李 英，吳慶華，楊華林，李 利，余知和，王 允

（長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

【研究意義】植物多酚是廣泛存在于植物體內(nèi)的具有大量酚羥基結(jié)構(gòu)單元的植物次生代謝產(chǎn)物，在傳統(tǒng)工業(yè)中具有多種用途。近年來多酚的結(jié)構(gòu)已被深入揭示［1］。多酚主要包括阿魏酸、水楊酸、咖啡酸等小分子酚酸類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)以及單寧類大分子物質(zhì)，在谷類、蔬菜、水果、茶和紅酒等日常食品中廣泛存在膳食多酚。膳食多酚中最常見的酚酸類物質(zhì)主要包括咖啡酸和阿魏酸，咖啡酸主要存在于蔬菜、水果中，而阿魏酸則主要存在于麥麩等谷類物質(zhì)中［2］。阿魏酸是桂皮酸的衍生物，在植物細(xì)胞壁中與多糖和蛋白質(zhì)結(jié)合，雖然含量很大，但不容易釋放，需要經(jīng)過消化或微生物水解后才可以被利用，因此膳食中的阿魏酸并沒有被充分利用。研究表明，膳食多酚具有抗氧化、促進(jìn)損傷修復(fù)、消炎、解毒、增強(qiáng)免疫功能等多種生物學(xué)活性，攝入富含多酚類的食物可降低多種慢性疾病的發(fā)生［3-5］。

【前人研究進(jìn)展】腸道微生物能夠合成人體生長發(fā)育所必需的維生素，并參與糖類、蛋白質(zhì)和脂肪的代謝。菌群組成在體內(nèi)維持平衡，一旦失衡會(huì)引起多種疾?。?-8］。研究表明，腸道微生物與動(dòng)物及人類的健康關(guān)系密切，與肥胖、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)和癌癥治療甚至與嬰兒的智商和精神類疾病相關(guān)［9-11］。在不同條件下，腸道菌群的組成存在微妙的變化。研究發(fā)現(xiàn)，過度肥胖患者的腸道中壁厚菌門與變形菌門的豐度比顯著提高［12-13］。而腸炎患者、腸易激綜合征患者的腸道微生物總量升高，多樣性顯著降低，壁厚菌門與變形菌門的豐度比明顯降低［14-15］。IIllumina 測(cè)序方法確保了高精確度和真實(shí)的單堿基連續(xù)測(cè)序，為同重復(fù)序列的測(cè)定提供了很好的解決方案，能夠在不同水平上對(duì)環(huán)境微生物的組成進(jìn)行分析［16］。

腸道菌群維持在一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，抗生素濫用會(huì)破壞種群平衡，增加炎癥性疾病風(fēng)險(xiǎn)。酚類物質(zhì)因其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和聚合度，在小腸吸收量非常小，大部分多酚類物質(zhì)會(huì)在結(jié)腸內(nèi)微生物的作用下被消化并被機(jī)體吸收［17］。不同多酚類物質(zhì)對(duì)不同菌群增殖有促進(jìn)或抑制作用，從而對(duì)腸道菌群的結(jié)構(gòu)和數(shù)量產(chǎn)生影響。果蔬多酚、茶多酚中的兒茶素以及蛋白核小球藻的活性生長因子均能促進(jìn)益生菌生長，抑制類桿菌、葡萄球菌等有害菌生長，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，從而對(duì)人體的健康起調(diào)節(jié)作用［18］。【本研究切入點(diǎn)】多酚與腸道微生物存在相互促進(jìn)作用，一方面膳食多酚可促進(jìn)益生菌生長，抑制有害菌增殖，另一方面益生菌產(chǎn)生的益生元又能促進(jìn)多酚在結(jié)腸中的吸收。目前，關(guān)于多酚與腸道微生物的相互作用研究比較多，但有關(guān)多酚對(duì)抗生素應(yīng)激狀態(tài)下動(dòng)物的腸道微生物影響還未見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)主要通過各種試劑盒檢測(cè)小鼠血清中的生化和氧化相關(guān)酶類指標(biāo)，并利用高通量測(cè)序分析其腸道微生物群落，研究了谷類多酚的主要物質(zhì)阿魏酸對(duì)抗生素應(yīng)激小鼠的血清抗氧化性及其腸道微生物群落多樣性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

阿魏酸、土霉素、紅霉素、頭孢羥氨芐，購自上海Macklin 生化科技有限公司（中國）；血清總蛋白試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒、谷胱甘肽（GSH-PX）試劑盒、抗氧化活性（T-AOC）試劑盒、一氧化氮合酶（T-NOS）試劑盒、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（I-NOS）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。QIAamp DNA Stool Mini Kit，購自Qiagen 公司（德國）；其他試劑為國產(chǎn)分析純。30 只42 日齡KM 雄性小鼠，體重20（±2）g，由廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)分組處理 試驗(yàn)于2020 年11 月在湖北省長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院進(jìn)行。30 只KM 雄性小鼠在溫度20～22 ℃、濕度45%～55%的無菌潔凈環(huán)境中適應(yīng)喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、抗生素組、抗生素+阿魏酸組。每天灌喂對(duì)照組和抗生素組小鼠去離子水500 mg/kg，灌喂抗生素+阿魏酸組小鼠阿魏酸500 mg/kg，持續(xù)灌喂4 周，每天保持正常飲水與進(jìn)食。第5 周開始在給予抗生素+阿魏酸組小鼠阿魏酸的同時(shí)，給抗生素組、抗生素+阿魏酸組灌喂混合抗生素，小鼠每天攝入的混合抗生素包含頭孢羥氨芐100 mg/kg、土霉素300 mg/kg、紅霉素300 mg/kg，每天灌喂1 次，連續(xù)灌喂7 d，每天保持正常飲水與進(jìn)食。

1.2.2 樣品采集 試驗(yàn)35 d 后剪掉小鼠胡須，摘除眼球采血，頸椎脫臼處死小鼠，并解剖取肝臟、脾臟、盲腸及其內(nèi)容物。用1.5 mL 離心管從小鼠左右眼眶處接取原血，冷凍離心機(jī)3 500 r/min 離心10 min 后取上清液即為血清。解剖取出小鼠脾臟，立即放入0.9%生理鹽水中洗凈，并分別放進(jìn)5 mL 離心管中置于冰上備用。新鮮取出的盲腸立即用5 mL 離心管盛裝并置于冰上，取出內(nèi)容物放入錫箔紙，并裝入5 mL 離心管，液氮速凍，置于-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.3 生化指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)測(cè)定 測(cè)定小鼠的血清總蛋白、T-AOC、CAT、T-SOD、GSH-PX、MDA、T-NOS、I-NOS，嚴(yán)格按照各試劑盒說明操作，并計(jì)算各指標(biāo)值。

1.2.4 小鼠腸道菌群鑒定 每組各取5 只小鼠的盲腸，將待測(cè)樣品交派森諾生物科技有限公司（中國）進(jìn)行腸道菌群鑒定分析。流程如下：首先提取樣品細(xì)菌總DNA，然后以微生物核糖體RNA目標(biāo)序列為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)16S rDNA 的V3～V4 區(qū)的特異性引物，等溫?cái)U(kuò)增構(gòu)建文庫。構(gòu)建好的文庫經(jīng)梯度稀釋，利用Illumina MiSeq 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，每組做4 次重復(fù)。

1.2.5 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析處理 測(cè)序數(shù)據(jù)先通過QIIME 軟件識(shí)別疑問序列，剔除不合格的序列。隨后用USEARCH 軟件檢查并剔除嵌合體序列。通過UCLUST 軟件對(duì)獲得的合格序列以97%的序列相似度進(jìn)行操作分類單位（Operational taxonomic unit，OTU）劃分，獲得每個(gè)OTU 分類學(xué)信息［19］。并利用R 軟件進(jìn)行樣本的Alpha 多樣性分析及基于UniFrac 距離的PCoA 主坐標(biāo)分析，對(duì)小鼠腸道微生物進(jìn)行菌群比較和關(guān)鍵物種篩選。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS13.0 軟件進(jìn)行方差分析，并通過Tukey’s 進(jìn)行多重比較。當(dāng)P＜0.05 則認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿魏酸對(duì)小鼠體重的影響

經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，各組小鼠的攝食量和平均體重如圖1 所示。試驗(yàn)期間，各組小鼠的攝食量無明顯差異，體重呈現(xiàn)穩(wěn)步增長的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，灌喂膳食多酚阿魏酸的小鼠體重?zé)o明顯差異，說明在正常飲食的情況下，多酚對(duì)小鼠體重?zé)o顯著影響。在第5 周開始對(duì)抗生素組和抗生素+阿魏酸組小鼠灌喂抗生素，抗生素組小鼠體重略微下降，但與對(duì)照組和抗生素+阿魏酸組小鼠的體重?zé)o顯著差異。脾臟是重要的免疫器官，免疫器官指數(shù)是評(píng)價(jià)動(dòng)物免疫狀況的關(guān)鍵指標(biāo)之一，本研究參考甘霓等［20］的方法計(jì)算對(duì)照組、抗生素組、抗生素+阿魏酸組小鼠的脾臟指數(shù)，分別為5.38±0.18、4.28±0.22、5.54±0.63 mg/g?？股貞?yīng)激小鼠的脾臟指數(shù)顯著低于對(duì)照組，說明抗生素對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了一定影響，而加入阿魏酸飼喂，小鼠的脾臟指數(shù)得到了一定程度的恢復(fù)。

圖1 不同處理小鼠的攝食量和平均體重變化Fig.1 Changes of food intake and average body weight of mice in different groups

2.2 阿魏酸對(duì)小鼠血清抗氧化性的影響

試驗(yàn)35 d 后分別取對(duì)照組、抗生素組和抗生素+阿魏酸組小鼠的血清測(cè)定血清總蛋白、T-AOC、CAT、T-SOD、GSH-PX、MDA、T-NOS和I-NOS 等指標(biāo)。血清總蛋白來自食物吸收和肝臟合成，其功能是維持血液滲透壓，并與物質(zhì)運(yùn)輸，尤其是脂類轉(zhuǎn)運(yùn)功能相關(guān)。本研究3 個(gè)處理組小鼠的血清總蛋白含量沒有顯著差異（圖2A）。由圖2B 可知，抗生素組小鼠的總抗氧化能力相比于對(duì)照顯著下降，而抗生素+阿魏酸組與對(duì)照無顯著差異，相比抗生素組提高了56.36%。為明確具體哪些抗氧化因子與總抗氧化性的恢復(fù)相關(guān)，進(jìn)一步測(cè)定CAT、T-SOD、GSHPX、MDA（圖2C～F）。CAT 在不同處理中無顯著差異，而T-SOD 和GSH-PX 在抗生素組中的活性明顯降低，阿魏酸對(duì)小鼠抗生素的負(fù)荷起到顯著的改善效果，而且相比對(duì)照組，抗生素+阿魏酸組的T-SOD 和GSH-PX 活性還分別提高20.50%和26.27%。此外，相比對(duì)照組，抗生素組小鼠血清中的MDA 含量提升87.76%。

圖2 阿魏酸對(duì)抗生素應(yīng)激小鼠血清抗氧化性的影響Fig.2 Effect of ferulic acid on serum antioxidation in antibiotic stressed mice

T-NOS 有3 種亞型同功酶，分別為神經(jīng)元型一氧化氮合酶（N-NOS）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（E-OS）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（I-NOS）。I-NOS僅在損傷后誘導(dǎo)表達(dá)，激活后可誘導(dǎo)動(dòng)物持續(xù)大量釋放過量的一氧化氮，活性氮氧增多引起脂質(zhì)過氧化，誘發(fā)炎癥反應(yīng)［21］。由圖2G、H 可知，無論T-NOS 還是I-NOS 在不同處理組中均表現(xiàn)出相同趨勢(shì)，相對(duì)于對(duì)照組，抗生素組兩種酶的活性分別提高了32.36%和85.89%，而抗生素+阿魏酸組能夠顯著消除抗生素所帶來的影響，與對(duì)照組無顯著差異。

2.3 小鼠腸道菌群的Alpha 多樣性分析

本試驗(yàn)分別隨機(jī)選取了對(duì)照組、抗生素組和抗生素+阿魏酸組小鼠盲腸內(nèi)容物通過Illumina MiSeq 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。ACE 估計(jì)指數(shù)和Chao1 估計(jì)指數(shù)側(cè)重于描述群落的豐富度，指數(shù)越高表明群落的豐富度越高。Simpson 指數(shù)和Shannon 指數(shù)更側(cè)重于描述群落的多樣性，指數(shù)越高表明其多樣性越高。而本研究得到對(duì)照組、抗生素組和抗生素+阿魏酸組的Chao1 指數(shù)分別為1 362.44、333.75 和299.01，Shannon 指數(shù)分別為7.71、3.70 和4.41?？梢?，抗生素組相對(duì)于對(duì)照組的Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)均顯著降低，且抗生素+阿魏酸組與抗生素組無顯著差異。結(jié)果表明，抗生素應(yīng)激小鼠的腸道微生物的豐度和多樣性均下降，而添加阿魏酸并未能改善抗生素應(yīng)激的影響。由圖3 可見，抗生素組和抗生素+阿魏酸組的OUT 受抗生素影響，且相比于對(duì)照組有明顯降低，抗生素組和抗生素+阿魏酸組仍然具有259、215 個(gè)獨(dú)有的OUT，這揭示了抗生素和阿魏酸可能對(duì)小鼠腸道微生物群落的具體組成產(chǎn)生影響。

圖3 小鼠腸道菌群OTU 的Venn 圖Fig.3 Venn map of intestinal microflora in mice

2.4 小鼠腸道菌群的Beta 多樣性分析

為分析不同樣本之間的群落結(jié)構(gòu)相似性，對(duì)小鼠腸道菌群進(jìn)行Beta 多樣性分析，通過比較群落各自獨(dú)有OTU 之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，反映微生物群落之間的相似度。UniFrac 距離有Unweighted和Weighted 兩種，Unweighted 僅表示OTU 在樣本中是否存在，而Weighted 則兼顧群落組分之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和豐度。由圖4 可見，腸道菌群結(jié)構(gòu)相近的樣本有聚集的傾向，說明群落成員組成和豐度均存在顯著性差異。

圖4 小鼠腸道菌群Unweighted UniFrac 距離（A）和Weighted UniFrac 距離（B）的PCoA 主坐標(biāo)分析Fig.4 PCoA plots of Unweighted UniFrac distance values（A）and Weighted UniFrac distance values（B）of intestinal microflora in mice

2.5 小鼠腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

在門水平上，硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和TM7 門微生物占微生物總量的98.6%?？股亟M的擬桿菌門、TM7 門微生物在抗生素的作用下幾乎消失，抗生素+阿魏酸組相比于抗生素組，硬壁菌門、變形菌門的豐度比值發(fā)生了變化（圖5）。在屬水平上，由于Illumina MiSeq 測(cè)序長度的限制，導(dǎo)致很多腸道微生物不能鑒定至屬，因此大量的屬被歸類在其他組內(nèi)。由圖5 可以看出，對(duì)照組的群落組成具有多樣性，而抗生素組和抗生素+阿魏酸組則較為單一，優(yōu)勢(shì)屬分別為腸球菌屬（Enterococcus）、梭菌屬（Clostridium）和檸檬酸桿菌屬（Citrobacter），相比于抗生素組，抗生素+阿魏酸組的梭菌屬豐度顯著提升。

圖5 小鼠腸道微生物在門（A）和屬（B）水平上的相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of intestinal microflora in mice at the phylum（A）and genus（B）level

2.6 小鼠腸道微生物菌群差異物種比較

采用Metastats 算法［22］，分別在門和屬水平上對(duì)OTU 的組間絕對(duì)豐度差異進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果（表1）顯示，在門水平上，對(duì)照組與抗生素組有4 個(gè)門存在差異，對(duì)照組與抗生素+阿魏酸組有5 個(gè)門存在差異，而抗生素組與抗生素+阿魏酸組間無差異；在屬水平上，對(duì)照組與抗生素組有16 個(gè)屬存在差異，對(duì)照組與抗生素+阿魏酸組有20 個(gè)屬存在差異，抗生素組與抗生素+阿魏酸組有14 個(gè)屬存在差異。圖6 所示為屬水平上對(duì)照組、抗生素組和抗生素+阿魏酸組之間差異最顯著的前20 個(gè)OTU 的小提琴圖。抗生素組和抗生素+阿魏酸組有存在顯著差異的14 個(gè)屬包括梭菌屬（Clostridium）、腸球菌屬（Enterococcus）、沙雷菌屬（Serratia）、毛球菌屬（Trichococcus）、變形桿菌屬（Proteus）、異葉藻屬（Isobaculum）、污水菌屬（Aquamicrobium）、鞘脂菌屬（Sphingobium）、腸桿菌屬（Enterobacter）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、費(fèi)克藍(lán)姆菌屬（Facklamia）、短 桿 菌 屬（Brevibacterium）、芽胞八疊球菌屬（Sporosarcina）和棒桿菌屬（Corynebacterium）。

圖6 小鼠腸道微生物菌群組間屬水平差異最顯著的前20 個(gè)OTU 豐度分布Fig.6 Abundance distribution of 20 OTU with the most significant difference at genus level among different groups of intestinal microflora in mice

表1 小鼠腸道微生物菌群組間的Metastats兩兩比較檢驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of Metastats pairwise comparison test results between different groups of intestinal microflora in mice

3 討論

3.1 阿魏酸對(duì)抗生素應(yīng)激小鼠生長和抗氧化能力的影響

本研究供試的3 組小鼠在體重變化趨勢(shì)上無明顯差異，進(jìn)行抗生素灌喂前小鼠活躍好動(dòng)，有互相打架現(xiàn)象，飲食量各組間無顯著差異，糞便呈黑色、較硬?？股毓辔购?，抗生素組出現(xiàn)嗜睡、懶動(dòng)的癥狀，糞便呈米黃色、軟糯；抗生素+阿魏酸組可能由于有膳食多酚的干預(yù)，相比抗生素組更為活躍。

自由基的過氧化效應(yīng)與基因突變、色素形成、組織硬化、細(xì)胞損傷有關(guān)。動(dòng)物機(jī)體具有氧化還原酶及防護(hù)系統(tǒng)，在終止過氧化的同時(shí)修復(fù)組織和細(xì)胞。機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜且完善的系統(tǒng)，而抗生素濫用會(huì)破壞腸道微生物種群平衡，進(jìn)而影響機(jī)體的抗氧化性及其他機(jī)能，增加各類疾病風(fēng)險(xiǎn)。T-AOC 可直接反映機(jī)體抗氧化能力。CAT 是生物體內(nèi)主要的抗氧化酶之一，能夠催化過氧化氫分解生成氧氣和水，T-SOD 對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起至關(guān)重要的作用，能清除氧離子自由基，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧離子的傷害。GSH-PX 蛋白具有清除脂質(zhì)過氧化物的功能，可以通過其酶活性降低脂質(zhì)過氧化物的毒性，維持膜脂質(zhì)雙分子層的穩(wěn)態(tài)。本研究抗生素組小鼠連續(xù)1 周混合抗生素飼喂后，小鼠的總抗氧化能力T-AOC 減弱，說明抗生素會(huì)導(dǎo)致小鼠脂質(zhì)氧化進(jìn)而影響其代謝功能，而使用膳食多酚阿魏酸能夠使其血液脂質(zhì)氧化水平維持在對(duì)照組相近水平，降低抗生素所帶來的部分負(fù)面影響?？股?阿魏酸組的T-SOD 和GSH-PX 活性與對(duì)照組相近，說明攝入一定時(shí)間阿魏酸后小鼠可以通過提高T-SOD 和GSH-PX 活性顯著提高其血液的抗氧化能力。機(jī)體在逆境下往往發(fā)生膜脂過氧化反應(yīng)，MDA 是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量可以反映損傷程度。MDA 從膜上產(chǎn)生，改變膜的通透性，使得細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能受到損傷，釋放后可以使體內(nèi)活性物質(zhì)喪失功能，包括抑制蛋白質(zhì)合成?？股厥剐∈篌w內(nèi)的MDA 含量提升了87.76%，這種負(fù)面影響能夠通過多酚阿魏酸的攝入恢復(fù)至對(duì)照水平。

3.2 阿魏酸對(duì)NO 信號(hào)的影響

NO 是細(xì)胞中的抑制性信號(hào)分子之一，作用于腸道平滑肌，能夠抑制腸道的收縮蠕動(dòng)［23-24］。作為信使分子，NO 在動(dòng)物體內(nèi)的功能多樣，包括促進(jìn)血管擴(kuò)張、抑制血小板聚集、抑制細(xì)胞增殖，對(duì)細(xì)胞凋亡具有雙重影響，還與糖尿病、心血管疾病、癌癥等相關(guān)［25］。在氧化應(yīng)激或炎癥等情況下，細(xì)胞內(nèi)的一氧化氮合酶（NOS）可持續(xù)催化合成大量的NO，高濃度的NO 參與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及免疫信號(hào)傳導(dǎo)，在不同濃度下能夠?qū)C(jī)體產(chǎn)生多方面影響［26］。王建民等［27］研究顯示，通過特定的藥物可使大鼠血清中的NO、NOS 水平顯著提升，而通過中藥益氣健脾干預(yù)治療后，大鼠的排泄癥狀得到明顯改善，相應(yīng)的信號(hào)分子NO 的含量及NOS 的活性顯著降低。本研究結(jié)果與該結(jié)論相符，受抗生素影響，T-NOS和I-NOS 的水平明顯上升，膳食多酚阿魏酸干預(yù)能夠降低小鼠受抗生素的影響，糞便由米黃色、軟糯轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏?、較硬的正常狀態(tài)，且小鼠運(yùn)動(dòng)活力明顯恢復(fù)，與對(duì)照小鼠無明顯差異。

3.3 阿魏酸對(duì)小鼠腸道微生物群落組成的影響

腸道菌群微生態(tài)失衡會(huì)引起機(jī)體出現(xiàn)免疫性疾病、代謝性疾病和消化性疾病，多酚對(duì)維持腸道微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)有較大作用［28-29］。小鼠的胃和小腸細(xì)菌相對(duì)較少，盲腸內(nèi)空物中主要以兼性厭氧菌為主，是微生物最豐富的位置，微生物的構(gòu)成和糞便微生物的組成更接近，在腸道群落的分析方面具有一定代表性。本研究對(duì)小鼠腸道微生物的16S rDNA 進(jìn)行高通量測(cè)序，Alpha 多樣性分析表明，抗生素的使用使小鼠腸道微生物的豐度和多樣性顯著降低，阿魏酸的攝入并未改變樣品的豐度和多樣性，進(jìn)一步的Beta 多樣性分析顯示，腸道菌群結(jié)構(gòu)相近的樣本有聚集的傾向，說明群落成員在樣品組成上存在差異?？股氐氖褂脤?dǎo)致擬桿菌門和TM7 門的微生物基本消失，阿魏酸的攝入使抗生素應(yīng)激小鼠體內(nèi)的厚壁菌門與變形菌門的豐度比顯著降低。Méndez-Salazar 等［30］也發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門與變形菌門的豐度比與糖脂代謝和炎癥反應(yīng)相關(guān)，該豐度比值高時(shí)表明腸道菌群豐度較低，反之菌群豐度較高，且與脂代謝相關(guān)。TM7 是發(fā)現(xiàn)于自然環(huán)境中的革蘭氏陽性不可培養(yǎng)細(xì)菌的一個(gè)亞群，據(jù)報(bào)道TM7 的增殖與炎癥反應(yīng)具有重要關(guān)聯(lián)［31］。本研究在屬水平上可明顯觀察到，阿魏酸使抗生素應(yīng)激小鼠的梭菌屬豐度顯著增加。賈增增［32］研究發(fā)現(xiàn)，梭菌屬能夠通過調(diào)節(jié)腸道內(nèi)5-羥色胺的含量進(jìn)而對(duì)消化過程起促進(jìn)作用。

本研究樣品組間差異性分析結(jié)果展示了在屬水平上樣本組間差異最顯著的前20 個(gè)OTU 的豐度分布結(jié)果。芽胞八疊球菌屬能夠產(chǎn)生甘露聚糖酶、果膠酶等多種酶，并有報(bào)道其與白云石晶體形成相關(guān)［33］。本研究發(fā)現(xiàn)抗生素+阿魏酸組相對(duì)于抗生素組對(duì)菌群物種組成有明顯的調(diào)節(jié)作用。腸球菌屬是腸道內(nèi)常見的一種條件致病菌，適量的菌體能發(fā)酵乳糖產(chǎn)乳酸，但當(dāng)機(jī)體免疫缺陷時(shí)會(huì)引起化膿感染［34］。由于其對(duì)多種抗生素表現(xiàn)出固有耐藥性，抗生素組和抗生素+阿魏酸組的腸球菌屬豐度相比于對(duì)照均顯著提高，且抗生素+阿魏酸組的豐度又顯著低于抗生素組，說明阿魏酸可能通過抑制腸球菌屬的過度增殖達(dá)到抑制腸道感染的作用?？股?阿魏酸組的變形桿菌屬豐度相對(duì)其他兩組均有顯著提高，變形桿菌屬為腸道正常菌群，一般情況不致病，在無氧環(huán)境下能夠發(fā)酵纖維素和低聚寡糖產(chǎn)生短鏈脂肪酸，其丙酸、丁酸等能夠?qū)δc道的代謝和炎癥反應(yīng)產(chǎn)生積極影響［35］。

4 結(jié)論

阿魏酸能夠顯著消除抗生素所帶來的部分負(fù)面影響，包括上調(diào)多種與抗氧化活性相關(guān)的基因，使小鼠總抗氧化性水平相比抗生素組提高了56.36%，降低體內(nèi)脂質(zhì)氧化水平，并通過NOS 調(diào)控NO 的合成，刺激腸道收縮蠕動(dòng)而促進(jìn)消化?？股厥剐∈蟮钠⑴K指數(shù)降低（4.28±0.22 mg/g），而阿魏酸使脾臟指數(shù)恢復(fù)至與對(duì)照組相近的水平（5.54±0.63 mg/g），說明阿魏酸對(duì)免疫器官起一定的正調(diào)節(jié)作用?？股貙?duì)小鼠的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響，導(dǎo)致腸道微生物群落的豐度和多樣性均顯著降低，阿魏酸能夠通過提高變形菌門與厚壁菌門的豐度比例，顯著提高梭菌屬并降低芽胞八疊球菌屬和腸桿菌屬豐度等多種方式，對(duì)腸道代謝、腸道微生態(tài)平衡和炎癥反應(yīng)等進(jìn)行調(diào)控。本研究結(jié)果為阿魏酸作為改善因抗生素導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力降低及菌群失調(diào)的微生態(tài)制劑提供了理論基礎(chǔ)。