劉志偉，鐘國(guó)輝，王永躍，王興民，畢可可

（1.廣州市林業(yè)和園林科學(xué)研究院，廣東 廣州 501405；2.龍門(mén)縣林業(yè)局，廣東 龍門(mén) 516800；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物防治教育部工程研究中心，廣東 廣州 510642）

【研究意義】龜紋瓢蟲(chóng)（Propylea japonica）屬鞘翅目瓢蟲(chóng)科瓢蟲(chóng)族龜紋瓢蟲(chóng)屬，廣泛分布于我國(guó)南北各地［1］，是蚜蟲(chóng)的重要天敵［2-4］，也捕食蚧殼蟲(chóng)、草地貪夜蛾、木虱［5-7］，具有耐高溫、繁殖力強(qiáng)、對(duì)多種農(nóng)藥表現(xiàn)高耐受性等優(yōu)點(diǎn)［8-10］，是農(nóng)林業(yè)重要天敵昆蟲(chóng)，具有很大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。要實(shí)現(xiàn)龜紋瓢蟲(chóng)大規(guī)模生物防治，人工繁殖非常重要，而生殖系統(tǒng)和卵子發(fā)生相關(guān)研究將為人工繁殖提供理論依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】昆蟲(chóng)卵巢管有無(wú)滋式和具滋式兩種類(lèi)型［11］，其中具滋式又劃分為端滋式和多滋式［12］。無(wú)滋式指卵巢管內(nèi)無(wú)滋養(yǎng)細(xì)胞，濾泡細(xì)胞和血淋巴為卵細(xì)胞發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和RNA，少量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由卵細(xì)胞自身合［13-14］。端滋式卵巢管中，滋養(yǎng)細(xì)胞集中在卵巢管前段的生殖區(qū)，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)索向卵母細(xì)胞輸送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［15］。多滋式卵巢管中，濾泡細(xì)胞分布在整個(gè)卵巢管，通過(guò)胞內(nèi)連絲將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和RNA 輸入卵母細(xì)胞［14］。國(guó)內(nèi)外對(duì)瓢蟲(chóng)生殖系統(tǒng)和卵子發(fā)生已有研究，Mpakou 等［16］闡述了二星瓢蟲(chóng)（Adalia bipunctata Linnaeus）卵子發(fā)生過(guò)程中細(xì)胞凋亡的3 種類(lèi)型，分別為細(xì)胞程序死亡、細(xì)胞自噬和細(xì)胞質(zhì)死亡；Maffei 等［17］發(fā)現(xiàn)Eriopis connexa為端滋式卵巢管；Osawa［18］研究了在食物匱乏情況下，異色瓢蟲(chóng)卵巢管重新吸收卵細(xì)胞；陳潔等［19］根據(jù)卵母細(xì)胞所在位置、體積、形態(tài)和細(xì)胞核的變化，滋養(yǎng)細(xì)胞和濾泡細(xì)胞的形態(tài)變化，以及卵黃沉積、分布情況將異色瓢蟲(chóng)（Harmonia axyridis Pallas）卵子發(fā)生劃分為3 個(gè)時(shí)期7 個(gè)階段；此外，小黑瓢蟲(chóng)（Delphastus catalinae）、七星瓢蟲(chóng)（Coccinella septempunctataL.）、孟氏隱唇瓢蟲(chóng)（Cryptolaemus montrouzieri）也有生殖系統(tǒng)觀察研究［20-22］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】有關(guān)龜紋瓢蟲(chóng)的研究由來(lái)已久，主要在生物防治［23］、耐藥性［10,24］、人工飼料［25］等方面，但還未形成規(guī)?；纳锓乐螒?yīng)用，大量繁殖是實(shí)現(xiàn)生物防治應(yīng)用的基礎(chǔ)，而研究相對(duì)匱乏的生殖系統(tǒng)對(duì)繁殖非常重要?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究在張?zhí)熹龋?6］研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合查閱相關(guān)資料，應(yīng)用組織解剖和石蠟切片技術(shù)，補(bǔ)充雌雄生殖系統(tǒng)攝像，以及更加清晰的卵子發(fā)生過(guò)程觀察結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

龜紋瓢蟲(chóng)采自廣東省內(nèi)，實(shí)驗(yàn)條件（光照12 h、黑暗12 h，溫度26±1℃，濕度75%～80%）下用蚜蟲(chóng)飼養(yǎng)。

Ring’s 生理鹽水：20%氯化鈉，10%氯化鉀，10%氯化鈣，5%碳酸氫鈉，1%磷酸二氫鈉。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生殖系統(tǒng)解剖 將剛羽化的成蟲(chóng)按雌雄比例1 ∶1 配對(duì)飼養(yǎng)，逐日解剖成蟲(chóng)。先用70%的酒精浸泡樣品10 min，之后在滴有Ring’s 生理鹽水的點(diǎn)滴盤(pán)中進(jìn)行解剖，剔除生殖系統(tǒng)周?chē)慕M織，用生理鹽水沖洗干凈，最后將完整的生殖器置于體視鏡（Zeiss，Stereo Discovery V2.0）下觀察并拍照。

1.2.2 卵巢管石蠟切片 選取羽化5 d 左右的雌成蟲(chóng)，解剖出卵巢，方法同1.2.1，分離出完整的卵巢管，經(jīng)Bouin’s 固定液固定、70%酒精沖洗、梯度濃度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、H.E 和甲苯胺藍(lán)染色等系列過(guò)程，在光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。石蠟切片厚度為3～4 μm。

2 結(jié)果與分析

2.1 雌性生殖系統(tǒng)

龜紋瓢蟲(chóng)雌性內(nèi)生殖系統(tǒng)位于第3～8 腹節(jié)，包括1 對(duì)卵巢、1 對(duì)側(cè)輸卵管、中輸卵管、生殖腔。每側(cè)卵巢由11～13 根卵巢管組成，所有卵巢管通過(guò)端部的端絲束縛在一起，端絲白色，形成懸?guī)?，懸附于? 腹板。2 個(gè)側(cè)輸卵管匯合于中輸卵管，中輸卵管開(kāi)口于生殖腔。受精囊暗紅色，角質(zhì)化，半月形，其周?chē)苌俑街M織，近乎裸露。雌蟲(chóng)羽化后的約前3 d，卵巢附著很多白色氣管，之后氣管逐漸減少，直至卵成熟，幾乎不見(jiàn)氣管。當(dāng)臨近產(chǎn)卵，側(cè)輸卵管變短變寬，側(cè)輸卵管管壁變得很薄，組織疏松（圖1A）。

2.2 雄性生殖系統(tǒng)

龜紋瓢蟲(chóng)雄性內(nèi)生殖系統(tǒng)位于第2～8 腹節(jié)，包括1 對(duì)精巢、1 對(duì)雄性附腺、1 對(duì)輸精管、貯精囊、射精管。每側(cè)精巢由10 個(gè)橢圓形的精巢管一端向內(nèi)匯聚而成。輸精管和附腺比較短。射精管較長(zhǎng)，半透明狀，與彎管相連（圖1 B）。

圖1 龜紋瓢蟲(chóng)生殖系統(tǒng)Fig.1 Reproductive system of Propylea japonica

2.3 龜紋瓢蟲(chóng)卵巢管結(jié)構(gòu)

龜紋瓢蟲(chóng)卵巢管屬于端滋式卵巢管，分為原卵區(qū)（germarium）、生長(zhǎng)區(qū)（vitellatium）和端絲（terminal filament）。卵巢管外圍包被1 層管壁膜，由2 層薄膜構(gòu)成。當(dāng)卵細(xì)胞成熟且落入側(cè)輸卵管后，管壁膜清晰可見(jiàn)。原卵區(qū)分布著卵母細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞，卵母細(xì)胞比較分散。原卵區(qū)與卵黃區(qū)的銜接處稱(chēng)為卵巢管頸區(qū)，原卵區(qū)的卵細(xì)胞集中于此。卵黃區(qū)包含卵細(xì)胞，前濾泡細(xì)胞和濾泡細(xì)胞，卵細(xì)胞外層由濾泡細(xì)胞組成的細(xì)胞層覆蓋，這種結(jié)構(gòu)稱(chēng)為卵泡。龜紋瓢蟲(chóng)卵巢管卵黃區(qū)可見(jiàn)4 個(gè)卵細(xì)胞（圖2A、B）。

2.4 龜紋瓢蟲(chóng)卵子發(fā)生

龜紋瓢蟲(chóng)的蛹期就已經(jīng)形成了卵巢，并且已經(jīng)完成生殖細(xì)胞的增殖與分化，形成由滋養(yǎng)細(xì)胞和卵母細(xì)胞組成的生殖細(xì)胞簇，但此時(shí)滋養(yǎng)細(xì)胞與卵母細(xì)胞形態(tài)相似，難以區(qū)分。

在卵細(xì)胞發(fā)生前期，滋養(yǎng)細(xì)胞和卵母細(xì)胞集中在原卵區(qū)且靠近端部，滋養(yǎng)細(xì)胞較集中，細(xì)胞核較大，染色深，幾乎充滿整個(gè)細(xì)胞。自然狀態(tài)下，滋養(yǎng)細(xì)胞呈現(xiàn)白色，通過(guò)切片染色細(xì)胞間偶見(jiàn)間質(zhì)細(xì)胞，并出現(xiàn)雙核現(xiàn)象（圖2B、C），細(xì)胞核活動(dòng)增強(qiáng)，出現(xiàn)染色質(zhì)配對(duì)分離，這可能是為卵細(xì)胞輸送RNA 和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需要（圖2B）。卵母細(xì)胞分散在原卵區(qū)下端，個(gè)體比滋養(yǎng)細(xì)胞小，細(xì)胞核明顯可見(jiàn)（圖2C）。

圖2 龜紋瓢蟲(chóng)卵巢管原卵區(qū)縱切Fig.2 Longitudinal section of germarium of Propylea japonica ovariole

卵細(xì)胞發(fā)生中期，卵細(xì)胞逐漸向卵黃區(qū)移動(dòng)，細(xì)胞核明顯，染色較深，形成濾泡細(xì)胞和卵細(xì)胞組成的卵泡（follicle，圖3B）。卵細(xì)胞繼續(xù)增大，橢圓形，細(xì)胞質(zhì)增多，細(xì)胞核出現(xiàn)胚泡，且胚泡染色明顯比細(xì)胞質(zhì)淺，細(xì)胞核處在胚泡中央（圖3A）。

卵細(xì)胞發(fā)生的后期，卵細(xì)胞和胚泡繼續(xù)增大，卵細(xì)胞為橢圓形，而其周?chē)臑V泡細(xì)胞卻為圓形，此時(shí)期濾泡細(xì)胞核染色較深（圖3B）。

卵細(xì)胞發(fā)生的末期，卵細(xì)胞橢圓形，可見(jiàn)密集的卵黃顆粒和散布其中的脂滴。卵細(xì)胞周邊附著圓形濾泡細(xì)胞，且逐漸與濾泡細(xì)胞層分離，出現(xiàn)間隙，間隙首先出現(xiàn)在卵細(xì)胞之間的銜接處和卵巢管柄上方，隨之生成卵黃膜，并逐漸與卵巢管柄分離（圖3C、D）。

圖3 龜紋瓢蟲(chóng)卵巢管生長(zhǎng)區(qū)縱切Fig.3 Longitudinal section of vitellarium of Propylea japonica ovariole

3 討論

異色瓢蟲(chóng)每側(cè)卵巢管數(shù)量25～33 根［19］，單雌平均產(chǎn)卵量1 835 粒［27］；七星瓢蟲(chóng)每側(cè)卵巢管數(shù)量48 根，單雌產(chǎn)卵量400～900 粒，最多可達(dá) 2 000 多粒［21］；小黑瓢蟲(chóng)每側(cè)卵巢管數(shù)量4 根［20］，單雌平均產(chǎn)卵量378.5 粒［28］。本研究觀察到龜紋瓢蟲(chóng)每側(cè)卵巢管數(shù)量11～13 根，單雌平均產(chǎn)卵量600 粒，最多可達(dá)1 100 粒［1］。推測(cè)瓢蟲(chóng)卵巢管數(shù)量與產(chǎn)卵量呈正相關(guān)。

試驗(yàn)觀察到龜紋瓢蟲(chóng)的卵巢管端滋式，且滋養(yǎng)細(xì)胞分散，細(xì)胞核幾乎充滿整個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞膜清晰，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂，與藻食亞目的Hydroscapha natansLeConte［15］不同的是，卵巢管未見(jiàn)合胞體（syncytium）。Buning［29］將鞘翅目多食性亞目昆蟲(chóng)卵巢管分為3 個(gè)類(lèi)型，分別為初級(jí)階段：滋養(yǎng)細(xì)胞分散，細(xì)胞膜界面清晰，細(xì)胞核容易辨別，細(xì)胞間僅通過(guò)胞間連絲相連；過(guò)渡階段：滋養(yǎng)細(xì)胞積聚形成細(xì)胞簇，細(xì)胞核非線性排列；次級(jí)階段：原卵區(qū)出現(xiàn)合胞體。據(jù)此推測(cè)龜紋瓢蟲(chóng)卵巢管屬于原始類(lèi)型。

研究發(fā)現(xiàn)，濾泡細(xì)胞是黑腹果蠅卵黃原蛋白主要合成位點(diǎn)［30］，也能協(xié)調(diào)卵黃原蛋白從血淋巴輸入細(xì)胞內(nèi)［31］，其細(xì)胞間的橋粒（desmosomes）和微管塑造及維持卵的形態(tài)［32］。在對(duì)Tenebrio molitorL.研究發(fā)現(xiàn)，部分蛋白可通過(guò)濾泡細(xì)胞間隙進(jìn)入卵細(xì)胞［33］。龜紋瓢蟲(chóng)濾泡細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量在卵細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中變化較大，卵子發(fā)生前期和中期，濾泡細(xì)胞呈橢圓形并且排列緊密，此時(shí)由滋養(yǎng)細(xì)胞和濾泡細(xì)胞共同為卵細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；卵子發(fā)生后、末期，隨著卵細(xì)胞增大及卵黃的積累，濾泡細(xì)胞呈圓形且體積增大，細(xì)胞間隙較大，細(xì)胞核染色很淺，靠近濾泡細(xì)胞層處，卵黃顆粒較小，向內(nèi)卵黃顆粒增大，推測(cè)濾泡細(xì)胞之間的間隙為卵細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸?shù)耐ǖ馈?/p>

通過(guò)對(duì)果蠅和蝎蛉卵巢管研究發(fā)現(xiàn)，濾泡細(xì)胞參與卵殼的形成［34-35］。在Rhyncophorus palmarumLinnaeus 中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)卵細(xì)胞成熟后，濾泡細(xì)胞層消失［36］。Loof［37］研究了馬鈴薯甲蟲(chóng)（Leptinotarsa decemlineataSay）的濾泡細(xì)胞參與卵黃膜和卵殼形成的過(guò)程。卵黃沉積完成時(shí)，卵細(xì)胞與卵巢管柄逐漸分離，濾泡細(xì)胞與卵細(xì)胞出現(xiàn)間隙，靠近卵巢管柄處，濾泡細(xì)胞減少直至消失，可能與卵殼形成有關(guān)。

4 結(jié)論

龜紋瓢蟲(chóng)單側(cè)卵巢管維持在11～13 根之間，每根卵巢管存在多個(gè)不同發(fā)育階段的卵細(xì)胞，且每次只能成熟并產(chǎn)出1 粒卵，這有助于解釋龜紋瓢蟲(chóng)多次產(chǎn)卵的現(xiàn)象，也一定程度決定了單雌一生產(chǎn)卵數(shù)量。卵細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，養(yǎng)分供給來(lái)自多次形態(tài)變化的濾泡細(xì)胞。綜上所述，在開(kāi)發(fā)人工飼料、開(kāi)展龜紋瓢蟲(chóng)大量繁育工作中，應(yīng)合理配置飼料成分，確保卵巢養(yǎng)分需求，促進(jìn)卵細(xì)胞發(fā)育成熟。