鄧演文，劉曉洲，卓定龍，曾 鳳

（廣州普邦園林股份有限公司，廣東 廣州 510627）

【研究意義】桃金娘科（Myrtaceae）植物主要產(chǎn)于亞熱帶和美洲的熱帶地區(qū)，約有100屬3 000 種以上，我國(guó)僅含9 屬約126 種［1］。蒲桃屬（Syzygium）為桃金娘科喬木或灌木，全球共有1 200 種，我國(guó)有近80 種［1］。蒲桃屬植物具有一定的耐澇能力，其中蒲桃［2］、水翁［3］等均已被證實(shí)具有耐受水淹脅迫能力，可用于濱水、河畔綠化等景觀用途。肖蒲桃（Syzygium acuminatissimum）為桃金娘科蒲桃屬植物，原產(chǎn)于中國(guó)，其株型優(yōu)美，嫩葉紅褐色，樹(shù)枝軟垂，姿態(tài)優(yōu)雅，兼具觀果價(jià)值，適宜作為行道樹(shù)或園景樹(shù)［4］。目前關(guān)于肖蒲桃的研究主要在林分類型［5］、脅迫響應(yīng)［6］、固氮作用［7］等方面。研究肖蒲桃的葉綠體基因組對(duì)蒲桃屬的系統(tǒng)發(fā)育和物種鑒定具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】葉綠體參與植物的光合作用、氨基酸和脂肪酸的合成等重要生理過(guò)程，在植物生長(zhǎng)、發(fā)育中起重要作用［8］。該細(xì)胞器具有一種環(huán)狀雙鏈DNA 的遺傳物質(zhì)，包含100～130 個(gè)基因，總長(zhǎng)度在107～218 kb 之間，并具有保守的四部分結(jié)構(gòu)（一個(gè)大單拷貝區(qū)、一個(gè)小單拷貝區(qū)和兩個(gè)反向重復(fù)區(qū)）［9］。由于葉綠體基因組序列高度保守、大小穩(wěn)定、缺乏重組和母體遺傳，因此常被用于系統(tǒng)發(fā)育［10］和分化時(shí)間［11］的相關(guān)研究。近年來(lái)，隨著科技發(fā)展，獲取基因組的成本降低，許多研究者利用葉綠體基因組數(shù)據(jù)推測(cè)植物分類學(xué)水平的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系［12］。葉綠體基因組分析技術(shù)在桃金娘科應(yīng)用廣泛，涵蓋了桉屬［13］、番櫻桃屬［14］、白千層屬［15］、番石榴屬［14］。目前，蒲桃屬中，已獲知海南蒲桃、丁香蒲桃和滇邊蒲桃具有完整的葉綠體基因組?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】對(duì)于肖蒲桃的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，有研究者僅基于3 個(gè)葉綠體片段序列進(jìn)行解析［16］。但簡(jiǎn)短的片段無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)估其在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中的位置，因此亟需通過(guò)完整的葉綠體基因組序列判定肖蒲桃在蒲桃屬中的親緣關(guān)系。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究利用高通量測(cè)序，組裝和注釋肖蒲桃完整的葉綠體基因組，并解析肖蒲桃葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，旨在為蒲桃屬乃至桃金娘科的系統(tǒng)發(fā)育研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

肖蒲桃葉片采于廣州從化百木苗場(chǎng)（113°24 ′06 ″E、23 °43 ′04 ″N），植物標(biāo)本（Zhang-20200729）放置于中山大學(xué)標(biāo)本館。采用CTAB 法［17］對(duì)肖蒲桃葉片提取基因組DNA，-20℃下保存，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組測(cè)序和注釋 利用提取的DNA 構(gòu)建DNA shotgun 文庫(kù)，并在Illumina HiSeq X TEN平臺(tái)（美國(guó)）進(jìn)行測(cè)序。使用SOAPnuke 軟件［18］進(jìn)行質(zhì)量控制后，將約2 Gb 的干凈讀段以海南蒲桃（Syzygium cumini）的葉綠體基因組作為參考，在SPAdes v3.13.0 軟件［19］上組裝完整的肖蒲桃葉綠體基因組?；蜃⑨屧贕eSeq（https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html）［20］上進(jìn)行。將帶注釋的葉綠體基因組序列提交至GenBank（登錄號(hào)：MT975437）。使用Editseq v7.1.0 軟件［21］計(jì)算肖蒲桃葉綠體基因組序列的鳥(niǎo)嘌呤-胞嘧啶（GC）含量。采用CHLOROPLOT 軟件［22］繪制肖蒲桃葉綠體基因組圖譜。

1.2.2 氨基酸頻率、RNA編輯位點(diǎn)與重復(fù)序列使用MEGA v7.0軟件［23］生成蛋白編碼基因的相對(duì)同義密碼子使用值（RSCU）。使用PREP 軟件［24］的默認(rèn)設(shè)置預(yù)測(cè)蛋白編碼基因中的RNA編輯位點(diǎn)。通過(guò)REPuter（https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer/）［25］在線服務(wù)識(shí)別葉綠體基因組中的重復(fù)序列（正向、反向、互補(bǔ)和回文）。通過(guò)MISA-web（https://webblast.ipkgatersleben.de/misa/）［26］在線檢測(cè)葉綠體基因組中的簡(jiǎn)單序列重復(fù)，其中單、二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)的最小重復(fù)數(shù)分別設(shè)置為8、5、4、3、3。

1.2.3 基因組比較與序列變異分析 采用IRscope軟件［27］對(duì)肖蒲桃、海南蒲桃、丁香蒲桃、滇邊蒲桃4 個(gè)蒲桃屬葉綠體基因組中4 個(gè)不同區(qū)域?qū)崿F(xiàn)邊界可視化。使用DnaSP v6.12.0 軟件［28］檢測(cè)上述4 個(gè)蒲桃屬植物葉綠體基因組序列的核苷酸多樣性（π）。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析 為了研究肖蒲桃在桃金娘科中的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，基于11 個(gè)桃金娘科和2 個(gè)菊科植物葉綠體基因組中的蛋白編碼基因，使用RAxML 軟件［29］構(gòu)建最大似然樹(shù)，并設(shè)置1 000步的bootstrap。所有植物葉綠體基因組序列均從NCBI 核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)下載。

2 結(jié)果與分析

2.1 肖蒲桃葉綠體基因組結(jié)構(gòu)與特征

完整的肖蒲桃葉綠體基因組長(zhǎng)度為159 352 bp，具有典型的四分結(jié)構(gòu)，包括大單拷貝區(qū)（LSC）87 993 bp，小單拷貝區(qū)（SSC）18 415 bp 和一對(duì)反向重復(fù)區(qū)（IR）26 472 bp。圖1 顯示，肖蒲桃葉綠體基因組的總GC 含量為37%，LSC、SSC 和IR的GC 含量分別為34.73%、30.63%和42.66%。

圖1 肖蒲桃葉綠體基因組圖譜Fig.1 Map of the chloroplast genome of Syzygium acuminatissimum

本研究在肖蒲桃葉綠體基因組中共注釋了109 個(gè)基因，包括78 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因（PCG）、27 個(gè)tRNA 基因和4 個(gè)rRNA 基因。其中，有55個(gè)基因參與自我復(fù)制，包括4 個(gè)基因編碼rRNA、27 個(gè)基因編碼tRNA、12 個(gè)基因編碼核糖體小亞基蛋白、8 個(gè)基因編碼核糖體大亞基蛋白、4 個(gè)基因編碼RNA 聚合酶亞基；另有45 個(gè)基因參與光合作用，包括6 個(gè)ATP 合酶基因、11 個(gè)NADH脫氫酶基因、6 個(gè)細(xì)胞色素b/f 復(fù)合體基因、5 個(gè)光系統(tǒng)I 基因、15 個(gè)光系統(tǒng)II 基因、1 個(gè)翻譯起始因子IF-1 和1 個(gè)Rubisco 長(zhǎng)鏈基因（表1）。

表1 肖蒲桃葉綠體基因組基因Table 1 Genes of the chloroplast genome of Syzygium acuminatissimum

本研究在肖蒲桃葉綠體基因組中共檢測(cè)到17個(gè)基因具有內(nèi)含子，包括12個(gè)蛋白編碼基因和5個(gè)tRNA編碼基因（表2）。ycf3、clpP、和rps12具有2個(gè)內(nèi)含子，其余僅具有1個(gè)內(nèi)含子。編碼40S核糖體蛋白S12的rps12基因被剪接為兩個(gè)片段，其中一個(gè)外顯子位于大單拷貝區(qū)，另外兩個(gè)外顯子位于重復(fù)片段區(qū)。最長(zhǎng)的內(nèi)含子位于trnK-UUU基因（2 526 bp）中，因?yàn)槠鋬?nèi)部含有matK基因；trnL-UAA的內(nèi)含子最短（530 bp）。

表2 肖 蒲桃葉綠體基因組中含有內(nèi)含子基因的特征Table 2 Characteristics of genes containing introns in the chloroplast genome of Syzygium acuminatissimum

2.2 基于肖蒲桃葉綠體基因組預(yù)測(cè)的氨基酸頻率、RNA 編輯位點(diǎn)與重復(fù)序列

肖蒲桃葉綠體基因組中的蛋白編碼基因共有21 379 個(gè)密碼子（不包含終止密碼子）。由圖2 可知，數(shù)量最多的3 個(gè)氨基酸分別是絲氨酸（2 275）、亮氨酸（1 973）和精氨酸（1 770），而數(shù)量最少的3 個(gè)分別為蛋氨酸（374）、色氨酸（485）和纈氨酸（497）。在30 個(gè)最常見(jiàn)的密碼子（RSCU ＞1）中，絕大多數(shù)以A 或U 結(jié)尾，只有UUG 和AGG 以G 結(jié)尾。相反，在32 個(gè)最不常見(jiàn)的密碼子（RSCU ＜1）中，僅有UUC、CUA、AUA 不 以C 或G 結(jié) 尾。此 外，AUG 和UGG 沒(méi)有密碼子偏向性（RSCU=1）。

圖2 基于肖蒲桃葉綠體中78 個(gè)蛋白編碼基因的氨基酸頻率Fig.2 Amino acid frequency based on 78 protein-coding genes of Syzygium acuminatissimum chloroplast

肖蒲桃葉綠體基因組中共有47 個(gè)RNA 可編輯位點(diǎn)（表3），其中約1/3（15 個(gè)）的RNA 可編輯位點(diǎn)可將絲氨酸轉(zhuǎn)化為亮氨酸。在ndhB基因檢測(cè)到的RNA 可編輯位點(diǎn)最多（10 個(gè)），其次是ndhD（5 個(gè)）和matK（4 個(gè)）。大多數(shù)氨基酸的轉(zhuǎn)化是從極性基團(tuán)變?yōu)榉菢O性基團(tuán)，而只有兩個(gè)位點(diǎn)的氨基酸基團(tuán)從非極性變?yōu)闃O性（脯氨酸轉(zhuǎn)化為絲氨酸），其中一個(gè)位于psbE基因、另一個(gè)位于rpoC1基因。

表3 肖蒲桃葉綠體基因組中的RNA 可編輯位點(diǎn)Table 3 RNA editable sites in the chloroplast genome of Syzygium acuminatissimum

在肖蒲桃葉綠體基因組中共檢測(cè)到48 個(gè)長(zhǎng)片段重復(fù)，其中18 個(gè)正向重復(fù)、6 個(gè)反向重復(fù)、22 個(gè)回文重復(fù)和2 個(gè)互補(bǔ)重復(fù)。長(zhǎng)片段重復(fù)的長(zhǎng)度范圍在19～42 bp 之間，其中長(zhǎng)度為19 bp 的重復(fù)最多（14 個(gè)）、其次是22 bp（8 個(gè)），而42 bp 的最少（1 個(gè)）。

在肖蒲桃葉綠體基因組中共檢測(cè)到230 個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列，其中絕大多數(shù)為單核苷酸重復(fù)（205個(gè)），其次為四核苷酸重復(fù)（12 個(gè)）、三核苷酸重復(fù)（7 個(gè)），雙核苷酸重復(fù)（4 個(gè)）和四核苷酸重復(fù)（2 個(gè)）較少，未檢測(cè)到六核苷酸重復(fù)。所有簡(jiǎn)單重復(fù)序列中，最長(zhǎng)為17 bp，最短僅有8 bp。

2.3 蒲桃屬葉綠體基因組比較與序列變異

由圖3 可知，4 個(gè)蒲桃屬植物的rps19 基因均跨越LSC 和IRb 邊界；rpl2基因完全位于IRb；丁香蒲桃的ndhF基因跨越IRb 和SSC；ycf1基因均跨越SSC 和IRa；丁香蒲桃和肖蒲桃的trnH基因跨越IRa 和LSC，而海南蒲桃和滇邊蒲桃的trnH基因則完全位于LSC 中。

圖3 4 種蒲桃屬植物葉綠體基因組的4 個(gè)連接邊界Fig.3 Four junction boundaries of the chloroplast genomes of four Syzygium plants

肖蒲桃葉綠體基因組的平均核苷酸多樣性π值為0.00453，檢測(cè)到7個(gè)π值較高的區(qū)域，包括trnH-psbA、trnG-psaB、trnP-rpl33、rpl2-trnM、ndhF、ndhA、trnN-rrn23（圖4），其中2個(gè)位于基因區(qū)、5個(gè)位于基因間隔區(qū)。

圖4 4 種蒲桃屬植物葉綠體基因組的核苷酸多樣性Fig.4 Nucleotide diversity of the chloroplast genomes of four Syzygium plants

2.4 肖蒲桃的系統(tǒng)發(fā)育分析

為了解肖蒲桃在桃金娘科中的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，從桃金娘科中選擇11 個(gè)物種作為主群體，從菊科中選擇2 個(gè)物種作為外類群?；?8 個(gè)共有蛋白編碼基因，采用RAxML 構(gòu)建了具有1 000 個(gè)bootstrap 的最大似然樹(shù)（圖5），結(jié)果表明肖蒲桃與丁香蒲桃關(guān)系密切。

圖5 基于13 種植物葉綠體基因組的最大似然樹(shù)Fig.5 Maximum likelihood tree based on the chloroplast genomes of 13 species

3 討論

在高等植物葉綠體基因組中，通常具有長(zhǎng)度為120～160 kb 的序列、典型的四分結(jié)構(gòu)［30］。肖蒲桃葉綠體基因組也不例外，其葉綠體基因組長(zhǎng)度為159 352 bp，總GC 含量為36.89%，大單拷貝、小單拷貝和反向重復(fù)區(qū)的GC 含量分別為34.73%、30.63%和42.66%。與大多數(shù)被子植物相似，反向重復(fù)區(qū)的高GC 含量可能由于該區(qū)域的rRNA 序列GC 含量較高而引起［31］。

肖蒲桃葉綠體基因組的蛋白編碼基因中共有21 379 個(gè)密碼子，在RSCU ＞1 的密碼子中，除了UUG 外，其余密碼子均以A 或U 結(jié)尾，這與罌粟［31］和紫荊澤蘭［32］相同。在蛋白編碼基因中共檢測(cè)到47 個(gè)可被編輯的RNA 位點(diǎn)。其中大部分氨基酸可從絲氨酸轉(zhuǎn)換為亮氨酸，而ndhB基因中的可編輯位點(diǎn)最多（10/47），在連翹（Forsythia suspensa）［33］和刺柏（Sanionia uncinata）［34］中也有相似研究結(jié)果。葉綠體簡(jiǎn)單重復(fù)序列是一種有效的分子標(biāo)記，常用于群體遺傳學(xué)、生物地理學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育評(píng)估［35-36］等研究。在肖蒲桃葉綠體基因組中，絕大多數(shù)為單核苷酸重復(fù)（205/230），與大多數(shù)研究結(jié)果［37-39］一致。

由進(jìn)化事件引起的反向重復(fù)區(qū)的變化導(dǎo)致邊界和基因組大小發(fā)生細(xì)微變動(dòng)，增加了物種的遺傳多樣性［40］。在本研究中，肖蒲桃、海南蒲桃、丁香蒲桃、滇邊蒲桃4 個(gè)蒲桃屬植物的連接邊界情況稍有不同，這可能與蒲桃屬植物物種繁多、擁有豐富的遺傳多樣性有關(guān)［41］。

DNA條碼廣泛應(yīng)用于植物鑒定研究［42］。然而在蒲桃屬中，僅有少數(shù)幾個(gè)區(qū)間用于物種鑒定，如matK、ndhF、rpl16、atpB-rbcL、trnL-F等［16,43-44］。本研究通過(guò)計(jì)算π值發(fā)現(xiàn)，反向重復(fù)區(qū)比大單拷貝區(qū)和小單拷貝區(qū)區(qū)的保守性更高，該結(jié)果與其他被子植物一致［30,45］；此外，獲得7個(gè)π值高于0.015的區(qū)域，包括trnH-psbA、trnG-psaB、trnP-rpl33、rpl2-trnM、ndhF、ndhA、trnN-rrn23，這些信息將為未來(lái)的物種鑒定提供依據(jù)。

蒲桃屬物種繁多，為該屬的物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究帶來(lái)極大難度［1］。本研究構(gòu)建的桃金娘科進(jìn)化樹(shù)結(jié)果與 Biffin 等［16］基于3 個(gè)葉綠體片段得到的蒲桃屬系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果一致，肖蒲桃與丁香蒲桃的親緣關(guān)系較近。但由于蒲桃屬植物數(shù)量較多，目前僅有的數(shù)據(jù)并不能準(zhǔn)確說(shuō)明肖蒲桃在蒲桃屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中的準(zhǔn)確位置，今后仍需獲取更全面的數(shù)據(jù)進(jìn)行深入研究分析。

4 結(jié)論

本 研究利用高通量測(cè)序，組裝和注釋了肖蒲桃完整的葉綠體基因組，并解析了該基因組的結(jié)構(gòu)特征和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)果表明肖蒲桃葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)特征與其他蒲桃屬植物相似，具有典型的四分結(jié)構(gòu)，共檢測(cè)到109 個(gè)基因、21 379個(gè)密碼子、47 個(gè)RNA 可編輯位點(diǎn)、48 個(gè)長(zhǎng)片段重復(fù)、230 個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列?；蚪M比較分析表明，4 個(gè)蒲桃屬植物的IR 邊界有較小差異，核苷酸多樣性高于0.015 的區(qū)間有7 個(gè)。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析表明，肖蒲桃與丁香蒲桃的親緣關(guān)系較近。