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        龜紋瓢蟲生殖系統(tǒng)及卵子發(fā)生觀察

        2021-07-27 09:48:38劉志偉鐘國輝王永躍王興民畢可可
        廣東農(nóng)業(yè)科學 2021年6期
        關鍵詞:卵細胞生殖系統(tǒng)細胞核

        劉志偉,鐘國輝,王永躍,王興民,畢可可

        (1.廣州市林業(yè)和園林科學研究院,廣東 廣州 501405;2.龍門縣林業(yè)局,廣東 龍門 516800;3.華南農(nóng)業(yè)大學生物防治教育部工程研究中心,廣東 廣州 510642)

        【研究意義】龜紋瓢蟲(Propylea japonica)屬鞘翅目瓢蟲科瓢蟲族龜紋瓢蟲屬,廣泛分布于我國南北各地[1],是蚜蟲的重要天敵[2-4],也捕食蚧殼蟲、草地貪夜蛾、木虱[5-7],具有耐高溫、繁殖力強、對多種農(nóng)藥表現(xiàn)高耐受性等優(yōu)點[8-10],是農(nóng)林業(yè)重要天敵昆蟲,具有很大的開發(fā)應用前景。要實現(xiàn)龜紋瓢蟲大規(guī)模生物防治,人工繁殖非常重要,而生殖系統(tǒng)和卵子發(fā)生相關研究將為人工繁殖提供理論依據(jù)?!厩叭搜芯窟M展】昆蟲卵巢管有無滋式和具滋式兩種類型[11],其中具滋式又劃分為端滋式和多滋式[12]。無滋式指卵巢管內(nèi)無滋養(yǎng)細胞,濾泡細胞和血淋巴為卵細胞發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)和RNA,少量營養(yǎng)物質(zhì)由卵細胞自身合[13-14]。端滋式卵巢管中,滋養(yǎng)細胞集中在卵巢管前段的生殖區(qū),通過營養(yǎng)索向卵母細胞輸送營養(yǎng)物質(zhì)[15]。多滋式卵巢管中,濾泡細胞分布在整個卵巢管,通過胞內(nèi)連絲將營養(yǎng)物質(zhì)和RNA 輸入卵母細胞[14]。國內(nèi)外對瓢蟲生殖系統(tǒng)和卵子發(fā)生已有研究,Mpakou 等[16]闡述了二星瓢蟲(Adalia bipunctata Linnaeus)卵子發(fā)生過程中細胞凋亡的3 種類型,分別為細胞程序死亡、細胞自噬和細胞質(zhì)死亡;Maffei 等[17]發(fā)現(xiàn)Eriopis connexa為端滋式卵巢管;Osawa[18]研究了在食物匱乏情況下,異色瓢蟲卵巢管重新吸收卵細胞;陳潔等[19]根據(jù)卵母細胞所在位置、體積、形態(tài)和細胞核的變化,滋養(yǎng)細胞和濾泡細胞的形態(tài)變化,以及卵黃沉積、分布情況將異色瓢蟲(Harmonia axyridis Pallas)卵子發(fā)生劃分為3 個時期7 個階段;此外,小黑瓢蟲(Delphastus catalinae)、七星瓢蟲(Coccinella septempunctataL.)、孟氏隱唇瓢蟲(Cryptolaemus montrouzieri)也有生殖系統(tǒng)觀察研究[20-22]?!颈狙芯壳腥朦c】有關龜紋瓢蟲的研究由來已久,主要在生物防治[23]、耐藥性[10,24]、人工飼料[25]等方面,但還未形成規(guī)?;纳锓乐螒?,大量繁殖是實現(xiàn)生物防治應用的基礎,而研究相對匱乏的生殖系統(tǒng)對繁殖非常重要?!緮M解決的關鍵問題】本研究在張?zhí)熹龋?6]研究的基礎上,結(jié)合查閱相關資料,應用組織解剖和石蠟切片技術,補充雌雄生殖系統(tǒng)攝像,以及更加清晰的卵子發(fā)生過程觀察結(jié)果。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        龜紋瓢蟲采自廣東省內(nèi),實驗條件(光照12 h、黑暗12 h,溫度26±1℃,濕度75%~80%)下用蚜蟲飼養(yǎng)。

        Ring’s 生理鹽水:20%氯化鈉,10%氯化鉀,10%氯化鈣,5%碳酸氫鈉,1%磷酸二氫鈉。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 生殖系統(tǒng)解剖 將剛羽化的成蟲按雌雄比例1 ∶1 配對飼養(yǎng),逐日解剖成蟲。先用70%的酒精浸泡樣品10 min,之后在滴有Ring’s 生理鹽水的點滴盤中進行解剖,剔除生殖系統(tǒng)周圍的組織,用生理鹽水沖洗干凈,最后將完整的生殖器置于體視鏡(Zeiss,Stereo Discovery V2.0)下觀察并拍照。

        1.2.2 卵巢管石蠟切片 選取羽化5 d 左右的雌成蟲,解剖出卵巢,方法同1.2.1,分離出完整的卵巢管,經(jīng)Bouin’s 固定液固定、70%酒精沖洗、梯度濃度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、H.E 和甲苯胺藍染色等系列過程,在光學顯微鏡觀察并拍照。石蠟切片厚度為3~4 μm。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 雌性生殖系統(tǒng)

        龜紋瓢蟲雌性內(nèi)生殖系統(tǒng)位于第3~8 腹節(jié),包括1 對卵巢、1 對側(cè)輸卵管、中輸卵管、生殖腔。每側(cè)卵巢由11~13 根卵巢管組成,所有卵巢管通過端部的端絲束縛在一起,端絲白色,形成懸?guī)?,懸附于? 腹板。2 個側(cè)輸卵管匯合于中輸卵管,中輸卵管開口于生殖腔。受精囊暗紅色,角質(zhì)化,半月形,其周圍很少附著組織,近乎裸露。雌蟲羽化后的約前3 d,卵巢附著很多白色氣管,之后氣管逐漸減少,直至卵成熟,幾乎不見氣管。當臨近產(chǎn)卵,側(cè)輸卵管變短變寬,側(cè)輸卵管管壁變得很薄,組織疏松(圖1A)。

        2.2 雄性生殖系統(tǒng)

        龜紋瓢蟲雄性內(nèi)生殖系統(tǒng)位于第2~8 腹節(jié),包括1 對精巢、1 對雄性附腺、1 對輸精管、貯精囊、射精管。每側(cè)精巢由10 個橢圓形的精巢管一端向內(nèi)匯聚而成。輸精管和附腺比較短。射精管較長,半透明狀,與彎管相連(圖1 B)。

        圖1 龜紋瓢蟲生殖系統(tǒng)Fig.1 Reproductive system of Propylea japonica

        2.3 龜紋瓢蟲卵巢管結(jié)構(gòu)

        龜紋瓢蟲卵巢管屬于端滋式卵巢管,分為原卵區(qū)(germarium)、生長區(qū)(vitellatium)和端絲(terminal filament)。卵巢管外圍包被1 層管壁膜,由2 層薄膜構(gòu)成。當卵細胞成熟且落入側(cè)輸卵管后,管壁膜清晰可見。原卵區(qū)分布著卵母細胞和滋養(yǎng)細胞,卵母細胞比較分散。原卵區(qū)與卵黃區(qū)的銜接處稱為卵巢管頸區(qū),原卵區(qū)的卵細胞集中于此。卵黃區(qū)包含卵細胞,前濾泡細胞和濾泡細胞,卵細胞外層由濾泡細胞組成的細胞層覆蓋,這種結(jié)構(gòu)稱為卵泡。龜紋瓢蟲卵巢管卵黃區(qū)可見4 個卵細胞(圖2A、B)。

        2.4 龜紋瓢蟲卵子發(fā)生

        龜紋瓢蟲的蛹期就已經(jīng)形成了卵巢,并且已經(jīng)完成生殖細胞的增殖與分化,形成由滋養(yǎng)細胞和卵母細胞組成的生殖細胞簇,但此時滋養(yǎng)細胞與卵母細胞形態(tài)相似,難以區(qū)分。

        在卵細胞發(fā)生前期,滋養(yǎng)細胞和卵母細胞集中在原卵區(qū)且靠近端部,滋養(yǎng)細胞較集中,細胞核較大,染色深,幾乎充滿整個細胞。自然狀態(tài)下,滋養(yǎng)細胞呈現(xiàn)白色,通過切片染色細胞間偶見間質(zhì)細胞,并出現(xiàn)雙核現(xiàn)象(圖2B、C),細胞核活動增強,出現(xiàn)染色質(zhì)配對分離,這可能是為卵細胞輸送RNA 和其他營養(yǎng)物質(zhì)的需要(圖2B)。卵母細胞分散在原卵區(qū)下端,個體比滋養(yǎng)細胞小,細胞核明顯可見(圖2C)。

        圖2 龜紋瓢蟲卵巢管原卵區(qū)縱切Fig.2 Longitudinal section of germarium of Propylea japonica ovariole

        卵細胞發(fā)生中期,卵細胞逐漸向卵黃區(qū)移動,細胞核明顯,染色較深,形成濾泡細胞和卵細胞組成的卵泡(follicle,圖3B)。卵細胞繼續(xù)增大,橢圓形,細胞質(zhì)增多,細胞核出現(xiàn)胚泡,且胚泡染色明顯比細胞質(zhì)淺,細胞核處在胚泡中央(圖3A)。

        卵細胞發(fā)生的后期,卵細胞和胚泡繼續(xù)增大,卵細胞為橢圓形,而其周圍的濾泡細胞卻為圓形,此時期濾泡細胞核染色較深(圖3B)。

        卵細胞發(fā)生的末期,卵細胞橢圓形,可見密集的卵黃顆粒和散布其中的脂滴。卵細胞周邊附著圓形濾泡細胞,且逐漸與濾泡細胞層分離,出現(xiàn)間隙,間隙首先出現(xiàn)在卵細胞之間的銜接處和卵巢管柄上方,隨之生成卵黃膜,并逐漸與卵巢管柄分離(圖3C、D)。

        圖3 龜紋瓢蟲卵巢管生長區(qū)縱切Fig.3 Longitudinal section of vitellarium of Propylea japonica ovariole

        3 討論

        異色瓢蟲每側(cè)卵巢管數(shù)量25~33 根[19],單雌平均產(chǎn)卵量1 835 粒[27];七星瓢蟲每側(cè)卵巢管數(shù)量48 根,單雌產(chǎn)卵量400~900 粒,最多可達 2 000 多粒[21];小黑瓢蟲每側(cè)卵巢管數(shù)量4 根[20],單雌平均產(chǎn)卵量378.5 粒[28]。本研究觀察到龜紋瓢蟲每側(cè)卵巢管數(shù)量11~13 根,單雌平均產(chǎn)卵量600 粒,最多可達1 100 粒[1]。推測瓢蟲卵巢管數(shù)量與產(chǎn)卵量呈正相關。

        試驗觀察到龜紋瓢蟲的卵巢管端滋式,且滋養(yǎng)細胞分散,細胞核幾乎充滿整個細胞,細胞膜清晰,未發(fā)現(xiàn)細胞分裂,與藻食亞目的Hydroscapha natansLeConte[15]不同的是,卵巢管未見合胞體(syncytium)。Buning[29]將鞘翅目多食性亞目昆蟲卵巢管分為3 個類型,分別為初級階段:滋養(yǎng)細胞分散,細胞膜界面清晰,細胞核容易辨別,細胞間僅通過胞間連絲相連;過渡階段:滋養(yǎng)細胞積聚形成細胞簇,細胞核非線性排列;次級階段:原卵區(qū)出現(xiàn)合胞體。據(jù)此推測龜紋瓢蟲卵巢管屬于原始類型。

        研究發(fā)現(xiàn),濾泡細胞是黑腹果蠅卵黃原蛋白主要合成位點[30],也能協(xié)調(diào)卵黃原蛋白從血淋巴輸入細胞內(nèi)[31],其細胞間的橋粒(desmosomes)和微管塑造及維持卵的形態(tài)[32]。在對Tenebrio molitorL.研究發(fā)現(xiàn),部分蛋白可通過濾泡細胞間隙進入卵細胞[33]。龜紋瓢蟲濾泡細胞的形態(tài)和數(shù)量在卵細胞發(fā)育過程中變化較大,卵子發(fā)生前期和中期,濾泡細胞呈橢圓形并且排列緊密,此時由滋養(yǎng)細胞和濾泡細胞共同為卵細胞提供營養(yǎng)物質(zhì);卵子發(fā)生后、末期,隨著卵細胞增大及卵黃的積累,濾泡細胞呈圓形且體積增大,細胞間隙較大,細胞核染色很淺,靠近濾泡細胞層處,卵黃顆粒較小,向內(nèi)卵黃顆粒增大,推測濾泡細胞之間的間隙為卵細胞物質(zhì)運輸?shù)耐ǖ馈?/p>

        通過對果蠅和蝎蛉卵巢管研究發(fā)現(xiàn),濾泡細胞參與卵殼的形成[34-35]。在Rhyncophorus palmarumLinnaeus 中也發(fā)現(xiàn),當卵細胞成熟后,濾泡細胞層消失[36]。Loof[37]研究了馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineataSay)的濾泡細胞參與卵黃膜和卵殼形成的過程。卵黃沉積完成時,卵細胞與卵巢管柄逐漸分離,濾泡細胞與卵細胞出現(xiàn)間隙,靠近卵巢管柄處,濾泡細胞減少直至消失,可能與卵殼形成有關。

        4 結(jié)論

        龜紋瓢蟲單側(cè)卵巢管維持在11~13 根之間,每根卵巢管存在多個不同發(fā)育階段的卵細胞,且每次只能成熟并產(chǎn)出1 粒卵,這有助于解釋龜紋瓢蟲多次產(chǎn)卵的現(xiàn)象,也一定程度決定了單雌一生產(chǎn)卵數(shù)量。卵細胞發(fā)育過程中,養(yǎng)分供給來自多次形態(tài)變化的濾泡細胞。綜上所述,在開發(fā)人工飼料、開展龜紋瓢蟲大量繁育工作中,應合理配置飼料成分,確保卵巢養(yǎng)分需求,促進卵細胞發(fā)育成熟。

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