見表1。

表1 細(xì)胞活力測定/

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測400 μmol/L 替莫唑胺處理后mIDH1 組與其他組細(xì)胞凋亡的差異，結(jié)果表明mIDH1 組細(xì)胞凋亡率（62.18±3.47）%高于對照組（33.16±6.54）%和wIDH1組（15.36±2.33）%，表明IDH1 R132H 突變增加對替莫唑胺的化學(xué)敏感性（

F=

11.147，

P=

0.003）。

2.3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

mIDH1 組細(xì)胞侵襲能力低于對照組和wIDH1 組，三組中wIDH1 組細(xì)胞侵襲能力最強(qiáng)。表明IDH1 R132H 突變增加對替莫唑胺的化學(xué)敏感性。見圖2。

圖2 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（HE×100）：A為野生IDH1基因（wIDH1）組；B為對照組；C為突變IDH1基因（mIDH1）組

2.4 細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)變化

為了研究mIDH1，wIDH1 和替莫唑胺誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制，應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡分析相關(guān)分子的蛋白質(zhì)變化。結(jié)果顯示，三組不同處理中，mIDH1 組在Caspase-3，Caspase-9 和 Bax 中的蛋白表達(dá)水平最高，Bcl-2 的蛋白表達(dá)水平最低（

P

＜0.05），wIDH1 的異位過表達(dá)顯示出化療抗性特征或至少誘導(dǎo)Bcl-2 蛋白表達(dá)水平的上調(diào)和 Caspase-3，Caspase-9 和 Bax 蛋白水平的下調(diào)。表明wIDH1 可能在化療耐藥中起輔助作用。mIDH1 通過下調(diào)Bcl-2 水平和上調(diào)體內(nèi)和體外Caspase-3，Caspase-9 和Bax 水平來增強(qiáng)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的化療敏感性，表明mIDH1 可能作為化療增強(qiáng)靶標(biāo)起作用。見圖3，表2。

圖3 蛋白質(zhì)免疫印跡

表2 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白（Bax）和B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）的蛋白表達(dá)水平/

2.5 ELISA 檢測細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)

mIDH1 組在三組中Caspase-3，Caspase-9 和Bax 中的表達(dá)水平最高，Bcl-2 的表達(dá)水平最低（

P

＜0.05），wIDH1 的異位過表達(dá)誘導(dǎo)Caspase-3，Caspase-9 和Bax 水平的下調(diào)以及Bcl-2表達(dá)水平的上調(diào)（

P

＜0.05）。見表3。

表3 酶聯(lián)免疫吸附測定檢測細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)/

2.6 mIDH1 增強(qiáng)體內(nèi)替莫唑胺抗腫瘤功效

所有注射接受的小鼠最終形成膠質(zhì)瘤模型，用替莫唑胺處理，每個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫塊的大小在第21天結(jié)束時(shí)測量，發(fā)現(xiàn)增殖結(jié)果與體外相似。mIDH1 腫瘤生長比wIDH1 組和對照組慢得多。與其余兩組相比，mIDH1 組的腫瘤體積（220.17±12.15）mm最?。?p>P

＜0.05）。 wIDH1 組（624.36±33.54）mm與 對 照 組（601.17±36.18）mm差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。

2.7 mIDH1 提高替莫唑胺干預(yù)敏感性

體內(nèi)研究顯示，同時(shí)注射膠質(zhì)瘤細(xì)胞和替莫唑胺胃管灌注處理裸鼠時(shí)，wIDH1 組腫瘤形成抑制率最低（41.37±5.43）%，mIDH1 組腫瘤形成抑制率最高（82.14±5.38）%，對照組為（52.16±3.17）%。在替莫唑胺治療組中，mIDH1組總有效率為（73.15±8.46）%，wIDH1組總有效率為（22.16±3.96）%。對照組為（42.25±3.17）%。結(jié)果表明，wIDH1的過表達(dá)可能在體內(nèi)提供化療耐藥性，而mIDH1可能提高化療敏感性。

3 討論

惡性膠質(zhì)瘤目前與預(yù)后不良相關(guān)，盡管采用多模式治療策略，復(fù)發(fā)仍然幾乎不可避免。膠質(zhì)瘤在組織學(xué)上分級為Ⅰ～Ⅳ，70%～90%的Ⅱ～Ⅲ級膠質(zhì)瘤和繼發(fā)性Ⅳ級膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在一個(gè)IDH1 等位基因中含有突變，其中 R132H 是最常見的。IDH1 存在于細(xì)胞質(zhì)和過氧化物酶體中，在那里它將異檸檬酸轉(zhuǎn)化為α-KG。然而，突變酶將α-KG 轉(zhuǎn)化為代謝物D-2-羥基戊二酸，其結(jié)構(gòu)類似于α-KG 和α-KG 依賴性雙加氧酶的競爭性抑制劑。治療膠質(zhì)瘤通常包括手術(shù)切除，放射治療和使用DNA 烷化劑替莫唑胺的化療。替莫唑胺的細(xì)胞毒性作用主要通過產(chǎn)生 O-6-甲基鳥嘌呤（O6meG）病變來介導(dǎo)。如果甲基不被O6meG-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）除去，這是一種與替莫唑胺抗性相關(guān)的酶，O6meG 在DNA 復(fù)制過程中與胸腺嘧啶錯配，導(dǎo)致無效的錯配修復(fù)和持續(xù)的G2 檢查點(diǎn)停滯，隨后細(xì)胞凋亡或衰老。MGMT啟動子甲基化和因此低MGMT表達(dá)在IDH1 突變體膠質(zhì)瘤中是典型的，但不是唯一的，其通常對替莫唑胺的反應(yīng)優(yōu)于它們的IDH1 野生型對應(yīng)物。然而，MGMT 表達(dá)不是替莫唑胺敏感性的唯一決定因素，IDH1突變體和野生型膠質(zhì)瘤具有不同的分子個(gè)體發(fā)育，使得IDH1 突變體和野生型膠質(zhì)瘤之間的比較沒有信息，哪些腫瘤特征可以直接歸因于IDH1 突變。缺乏IDH1 突變的Ⅱ～Ⅲ級神經(jīng)膠質(zhì)瘤在遺傳上與IDH1 突變神經(jīng)膠質(zhì)瘤不同，并且與原發(fā)性Ⅳ級膠質(zhì)母細(xì)胞瘤更相似。雖然遺傳改變?nèi)鏓GFR擴(kuò)增和CDKN2A缺失在IDH1 WT膠質(zhì)瘤中很常見，但它們很少發(fā)生在具有突變IDH1的膠質(zhì)瘤中。盡管被認(rèn)為化學(xué)反應(yīng)性IDH1 突變膠質(zhì)瘤通常在手術(shù)切除和放射治療和替莫唑胺治療后仍然復(fù)發(fā)，但突出了對新治療方案的需求。

本研究發(fā)現(xiàn)mIDH1 在生物學(xué)行為和化療敏感性方面表現(xiàn)出不同。本研究證明mIDH1 引起增殖抑制并上調(diào)化療敏感性，其增強(qiáng)了替莫唑胺引起的細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的抑制作用。wIDH1 過表達(dá)不促進(jìn)細(xì)胞增殖，但在替莫唑胺誘導(dǎo)的凋亡抑制中表現(xiàn)出化療耐藥特征。由于這些差異，膠質(zhì)瘤可分為兩種亞型，這兩種亞型存在明顯不同的預(yù)后。重要的是要了解這些差異并探索由mIDH1 誘導(dǎo)的相對更好的預(yù)后的機(jī)制。筆者認(rèn)為腫瘤病人的預(yù)后取決于腫瘤細(xì)胞本身以及對其進(jìn)行的治療。前者涉及多因素事件，包括細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等。細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡過程，其可由一些內(nèi)源性或外源性因子誘導(dǎo)，即死亡信號誘導(dǎo)的死亡受體介導(dǎo)的途徑和線粒體依賴性途徑。細(xì)胞凋亡對于維持細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)態(tài)非常重要。Caspase-cascade在細(xì)胞凋亡中至關(guān)重要。Bax/Bcl-2 的比例通常決定細(xì)胞凋亡和激活的半胱天冬酶級聯(lián)反應(yīng)。mIDH1和wIDH1 過度表達(dá)在常規(guī)條件下不會引起細(xì)胞凋亡，wIDH1 過表達(dá)抑制替莫唑胺誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其是通過降低Bax/ Bcl-2 比率和Caspase-3 活性。故而，mIDH1 異位表達(dá)通過增加Bax/ Bcl-2 比率和Caspase-3 活性來增強(qiáng)細(xì)胞凋亡。筆者推測，其機(jī)制與mIDH1下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP-2、MMP-9體內(nèi)外表達(dá)水平，從而降低腫瘤細(xì)胞侵襲能力有關(guān)。

綜上所述，mIDH1 引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)變化，這減少了細(xì)胞的惡性行為。mIDH1 還在體內(nèi)和體外增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的化療敏感性，而wIDH1 顯示出化療抗性特征。mIDH1 通過上調(diào)替莫唑胺后膠質(zhì)瘤細(xì)胞 Caspase-3、Caspase-9、Bax 表達(dá)并下調(diào)Bcl-2表達(dá)提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率，增強(qiáng)治療敏感性。