張進(jìn)召 劉松 潘雙 刁鑫 李亞明

(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院(西安醫(yī)學(xué)院全科醫(yī)學(xué)院)呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，陜西 西安 710077)

肺癌是世界上死亡率和發(fā)病率非常高的惡性腫瘤，治療手段有免疫治療、手術(shù)治療及化療等，尋找更有效治療手段是目前醫(yī)學(xué)的重點(diǎn)和難點(diǎn)〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在肺癌的治療中發(fā)揮著重要作用〔2〕。淡豆豉是由豆科植物大豆的成熟種子和青蒿、桑葉等經(jīng)發(fā)酵加工而成的制品，其活性成分異黃酮等有抗腫瘤、抗氧化等功效〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)淡豆豉異黃酮可抑制血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與阻斷JAK2/STAT3信號通路的磷酸化有關(guān)〔4〕。淡豆豉提取物劑量依賴性抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，高濃度還可促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔5〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)的異常表達(dá)與肺癌發(fā)生發(fā)展、原位侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔6〕，miR155HG是LncRNA的一種，因是miR-155的宿主基因而得名，研究報道m(xù)iR155HG能通過調(diào)控miR-155-5p增強(qiáng)人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力〔7〕。干擾miR155HG通過抑制miR-155-5p和miR-155-3p的產(chǎn)生，抑制細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和原位神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長〔8〕。研究發(fā)現(xiàn)miR-409-3p可作為腫瘤抑制因子參與調(diào)控腫瘤進(jìn)展〔9〕。miR-409-3p通過靶向血管生成素抑制HT1080細(xì)胞增殖、血管形成和轉(zhuǎn)移〔10〕；miR-409-3p在胃癌組織中低表達(dá)，上調(diào)miR-409-3p表達(dá)通過調(diào)控靶基因PHF10抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡〔11〕。然而淡豆豉提取物對肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其機(jī)制尚不清楚，本研究旨在探討淡豆豉提取物對肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響及其機(jī)制是否與miR155HG/miR-409-3p有關(guān)。

1 材料和方法

1.1材料與試劑 肺癌細(xì)胞株A549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；淡豆豉購自亳州百川藥業(yè)；RNA提取試劑盒、qPCR試劑盒均購自日本Takara公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法試劑盒、蛋白提取試劑盒均購自上海碧云天生物公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2方法

1.2.1淡豆豉提取物的制備 將淡豆豉干燥后粉碎，過10目篩，取30 g粉末置于1 000 ml三角瓶中，依次加入300 ml 70%乙醇，300 ml丙酮，室溫超聲提取3次，20 min/次，合并提取液并減壓濃縮，冷凍真空干燥的粉末提取物。再根據(jù)實驗所需配制成所需濃度。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組 肺癌細(xì)胞A549用RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，將A549細(xì)胞分為對照組和淡豆豉提取物組；對照組：不添加淡豆豉提取物；淡豆豉提取物組：細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，吸去原培養(yǎng)液，換成不同濃度的淡豆豉提取物培養(yǎng)液，其濃度分別為100 μg/ml、200 μg/ml、400 μg/ml。將生長至80%的A549細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基同步化12 h，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將si-NC、si-miR155HG、miR-NC、miR-409-3p轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，記為si-NC組、si-miR155HG組、miR-NC組、miR-409-3p組；將pcDNA、pcDNA-miR155HG轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞后再用400 μg/ml的淡豆豉提取物處理，記為淡豆豉提取物+pcDNA組、淡豆豉提取物+pcDNA-miR155HG組。

1.2.3qRT-PCR分析miR-409-3p和miR155HG表達(dá)水平 提取總RNA，合成cDNA后按試劑盒說明進(jìn)行qRT-PCR，相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計算。

1.2.4Western印跡檢測蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，定量后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，用封閉液封閉，加入一抗4℃孵育過夜，洗膜加入二抗室溫孵育2 h，顯影，成像，分析蛋白條帶的灰度值，計算蛋白表達(dá)水平。

1.2.5MTT比色法測定細(xì)胞增殖抑制率 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μl的MTT試劑，孵育4 h，加入150 μl的二甲基亞砜，震蕩混勻，酶標(biāo)儀測定490 nm波長處OD值。將對照組細(xì)胞抑制率設(shè)定為0 %。其余各組細(xì)胞抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.6Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲 用無血清培養(yǎng)液重懸各組細(xì)胞，取200 μl接種于Transwell上室，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定30 min，再加入結(jié)晶紫染色，漂洗干燥后用顯鏡拍照并計數(shù)，即為遷移細(xì)胞數(shù)。侵襲實驗用基質(zhì)膠平鋪覆蓋Transwell上室，然后同遷移操作。

1.2.7熒光素酶報告實驗 構(gòu)建miR155HG野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體，將其分別與miR-409-3p和miR-NC轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞，依據(jù)說明書要求，檢測細(xì)胞熒光素酶活性。將pcDNA、pcDNA-miR155HG、si-NC、si-miR155HG分別轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，用 qRT-PCR分析miR-409-3p表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.00軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1淡豆豉提取物對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響 相較于對照組，不同濃度淡豆豉提取物組A549細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平逐漸降低，p21蛋白表達(dá)水平逐漸升高(均P<0.05)；A549細(xì)胞的抑制率隨著淡豆豉提取物濃度升高而逐漸升高(均P<0.05)；A549細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量隨淡豆豉提取物濃度升高而逐漸減少(均P<0.05)。見圖1、圖2、表1。

1～4：對照組、淡豆豉提取物100 μg/ml組、淡豆豉提取物200 μg/ml組、淡豆豉提取物400 μg/ml組圖1 Western印跡檢測增殖、遷移、 侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

圖2 淡豆豉提取物對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

表1 淡豆豉提取物對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響

2.2淡豆豉提取物對肺癌A549細(xì)胞中miR155HG和miR-409-3p表達(dá)的影響 相較于對照組，不同濃度淡豆豉提取物組miR-409-3p表達(dá)水平逐漸升高；miR155HG表達(dá)水平逐漸降低(均P<0.05)。見表2。

表2 淡豆豉提取物對肺癌A549細(xì)胞中miR155HG和 miR-409-3p表達(dá)的影響

2.3miR155HG靶向調(diào)控miR-409-3p的表達(dá) TargetScan預(yù)測到miR155HG與miR-409-3p存在結(jié)合位點(diǎn)。見圖3。相較于miR-NC與WT-miR155HG組，miR-409-3p與WT-miR155HG組細(xì)胞A549的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。見表3。pcDNA-miR155HG組miR-409-3p表達(dá)水平(0.36±0.04)顯著低于pcDNA組(1.00±0.09，P<0.05)；si-miR155HG組miR-409-3p表達(dá)水平(2.34±0.22)顯著高于si-NC組(1.01±0.08，P<0.05)。

圖3 miR155HG含有與miR-409-3p 互補(bǔ)的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.4抑制miR155HG表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響 相較于si-NC組，si-miR155HG組CyclinD1、MMP-2、MMP-9、miR155HG表達(dá)水平均顯著降低，p21蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P=0.000)；A549細(xì)胞抑制率顯著升高(P=0.000)；細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量均顯著減少(均P=0.000)。見表4、圖4。

表4 抑制miR155HG表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響

圖4 抑制miR155HG表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移 侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5miR-409-3p過表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響 相較于miR-NC組，miR-409-3p組CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平均顯著降低，p21及miR155HG表達(dá)水平均顯著升高(均P=0.000)；A549細(xì)胞抑制率顯著升高(P=0.000)；細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量均顯著減少(均P=0.000)。見圖5、表5。

圖5 miR-409-3p過表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表5 miR-409-3p過表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響

2.6miR155HG過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了淡豆豉提取物(400 μg/ml)對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲的作用 相較于淡豆豉提取物+pcDNA組，淡豆豉提取物+pcDNA-miR155HG組CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平均顯著升高，p21蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)；A549細(xì)胞抑制率顯著降低(P<0.05)；細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量均顯著增加(均P<0.05)。見表6、圖6。

表6 miR155HG過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了淡豆豉提取物對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲的作用

1～4:對照組、淡豆豉提取物組、淡豆豉提取物+pcDNA組、淡豆豉提取物+pcDNA-miR155HG組圖6 miR155HG過表達(dá)逆轉(zhuǎn)淡豆豉提取物對肺癌A549 細(xì)胞增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

肺癌的發(fā)病率和死亡率不斷升高，嚴(yán)重影響著人類的生命健康，中醫(yī)藥是肺癌的主要治療手段之一，其聯(lián)合靶向藥物和化療具有增效減毒和逆轉(zhuǎn)耐藥的作用〔12〕。淡豆豉醇提物有體外抗肝癌、乳腺癌細(xì)胞生長的作用，并具有一定的時間、劑量依賴性〔13，14〕。淡豆豉還可提高2型糖尿病模型大鼠抗氧化能力，減少炎性因子腫瘤壞死因子(TNF)-α的釋放，緩解其氧化應(yīng)激損傷和炎性損傷〔15〕。本研究說明淡豆豉提取物能抑制肺癌細(xì)胞A549增殖，遷移和侵襲，且具有濃度依賴性。

LncRNA miR155HG在腫瘤發(fā)生中起重要作用，miR155HG在胰腺癌組織和細(xì)胞中顯著上調(diào)表達(dá)，干擾其表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞的生長，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔16〕。miR155HG在喉鱗癌組織中也高表達(dá)，敲除miR155HG抑制喉鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲〔17〕。miR155HG在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)其表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔18〕。本研究結(jié)果說明抑制miR155HG表達(dá)能抑制肺癌細(xì)胞A549增殖，遷移和侵襲。且本研究發(fā)現(xiàn)miR155HG可靶向調(diào)控miR-409-3p的表達(dá)。

研究報道m(xù)iR-409-3p在肺腺癌組織中下調(diào)表達(dá)，上調(diào)miR-409-3p可抑制肺腺癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔19〕。過表達(dá)miR-409-3p還可抑制乳腺癌、舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲〔20，21〕。本研究結(jié)果說明過表達(dá)miR-409-3p能抑制肺癌細(xì)胞A549增殖，遷移和侵襲；miR155HG過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了淡豆豉提取物對肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲的抑制作用。以上結(jié)果表明，淡豆豉提取物可能通過調(diào)控miR155HG進(jìn)而靶向調(diào)控miR-409-3p影響肺癌細(xì)胞A549的增殖、遷移和侵襲。