李亞明 潘雙 陳暉 劉松 張進召

(西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 西安醫(yī)學院全科醫(yī)學院呼吸與危重癥醫(yī)學科，陜西 西安 710077)

肺癌是起源于支氣管上皮細胞或支氣管腺體的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤首位〔1〕。盡管肺癌的綜合診療技術(shù)不斷提高，但由于肺癌極易擴散和轉(zhuǎn)移，對人類的健康和生命已構(gòu)成嚴重威脅〔2,3〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，越來越多的研究證實LncRNA與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔4,5〕。研究發(fā)現(xiàn)，人類白細胞抗原復合體(HCG)11在非小細胞肺癌(NSCLC)組織中表達下調(diào)，HCG11的下調(diào)程度與存活時間顯著相關(guān)，是NSCLC的新型生物標志物和診斷靶標〔6〕。此外，有研究指出HCG11的異常表達參與對肝癌和宮頸癌細胞的生物學行為調(diào)控〔7,8〕。但目前HCG11對肺癌細胞增殖遷移等生物行為的影響及其機制目前尚不清楚。本研究探究HCG11在肺癌轉(zhuǎn)移中的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 46例肺癌組織及與其配對的癌旁組織由西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院于2016年1月至2018年1月收集。所有患者以前未經(jīng)過化療和放療。本研究在開始前經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽訂知情同意書。肺癌細胞A549購自美國ATCC，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗溶液、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑和Trizol試劑均購自Invitrogen公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)細胞增殖檢測試劑盒和Western印跡相關(guān)試劑均購自中國碧云天公司；Transwell小室和基質(zhì)膠均購自BD公司；pcDNA3.1、pcDNA3.1-HCG11、miR-NC、miR-1297 mimics、si-NC、si-HCG11、WT-HCG11和MUT-HCG11的構(gòu)建和測序均由上海生工公司提供；細胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體、P21抗體、E-鈣黏附蛋白(E-cadherin)抗體和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2抗體均購自Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和實驗分組 采用DMEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗)于常規(guī)細胞培養(yǎng)箱(37℃、含5%CO2、濕度飽和)培養(yǎng)A549細胞。細胞轉(zhuǎn)染：將對數(shù)期的A549細胞按照每孔2×105個細胞的密度接種于6孔板，當細胞融合度達到60%時，用不含血清培養(yǎng)基同步化12 h后進行轉(zhuǎn)染。將pcDNA3.1或pcDNA3.1-HCG11溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基中室溫條件孵育5 min，同時另取LipofectamineTM2000加入到Opti-MEM培養(yǎng)基室溫孵育5 min，然后將兩者混合后室溫放置20 min，最后將含pcDNA3.1或pcDNA3.1-HCG11的混合物分別加入到A549細胞中，培養(yǎng)6 h后，更換為DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后進行后續(xù)實驗。為進一步證明HCG11是通過調(diào)控miR-1297表達進而影響A549細胞的增殖和凋亡，將pcDNA3.1-HCG11和miR-1297 mimics同時轉(zhuǎn)染入A549細胞，檢測A549細胞的增殖和凋亡情況。實驗分組如下：pcDNA3.1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1)、pcDNA3.1-HCG11組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HCG11)、pcDNA3.1-HCG11+miR-NC組(同時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HCG11和miR-NC)和pcDNA3.1-HCG11+ miR-1297組(同時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HCG11和miR-1297 mimics)。

1.2.2實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測 利用Trizol試劑分別提取46例肺癌組織和與其配對的癌旁組織應(yīng)激各組A549細胞的總RNA。利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，并以cDNA為模板按照說明書進行qRT-PCR擴增。用2-ΔΔCt法計算HCG11和miR-1297的相對表達量，分別以GAPDH和U6為內(nèi)參。引物序列如下：miR-1297上游引物：5′-ACACTCCAGCTGGGTTCAAGTAATTCAGG-3′，下游引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′，HCG11上游引物：5′-GCTCTATGCCATCCTGCTT-3′，下游引物：5′-TCCCATCTCCATCAACCC-3′，GAPDH上游引物：5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3′，下游引物：5′-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′，U6上游引物：5′-GATTTCTCCCTCATCGCTTACAG-3′，下游引物：5′-CTGCTTCATGATCGTTGTTGCTTG-3′。

1.2.3雙熒光素酶報告基因檢測 利用Starbase進行靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)，HCG11與miR-1297存在連續(xù)結(jié)合位點，猜測miR-1297是HCG11的靶基因，并利用雙熒光素酶報告基因檢測進行驗證。構(gòu)建野生型WT-HCG11和突變型MUT-HCG11的HCG11-3′UTR熒光素酶報告基因載體，利用LipofectamineTM2000將miR-1297模擬物和miR-NC分別與WT-HCG11或MUT-HCG11同時轉(zhuǎn)染入A549細胞，常規(guī)培養(yǎng)48 h后，利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定各組細胞的熒光素酶活性。

1.2.4MTT比色法檢測細胞活力 分別取各組對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后接種(2×103個/孔)于96孔板，分別在24、48和72 h時加入MTT試劑(20 μl/孔)孵育4 h，棄去上清液后每孔再加入DMSO試劑(150 μl/孔)，繼續(xù)孵育2 h至結(jié)晶完全溶解。全自動酶標儀檢測490 nm處各孔的OD值。

1.2.5Transwell法檢測細胞遷移和侵襲能力 侵襲實驗：取50 μl已稀釋的基質(zhì)膠包被于Transwell小室上室膜，凝固后備用。細胞轉(zhuǎn)染48 h后，用胰酶消化細胞，用DMEM培養(yǎng)基(不含血清)重懸細胞調(diào)整細胞濃度約為2×105/ml。上室加入100 μl的細胞懸液，下室加入DMEM培養(yǎng)基(含10%血清)，于細胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h后，用棉簽擦去上室膜未穿膜的細胞，用甲醇固定下室膜30 min，0.5%的結(jié)晶紫染液染色10 min，洗去多余染液，倒置于顯微鏡下觀察下室室面的細胞個數(shù)，隨機選取5個視野進行拍照，計數(shù)，取均值為細胞侵襲數(shù)目。遷移實驗采用未包被基質(zhì)膠的Transwell小室，其他步驟同上。

1.2.6Western印跡檢測 采用RIPA裂解液提取各組A549細胞的總蛋白，用BCA試劑盒進行定量，調(diào)整蛋白濃度。取適量蛋白樣品，上樣后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜后，用Western封閉液室溫封閉60 min，Western洗滌液洗膜后，加入已稀釋的相應(yīng)的Ⅰ抗4℃?zhèn)葦[搖床孵育過夜，Western洗滌液洗膜后，加入相應(yīng)的已稀釋的Ⅱ抗室溫條件孵育1 h，化學發(fā)光顯色后拍照，成像掃描分析系統(tǒng)測定目的條帶的灰度值。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1HCG11和miR-1297在肺癌組織和癌旁組織中的表達 與癌旁組織組比較，肺癌組織組HCG11的表達顯著下調(diào)，miR-1297的表達顯著上調(diào)(均P<0.05)。見表1。

表1 HCG11、miR-1297在肺癌組織和癌旁 組織中的表達

2.2過表達HCG11對細胞A549增殖的影響 與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-HCG11組A549細胞HCG11的表達顯著上調(diào)(P<0.05)，表明成功構(gòu)建了過表達HCG11的A549細胞株。與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-HCG11組A549細胞在24 h、48 h和72 h細胞活力顯著降低，促增殖蛋白CyclinD1的表達顯著降低，增殖抑制蛋白P21的表達顯著上調(diào)(P<0.05)。表明過表達HCG11可抑制A549細胞的增殖。見表2、圖1。

表2 過表達HCG11對細胞A549增殖的影響

圖1 過表達HCG11對細胞A549增殖蛋白表達的影響

2.3過表達HCG11對細胞A549遷移、侵襲的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-HCG11組A549細胞遷移侵襲促進蛋白MMP-2的表達顯著降低，遷移侵襲抑制E-cadherin的表達顯著升高，遷移侵襲細胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)。見圖2、表3、圖3。

圖3 過表達HCG11對細胞A549遷移、侵襲的影響

表3 過表達HCG11對細胞A549遷移、侵襲的影響

圖2 過表達HCG11對細胞A549遷移、侵襲的 影響(結(jié)晶紫染色，×200)

表明過表達HCG11可抑制A549細胞的遷移和侵襲。

2.4HCG11靶向調(diào)控miR-1297的表達 Starbase在線預(yù)測顯示，HCG11與miR-1297存在連續(xù)結(jié)合位點，見圖4。當上調(diào)miR-1297表達后，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-HCG11的3′UTR報告基因載體的A549細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染MUT-HCG11的3′UTR報告基因載體的A549細胞熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)。見表4。與pcDNA3.1組A549細胞miR-1297的表達(0.88±0.09)相比，pcDNA3.1-HCG11組(0.30±0.03)顯著降低；與si-NC組(0.89±0.09)相比，si-HCG11組(1.43±0.14)顯著升高(P<0.05)。表明miR-1297是HCG11的靶基因，miR-1297可靶向負性調(diào)控HCG11的表達。

圖4 HCG11靶向miR-1297

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.5過表達miR-1297能逆轉(zhuǎn)HCG11對細胞A549增殖的抑制作用 與pcDNA3.1組相比，與pcDNA3.1-HCG11+miR-NC比較，pcDNA3.1-HCG11+miR-1297組A549細胞miR-1297和Cyclin D1蛋白的表達顯著升高，P21蛋白的表達顯著降低，A549細胞在24 h、48 h和72 h細胞活力顯著增強(P<0.05)。見圖5、表5。表明過表達miR-1297可逆轉(zhuǎn)HCG11對A549細胞的增殖抑制作用。

1～2:pcDNA3.1-HCG11+miR-1297組，下圖同圖5 過表達miR-1297能逆轉(zhuǎn)HCG11對細胞A549 增殖蛋白表達的影響

表5 過表達miR-1297能逆轉(zhuǎn)HCG11對細胞A549增殖的抑制作用

2.6過表達miR-1297能逆轉(zhuǎn)HCG11對細胞A549遷移、侵襲的抑制作用 與pcDNA3.1-HCG11+miR-NC組相比，pcDNA3.1-HCG11+miR-1297組A549細胞E-cadherin蛋白的表達顯著降低，MMP-2蛋白的表達顯著升高，遷移和侵襲細胞數(shù)目顯著增多(P<0.05)。見圖6、表6。表明過表達miR-1297可逆轉(zhuǎn)HCG11對A549細胞遷移和侵襲的抑制作用。

圖6 過表達miR-1297能逆轉(zhuǎn)HCG11對細胞A549遷移、 侵襲蛋白表達的影響

表6 過表達miR-1297能逆轉(zhuǎn)HCG11對細胞A549遷移、侵襲的抑制作用

3 討 論

肺癌是世界上最常見的實體腫瘤，NSCLC約占所有肺癌病例的80%，肺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移是肺癌相關(guān)死亡的主要原因〔9，10〕。但是，對肺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移的機制仍知之甚少，且目前尚無有效治療肺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的有效方法。因此，了解肺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移機制，尋找新的治療靶點，對提高肺癌治療和改善患者預(yù)后具有重要意義。

LncRNA參與調(diào)控惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展已被證實〔11〕。Liu等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，HCG11在乳腺癌中表達上調(diào)，HCG11的異常表達與乳腺癌患者較差的總體生存率相關(guān)；Xu等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)，HCG11在肝癌組織中也呈高表達，敲減HCG11導致細胞活力、增殖和遷移能力下降；然而，Zhang等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)，HCG11在前列腺癌中表達下調(diào)，Wang等〔14〕進一步研究發(fā)現(xiàn)過表達HGC11通過下調(diào)miR-543表達抑制PI3K/AKT信號通路，進而抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡。本研究通過qRT-PCR證實HGC11在肺癌組織中呈低表達，這與常芬等〔6〕研究結(jié)果相一致。本研究結(jié)果表明HGC11在肺癌中發(fā)揮抑癌基因作用。HGC11下游靶基因眾多，意味著HGC11有多種調(diào)控通路。在直腸癌中，HGC11通過靶向下調(diào)miR-144-3p，進而上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子E盒結(jié)合鋅指蛋白(ZEB)1的表達，促進直腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移〔15〕；陳曉杰等〔16〕指出HGC11可能通過調(diào)控miR-590-3p表達進而影響宮頸鱗狀細胞癌患者的預(yù)后發(fā)揮抑癌基因作用；HGC11還可直接作用于miR-4425，促進腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(MTA)3表達，進而抑制膠質(zhì)瘤的生長〔17〕?？梢奌GC11參與調(diào)控多種惡性腫瘤的生物學行為，但HGC11在肺癌中的分子機制尚不清楚。

miR-1297是基于不同的癌癥細胞而發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用的微小RNA〔18〕。卜文瑾〔19〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-1297在肺癌細胞中表達上調(diào)，抑制miR-1297表達細胞增殖率降低。本研究發(fā)現(xiàn)miR-1297是HGC11的潛在靶基因。因此，推測HGC11/miR-1297分子軸參與調(diào)控肺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明，HCG11通過靶向下調(diào)miR-1297表達從而抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，遏制肺癌的惡性發(fā)展。