王君怡，李榮，許文榮，江佳佳

(1.江蘇大學(xué)附屬澳洋醫(yī)院澳洋腫瘤研究院，江蘇張家港215600；2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013)

外泌體是由細(xì)胞內(nèi)多囊泡體通過膜內(nèi)陷包裹內(nèi)容物并與細(xì)胞膜融合后被釋放到胞外的一類微小囊泡[1]，在血液、尿液、腦脊液、唾液、母乳、羊水、淋巴液和膽汁等多種體液中均可檢出外泌體[2]。外泌體包裹蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸及代謝物等生物活性物質(zhì)，參與機(jī)體免疫應(yīng)答、抗原提呈、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、腫瘤侵襲等過程[1]。近年來，外泌體高通量組學(xué)篩選與分析檢測(cè)技術(shù)已取得明顯進(jìn)展，外泌體分子標(biāo)志物的檢驗(yàn)及應(yīng)用實(shí)現(xiàn)新的突破。為此，本文將討論不同來源的外泌體分子標(biāo)志物的檢測(cè)方法及其應(yīng)用價(jià)值。

1 外泌體提取

1.1體液樣本采集與預(yù)處理 血液外泌體提取通常采用血清或血漿樣本。血清樣本用于外泌體微小RNA檢測(cè)，EDTA抗凝血漿常用于外泌體RNA分析。EDTA抗凝血室溫以2 500×g離心15 min去除血小板，收集上層血漿再次離心后即可獲得。

尿液具有無創(chuàng)、簡(jiǎn)便、量大等優(yōu)勢(shì)，尿液外泌體miR-142-3p、miR-142-5p、miR-223-3p和前列腺特異抗原組合可顯著提高前列腺癌診斷效率[3]。尿液收集后通常需加入蛋白酶抑制劑以防外泌體表面蛋白分子降解，再以4 ℃、3 000×g離心15 min即可。

腦脊液外泌體miRNA-9-5p和miRNA-598可作為阿爾茲海默癥的潛在生物標(biāo)志物[4]。腰椎穿刺或術(shù)中采集腦脊液時(shí)應(yīng)避免穿刺損傷帶來的血液污染。所獲樣本以4 ℃、3 000×g離心15 min。

唾液外泌體GOLM1-NAA35嵌合RNA可作為食管鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷標(biāo)志物[5]。唾液具有非侵襲性、易收集、依從性高等優(yōu)勢(shì)。但唾液黏性高，樣本應(yīng)進(jìn)行超聲或過濾，再以4 ℃、3 000×g離心20 min去除雜質(zhì)。

為保證外泌體的純度和生物活性，腦脊液、血液樣本應(yīng)在采集后1 h內(nèi)，尿液和唾液樣本則在采集后2 h內(nèi)進(jìn)行預(yù)處理。若長(zhǎng)期儲(chǔ)存，應(yīng)分裝凍存于-80 ℃，避免反復(fù)凍融。

1.2外泌體分離與純化 外泌體有效分離是外泌體分子標(biāo)志物檢測(cè)的關(guān)鍵。依據(jù)其物理、化學(xué)和生物學(xué)特性已建立了多種分離方法,各有利弊，應(yīng)根據(jù)樣本來源、檢測(cè)目的與預(yù)算成本等實(shí)際情況進(jìn)行選擇(表1)。

表1 常用外泌體分離技術(shù)

超速離心法是基于外泌體尺寸差異采用不同相對(duì)離心力提取外泌體的經(jīng)典方法[6]。該法技術(shù)成熟但耗時(shí)長(zhǎng)，適用于大體積樣本。

密度梯度離心法是依據(jù)樣本中不同組分的沉降系數(shù)分離外泌體，按照介質(zhì)可分為蔗糖密度梯度離心法和碘克沙醇密度梯度離心法[6]。

超濾法利用超濾膜孔徑大小對(duì)不同分子質(zhì)量的物質(zhì)進(jìn)行分離，通常選用相對(duì)分子截留量為100 kDa的超濾管，提取外泌體的同時(shí)能夠濃縮樣本量[6]，可有效減少因超高速離心對(duì)外泌體的損壞。

聚合物沉淀法是利用聚合物作為沉淀劑從樣本中分離沉降出外泌體，其中聚乙二醇(PEG)是最常用的沉淀試劑。樣本在4 ℃經(jīng)PEG處理后過濾或離心即可沉淀、回收外泌體，但夾雜的大量脂蛋白和RNA可能影響后續(xù)分析?，F(xiàn)已基于該方法開發(fā)出眾多商品化外泌體提取試劑盒。

免疫磁珠法利用包裹單克隆抗體的磁珠捕獲外泌體表面特異性分子進(jìn)行外泌體提取，可確保外泌體的特異性和完整性并能進(jìn)一步分離不同外泌體亞群，但其只能提取高表達(dá)靶抗體的外泌體[6]。

尺寸排阻色譜法以不同粒徑的聚合物凝膠填料作為分離介質(zhì)，基于尺寸差異分離外泌體。操作時(shí)需考慮凝膠顆粒的孔徑、外泌體與介質(zhì)間的相互作用、混合液中各物質(zhì)分子量差異等因素以提高分離效率[7]。

微流控技術(shù)是基于微流控芯片實(shí)現(xiàn)各種微粒分離與檢測(cè)的新技術(shù)，又被稱為“芯片實(shí)驗(yàn)室”。近年來，研究者在微流控技術(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合納米聲學(xué)過濾器、粘彈性流體分選、側(cè)向位移和免疫親和等技術(shù)[8]開發(fā)出多種低成本、高效率、高通量的新型外泌體分離方法。Wang等[9]將聲學(xué)和微流體技術(shù)融合，使用微小的聲流芯片分析唾液樣本，5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)唾液外泌體的自動(dòng)分離。Xu等[8]建立了一種集分離、富集和檢測(cè)為一體的肝癌相關(guān)外泌體分析平臺(tái)，該芯片由1個(gè)Y型微柱陣列組成的捕獲區(qū)和級(jí)聯(lián)的ITO電極構(gòu)成，將特異性磷脂酰絲氨酸Tim4蛋白識(shí)別的磁富集技術(shù)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)結(jié)合，僅需4 h即可從30 μL血液樣本中分離出肝癌來源外泌體，并進(jìn)行后續(xù)分析。

場(chǎng)流分離是在垂直于樣品流的上方施加流體場(chǎng)，以便基于樣品尺寸、質(zhì)量、密度、體積等理化性質(zhì)進(jìn)行物質(zhì)分離[10]。目前應(yīng)用最廣泛的場(chǎng)流分離技術(shù)是非對(duì)稱流場(chǎng)流分離。樣本在交叉流力場(chǎng)和擴(kuò)散力的雙重作用下，根據(jù)流體動(dòng)力學(xué)的尺寸差異分布于交叉流截面不同高度，隨后在縱向流載液的推動(dòng)下分離外泌體，并能進(jìn)一步鑒定外泌體亞群[10]。該法可從小鼠黑色素瘤細(xì)胞系成功分離出外泌體，并可聯(lián)用紫外檢測(cè)器、多角度激光散射檢測(cè)器等技術(shù)進(jìn)行分析與表征[11]。

1.3外泌體鑒定 外泌體鑒定主要包括形態(tài)、大小和表面標(biāo)記蛋白質(zhì)。通過掃描電鏡和透射電鏡等可直接觀察外泌體形態(tài)與結(jié)構(gòu)，典型形態(tài)呈酒杯狀。納米顆粒跟蹤分析和動(dòng)態(tài)光散射計(jì)算獲得外泌體粒徑與濃度，多集中于30～150 nm。western blot檢測(cè)CD63、CD9、CD81、TSG101、HSP70、ALIX等外泌體標(biāo)志蛋白質(zhì)。此外，流式細(xì)胞儀可通過特異性標(biāo)記抗體或特殊染料快速、高通量地篩選和分析外泌體。

2 外泌體分子標(biāo)志物分析技術(shù)與臨床應(yīng)用

外泌體攜帶大量特異性蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和代謝物等，它們與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，分析外泌體中特異性分子的表達(dá)水平對(duì)疾病診療有重要意義。

2.1蛋白質(zhì)類標(biāo)志物 外泌體蛋白質(zhì)水平的分析技術(shù)主要有蛋白免疫印跡、ELISA、納米流式細(xì)胞術(shù)、免疫電鏡、串聯(lián)質(zhì)譜法等，其中免疫印跡法和ELISA最為常用，但許多低豐度的蛋白質(zhì)無法檢出。質(zhì)譜分析逐漸成為外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)的重要技術(shù)。Xie等[12]利用TMT蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選并驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清外泌體ITGβ3的表達(dá)水平與骨密度成正相關(guān)(r=0.304,P=0.009)，有助于老年骨質(zhì)疏松癥的診斷和治療。Hoshino等[13]使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)源于16種不同腫瘤的120份血漿外泌體樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，篩選出相關(guān)蛋白質(zhì)組合應(yīng)用于疾病診斷和腫瘤類型預(yù)測(cè)，對(duì)原發(fā)性未知腫瘤的分類可達(dá)到95%敏感性和90%特異性。以上研究表明外泌體蛋白可作為疾病診斷及預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。

2.2脂質(zhì)類標(biāo)志物 外泌體脂質(zhì)檢測(cè)方法以質(zhì)譜分析為主。Skotland等[14]采用高通量質(zhì)譜定量分析方法發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者尿液外泌體中有9種脂質(zhì)的表達(dá)水平顯著升高，其中磷脂酰絲氨酸和乳糖基神經(jīng)酰胺檢測(cè)的敏感性為93%，特異性為100%。最近，有學(xué)者利用靶向-非靶向串聯(lián)質(zhì)譜評(píng)估發(fā)現(xiàn)，COVID-19患者血漿外泌體中單唾液酸二己糖神經(jīng)節(jié)苷脂含量與COVID-19的嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)(P=0.003 7)，有望成為COVID-19新型檢測(cè)指標(biāo)[15]。

2.3代謝物標(biāo)志物 外泌體中小分子代謝物逐漸被關(guān)注。研究者通過靶向超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)尿液外泌體中葡萄糖醛酸、D-核糖-5-磷酸和異丁酰基-L-肉堿等代謝指標(biāo)對(duì)前列腺癌的診斷及預(yù)后具有一定指導(dǎo)作用[16]。Luo等[17]研發(fā)了一種攜帶電噴霧離子源的納流液相色譜-質(zhì)譜分析平臺(tái)，可定量檢測(cè)和分析血漿外泌體中的痕量代謝物。

2.4核酸類標(biāo)志物 外泌體標(biāo)志物研究主要集中于非編碼RNA，相關(guān)技術(shù)包括高通量的基因芯片和二代測(cè)序技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)外泌體非編碼RNA表達(dá)譜分析，大力推動(dòng)了低豐度LncRNA和circRNA的研究。

2.4.1qRT-PCR技術(shù) 該技術(shù)廣泛應(yīng)用于外泌體RNA的檢測(cè)。Sun等[18]結(jié)合exoRBase數(shù)據(jù)庫(kù)和qRT-RCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)hsa_circ_0004001、hsa_circ_0004123和hsa_circ_0075792可明顯提高原發(fā)性肝癌的診斷敏感性(90.5%)和特異性(78.1%)。Ji等[19]采用qRT-PCR技術(shù)篩選出的血清外泌體miR-374a-5p可作為高靈敏度、高穩(wěn)定性的早期胃癌診斷標(biāo)志物，ROC曲線下面積為0.919。

2.4.2數(shù)字PCR 該技術(shù)是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)，無需標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)LncRNA和circRNA也能實(shí)現(xiàn)高精度的靶標(biāo)定量[20]，有效彌補(bǔ)qRT-PCR技術(shù)靈敏度不夠、步驟繁瑣及假陽(yáng)性率高等問題(表2)。Hu等[21]采用液滴數(shù)字PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合分析circGSK3β和癌胚抗原可顯著提高食管鱗狀細(xì)胞癌早期診斷敏感性(87.5%)。Bai等[20]開發(fā)了一種多色熒光數(shù)字PCR EV-LncRNA，可簡(jiǎn)單、快速、高通量分析肺癌血液外泌體LncRNA的表達(dá)。另外，Yoshizawa等[22]使用3D數(shù)字PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)早期胰腺導(dǎo)管腺癌患者尿液外泌體中miR-3940-5p/miR-8069比值顯著升高，與CA19-9聯(lián)合檢測(cè)時(shí)其敏感性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別提高至93%和78.4%。

表2 核酸分子分析新技術(shù)

2.4.3目前正在逐步開發(fā)應(yīng)用更靈敏的自動(dòng)化外泌體核酸分析技術(shù) He等[23]基于全內(nèi)反射熒光成像原理開發(fā)了一種單囊泡成像分析方法，該法將分裂式DNA酶和熒光淬滅底物共同包裝至外泌體，產(chǎn)生靶向miRNA的催化裂解反應(yīng)和放大的熒光信號(hào)，從而直接觀察血清外泌體并對(duì)其包裹的miRNA進(jìn)行原位定量和分析。Wu等[24]根據(jù)表面等離子體共振成像(SPRi)原理設(shè)計(jì)出一種新型生物傳感器，通過Au-on-Ag異質(zhì)結(jié)構(gòu)和新型DNA納米材料之間的協(xié)同作用超靈敏地檢測(cè)出非小細(xì)胞肺癌相關(guān)外泌體miRNA，可用于早期診斷。Yang等[25]將等離子體共振瑞利散射光譜法和暗場(chǎng)顯微鏡融合，開發(fā)了一款新型集成微流控裝置，能從非小細(xì)胞肺癌患者尿液中分離并檢測(cè)相關(guān)外泌體，發(fā)現(xiàn)早期肺癌患者。

3 外泌體分子標(biāo)志物常用生物信息學(xué)技術(shù)

隨著高通量檢測(cè)手段的發(fā)展和外泌體分子標(biāo)志物研究的深入，現(xiàn)已建立多種外泌體相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)以供查閱(表3)。

表3 外泌體分子標(biāo)志物常用數(shù)據(jù)庫(kù)

exoRBase數(shù)據(jù)庫(kù)是目前最為齊全的外泌體內(nèi)容物數(shù)據(jù)庫(kù)，囊括了92個(gè)血樣RNA-seq實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，覆蓋多種疾病，主要為血液外泌體中的circRNA、LncRNA和mRNA。

EVpedia數(shù)據(jù)庫(kù)收集了原核生物、非哺乳類真核生物和哺乳動(dòng)物囊泡的高通量分析數(shù)據(jù)，并提供相關(guān)分析工具，操作方便、實(shí)用性強(qiáng)。

ExoCarta數(shù)據(jù)庫(kù)是首個(gè)外泌體標(biāo)志物綜合數(shù)據(jù)庫(kù)，覆蓋多物種、多組織器官外泌體內(nèi)容物數(shù)據(jù)，并附加外泌體蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和相關(guān)生物學(xué)信息以供檢索。

此外，還有Vesiclepedia數(shù)據(jù)庫(kù)、EVmiRNA數(shù)據(jù)庫(kù)、EVLncRNA2.0數(shù)據(jù)庫(kù)、外泌體circRNA數(shù)據(jù)庫(kù)、Urinary Exosome Protein Database數(shù)據(jù)庫(kù)、exRNA Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)、miRandola數(shù)據(jù)庫(kù)等，可根據(jù)實(shí)際需求聯(lián)合使用。

4 小結(jié)及展望

體液中外泌體體積小、分布廣、含量高，其脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)能有效保護(hù)內(nèi)容物不受體液中各種酶類干擾[26]，幾乎所有類型的細(xì)胞均能分泌外泌體，因此，外泌體標(biāo)志物的檢測(cè)為慢性病和惡性疾病的早期診斷和精準(zhǔn)治療帶來新的希望。近年來涌現(xiàn)出多種新型外泌體分離方法如微流控技術(shù)和非對(duì)稱流場(chǎng)流分離技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)外泌體高效率、高純度的富集?；谏飩鞲衅?、質(zhì)譜分析、SPRi和數(shù)字PCR等新型檢測(cè)技術(shù)也被逐漸應(yīng)用。然而現(xiàn)階段外泌體分子標(biāo)志物檢測(cè)應(yīng)用仍受到一些限制，例如大量的臨床數(shù)據(jù)如生存時(shí)間、預(yù)后狀況、病理相關(guān)性分析不夠完備；缺乏足夠的臨床樣本支撐和嚴(yán)格的方法學(xué)評(píng)價(jià)；缺少足夠靈敏且快速的檢測(cè)方法，外泌體分子標(biāo)志物一體化檢測(cè)平臺(tái)有待開發(fā)。

外泌體分子標(biāo)志物的研究也推動(dòng)了外泌體靶向治療的發(fā)展，天然或工程化修飾的外泌體被視為惡性疾病精準(zhǔn)治療的一種理想工具。例如外泌體作為靶向Kras G12D的給藥載體可明顯緩解小鼠胰腺癌的進(jìn)程[27]；具有靶向修飾的超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIONs)的外泌體是2型糖尿病治療的潛在藥物載體[28]。因此，鑒于外泌體分子標(biāo)志物檢測(cè)方法的不斷完善，其臨床應(yīng)用會(huì)顯示出在疾病預(yù)防、診療及康養(yǎng)中的重要價(jià)值。