陳馨寧，黃斐，張春燕，潘柏申

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海200032；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院檢驗科，福建廈門 361015)

截至2021年5月，新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)已經(jīng)累及185個國家，全球累計確診人數(shù)超過1.6億。SARS-CoV-2主要傳播途徑是經(jīng)呼吸道飛沫和密切接觸傳播[1]。SARS-CoV-2在不同感染者間的臨床表現(xiàn)存在較大個體差異，從無癥狀到常見的發(fā)熱、干咳、乏力甚至嚴(yán)重急性呼吸綜合征等[2]。其中，無癥狀感染者成為SARS-CoV-2傳播和疫情反彈的焦點[3]。這突顯了大規(guī)模提供準(zhǔn)確、有效地診斷檢測以識別感染者的重要性。

SARS-CoV-2實驗室檢測包括：(1)核酸檢測，即診斷病原體感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，是確診、治療和防控COVID-19的主要手段；(2)血清學(xué)檢測，即檢測機體產(chǎn)生新冠病毒特異性抗體，但由于存在“窗口期”，不適合用于早期診斷；(3)病毒分離培養(yǎng)與鑒定，即病原學(xué)鑒定的傳統(tǒng)金標(biāo)準(zhǔn)，受限于耗時和實驗室安全等級要求，暫不作為日常診斷方法。本文將結(jié)合SARS-CoV-2核酸檢測現(xiàn)狀，著重概述不同分子診斷技術(shù)，并對上述技術(shù)在未來傳染病暴發(fā)中的應(yīng)用和發(fā)展提出建議。文中所涉及的新冠相關(guān)內(nèi)容僅依據(jù)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)指南，實際操作時還應(yīng)遵循最新版本。

1 核酸檢測樣本

1.1樣本類型 根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎防控方案(第八版)》中附件10《新冠病毒樣本采集和檢測技術(shù)指南》，需由經(jīng)過生物安全培訓(xùn)合格和具備相應(yīng)實驗技能的人員進(jìn)行樣本采集，無癥狀患者和普通人群篩查優(yōu)先采集鼻咽拭子，次之為口咽拭子；急性期患者應(yīng)采集呼吸道標(biāo)本；重癥患者優(yōu)先采集下呼吸道標(biāo)本(表1)[4-5]。另需注意多部位(類型)樣本聯(lián)合檢測能有效防止由樣本造成的假性結(jié)果。

表1 新型冠狀病毒核酸檢測樣本[6-9]

1.2采樣模式 考慮到檢測壓力和衛(wèi)生經(jīng)濟資源壓力，國務(wù)院應(yīng)對新型冠狀病毒肺炎疫情聯(lián)防聯(lián)控機制醫(yī)療救治組于2020年7月21日和8月17日相繼制定了《新冠病毒核酸篩查稀釋混樣檢測技術(shù)指引》和《新冠病毒核酸10合1混采檢測技術(shù)規(guī)范》，以供特定人群(總體陽性率低于0.1%)針對混合樣本進(jìn)行核酸檢測(低風(fēng)險地區(qū)可按照10∶1、中風(fēng)險地區(qū)可按照5∶1的檢測模式)。值得注意的是，混合樣本在臨床檢測中存在風(fēng)險，如無法通過內(nèi)參監(jiān)控樣本質(zhì)量、混合樣本復(fù)雜性和異質(zhì)性。對于重點區(qū)域人群及醫(yī)療機構(gòu)就診患者檢測，還是應(yīng)當(dāng)單采單檢[10-12]。

2 核酸檢測技術(shù)

SARS-CoV-2是一種正義單鏈RNA病毒(Genbank：MN908947)，其基因組全長為29 903個核苷酸，轉(zhuǎn)錄29種蛋白質(zhì)。其中，開放讀碼框1ab(open reading frame 1ab，ORF1ab)基因編碼16個非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)基因組依次編碼棘突蛋白(spike protein，S)、包膜蛋白(envelope protein，E)、膜蛋白(membrane protein，M)和核衣殼蛋白(nucleocapsid，N)(圖1)[13]。根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術(shù)指南(第五版)》，高度特異的ORF1ab基因和相對保守的N基因是SARS-CoV-2核酸檢測的推薦靶點[14]。SARS-CoV-2具有基因組校對機制，可以防止病毒積累可能削弱自身的突變[15]。但隨著時間推移和人際傳播，自然選擇仍然可以對罕見但有利于病毒的突變起到作用，獲得具有適應(yīng)度優(yōu)勢和免疫抗性的突變[16]。

圖1 SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)示意圖

自疫情暴發(fā)以來，全球各地不同科學(xué)背景的研究人員和整個體外診斷(in vitro diagnostics，IVD)領(lǐng)域致力于技術(shù)攻關(guān)，將科研成果落地轉(zhuǎn)化，以滿足一線防控診治對快速準(zhǔn)確診斷檢測的需求。國家藥品監(jiān)督管理局(National Medicine Products Administration，NMPA)批準(zhǔn)及獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)緊急使用權(quán)的核酸檢測試劑中，可以發(fā)現(xiàn)目前SARS-CoV-2核酸檢測所使用的分子診斷技術(shù)原理各不相同，提供了全場景化核酸檢測方案。

2.1常態(tài)化防控

2.1.1常規(guī)檢測 醫(yī)院檢驗科、疾控中心和第三方檢測機構(gòu)承擔(dān)了大范圍篩查的工作，確保了“應(yīng)檢盡檢、愿檢盡檢”的有序開展，適合本次大面積流行的新冠肺炎疫情。通過提供規(guī)模化和集約化的檢測服務(wù)，滿足常規(guī)檢測的需求，為臨床提供及時精準(zhǔn)的信息，繼而達(dá)到提高人民健康水平服務(wù)這一目標(biāo)[17]。

截至2021年2月10日，經(jīng)NMPA審批批準(zhǔn)26個新冠病毒核酸檢測試劑中(圖2)，不難發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-PCR，RT-PCR)技術(shù)憑借至少達(dá)10拷貝/反應(yīng)的靈敏度和96個樣本/批的檢測通量成為目前臨床上主流應(yīng)用于SARS-CoV-2核酸檢測的方法。RT-PCR檢測SARS-CoV-2核酸過程中將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行擴增，通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行跟蹤并進(jìn)行產(chǎn)物分析[18]。除了常見的以O(shè)RF1ab和N基因為靶點的RT-PCR檢測外，同時也存在針對E基因的臨床檢測。單靶、雙靶、三靶的檢測及不同判讀標(biāo)準(zhǔn)對實驗人員的專業(yè)素質(zhì)提出要求[19]，需執(zhí)PCR證上崗人員在PCR認(rèn)證實驗室開展。

圖2 NMPA獲批試劑盒檢測原理圖

此外，對已知的多種病原體核酸同時進(jìn)行意向性篩查也是一大臨床需求，即在識別SARS-CoV-2的同時，排查其他引起相似癥狀的病毒?；蛐酒ㄟ^微陣列技術(shù)，應(yīng)用已知序列的核酸探針對未知序列的核酸序列進(jìn)行大規(guī)模集成的固相雜交檢測DNA[20]。雙擴增法利用特異探針和標(biāo)記有多生物素的放大探針雜交，實現(xiàn)病原體靶核酸的信號放大[21]。同時，已有一些企業(yè)基于核酸質(zhì)譜技術(shù)開發(fā)了呼吸道病原體多重檢測試劑盒，樣品經(jīng)過多重PCR擴增后，用特異性的質(zhì)量探針進(jìn)行延伸反應(yīng)，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)檢測分子量的差異[22-23]。但核酸質(zhì)譜對環(huán)境設(shè)備和人員資質(zhì)具有一定要求，在檢驗科中難以普及，但在醫(yī)學(xué)獨立實驗室中可以展露鋒芒。

以上技術(shù)迎合了《新型冠狀病毒肺炎診療方案(第八版)》中對全面鑒別診斷新型冠狀病毒感染提出的要求，一次檢出包括SARS-CoV-2在內(nèi)的多種臨床常見呼吸道病原體。有效區(qū)分健康人群、新冠病毒感染者與其他呼吸道感染患者，實現(xiàn)對就診人群的快速檢測和準(zhǔn)確分類，從而大幅度降低疑似病例數(shù)量、降低醫(yī)患風(fēng)險、助力疫情防控。

2.1.2快速檢測 快速檢測是新冠肺炎常規(guī)化防控的前哨。床旁檢驗(point-of-care testing，POCT)中的分子診斷技術(shù)突破了專業(yè)實驗室的限制，實現(xiàn)去中心化，將應(yīng)用場景拓展到出入境、機場、火車站、基層醫(yī)療單位等。最大化分子診斷檢測效益，解除了核酸檢測對人員、儀器、場地的依賴性，改善了周轉(zhuǎn)周期的問題，迎合了對快速報告的需求[24]。

其中，等溫擴增(isothermal amplification technology，IAT)技術(shù)在恒定的溫度下，通過添加不同酶和特異性引物進(jìn)行快速核酸擴增。單一溫度對儀器要求低。目前主要的恒溫擴增技術(shù)有：滾環(huán)核酸擴增(rolling circle amplification，RCA)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、鏈替代擴增(strand displacement amplification，SDA)和依賴核酸序列擴增(nucleicacid sequence based amplification，NASBA)等(表2)[25-27]。目前已經(jīng)有基于此技術(shù)的POCT類商品化試劑盒，但尚無大量臨床驗證及應(yīng)用。而且由于該技術(shù)對引物設(shè)計復(fù)雜，可能存在假陰性和假陽性干擾[28]。

表2 基于等溫擴增技術(shù)的病毒核酸檢測對比

此外，基因編輯技術(shù)為基礎(chǔ)的核酸檢測也具有廣闊發(fā)展前景?；蚓庉嫾夹g(shù)是以規(guī)則成簇間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated，CRISPR/Cas)系統(tǒng)為代表，利用RNA引導(dǎo)Cas核酸酶，對基因及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行定點修飾編輯[29-30]。2020年5月，張鋒團隊提出的STOPCovid.v2(SHERLOCK testing in a one pot)技術(shù)是聯(lián)合RNA提取、LAMP和CRISPR介導(dǎo)的集大成者，對SARS-CoV-2檢出達(dá)到93.1%的靈敏度和98.5%的特異性，陽性樣本只需 15～45 min就能獲得結(jié)果且結(jié)果可視化[31-32]。

除以上主流POCT方法外，另有部分獲FDA或NMPA批準(zhǔn)的檢測技術(shù)，雖然缺少文獻(xiàn)報道但仍有一定應(yīng)用前景。例如，雜交捕獲免疫熒光分析法是將核酸雜交技術(shù)和免疫熒光捕獲技術(shù)相結(jié)合的方法。通過試劑直接裂解病原體并釋放靶核酸，利用熒光粒子對雜交體進(jìn)行熒光信號識別，實現(xiàn)對樣本中新冠病毒的特異性靶基因的定性判斷[33]。RNA捕獲探針法是用特異性靶標(biāo)捕獲法磁珠提取病毒RNA再結(jié)合轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的恒溫擴增結(jié)合的實時檢測技術(shù)[34-35]。兩種方法同樣兼具檢測設(shè)備體積小和單個樣本檢測時長短的優(yōu)勢，且兩種方法試劑商宣稱的檢測靈敏度、特異性都能夠達(dá)到傳統(tǒng)PCR方法的水平。

2.2病毒溯源及變異監(jiān)測 病毒溯源和變異監(jiān)測是疫情防控的“必答題”。第一時間獲取全部病毒基因信息，可以解釋病毒的來源、傳播、變異演化等科學(xué)問題、指明后續(xù)流行病學(xué)調(diào)查方向、助力病毒變異監(jiān)測。

得益于高通量測序(next generation sequencing，NGS)技術(shù)在疫情初期，僅5 d的時間內(nèi)獲得了SARS-CoV-2基因組序列，為進(jìn)行溯源工作和全世界抗擊病毒奠定了基礎(chǔ)[36]。NGS主要是對臨床樣本中提取的核酸進(jìn)行大規(guī)模平行測序，再經(jīng)過數(shù)據(jù)庫比對與生物信息學(xué)分析，完成包括病毒在內(nèi)的多種病原體檢測[37]?；贜GS的核酸檢測包括宏基因組測序、探針捕獲測序和擴增子測序(表3)[38]。檢測周期長、操作流程復(fù)雜、對生物信息學(xué)專業(yè)背景要求等限制使NGS難以成為臨床一線開展核酸檢測方法。

表3 基于NGS技術(shù)的病毒核酸檢測對比

目前，全球各地已檢測出各種變異SARS-CoV-2，依賴于NGS技術(shù)，各方也在開展相關(guān)病毒株變異監(jiān)測工作[39]，及時評估防疫措施，確保各環(huán)節(jié)預(yù)防效果。通常，病毒以每月大約1～2個堿基突變的速度積累突變。這意味著今天測序的許多基因組與2020年1月最早測序的基因組相差約20個位點。針對SARS-CoV-2突變株的研究認(rèn)為[40]，突變株在S蛋白(尤其RBD區(qū)域)上發(fā)生的突變不會影響以O(shè)RFlab、N、E基因為靶點的核酸檢測試劑的檢測能力。但新發(fā)突變株B.1.1.7中發(fā)現(xiàn)的69/70缺失突變已被證實會影響針對S基因的聚合酶鏈反應(yīng)檢測的性能[41-42]。

2.3參考品制作 各實驗室、地區(qū)、國家之間的SARS-CoV-2核酸測量結(jié)果都需要通過一致性計劃并進(jìn)行準(zhǔn)確性工作。數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)技術(shù)將反應(yīng)混合物分割成上千至上萬個不等的液滴，讀取每一獨立反應(yīng)單元的擴增情況，利用泊松分布，實現(xiàn)模板DNA的絕對定量。檢測原理加之其獨立于校準(zhǔn)曲線的特性使其具備高檢測靈敏度(2.5個拷貝/反應(yīng))及抗干擾能力，使其可以被利用于SARS-CoV-2核酸檢測參考品制備。此外，多項獨立研究表明，SARS-CoV-2核酸檢測性能大大優(yōu)于RT-PCR[43-44]。帶來檢測性能提升的同時，也增加了操作和成本的負(fù)擔(dān)。因此，dPCR技術(shù)應(yīng)用更偏向于動態(tài)監(jiān)測病毒載量和環(huán)境監(jiān)測(如公共場所、病房、衛(wèi)生間、實驗室手套、廢水等)等[45]。

以上提到的所有核酸檢測技術(shù)，都可作為標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR方法的補充，互為驗證。尤其對于“灰區(qū)”患者復(fù)檢、疑似患者排查和感染初期病毒載量低的患者，應(yīng)更為謹(jǐn)慎。除了多技術(shù)檢測的核酸結(jié)果外，IgM/IgG抗體結(jié)果、影像學(xué)、流行病學(xué)史和臨床表現(xiàn)等都有所幫助，應(yīng)根據(jù)實際情況選擇使用。

3 小結(jié)及展望

盡管COVID-19疫情尚未戰(zhàn)勝，但本次疫情中分子診斷技術(shù)的角色和效用可以作為未來傳染病暴發(fā)中的范例。檢測能力的提升對于控制疫情必不可少，質(zhì)量控制和技術(shù)創(chuàng)新密不可分。

核酸檢測的可靠性和有效性是第一優(yōu)先級。實驗室應(yīng)不斷加強自身能力建設(shè)、對不同廠家試劑進(jìn)行嚴(yán)格性能驗證與比對、做好日常室內(nèi)質(zhì)控，并常態(tài)化接受國家級或省級檢驗質(zhì)量控制以助力患者的臨床管理。各省級衛(wèi)生健康行政部門要加強對核酸檢測實驗室的日常質(zhì)量控制工作，組織實驗室參加室間質(zhì)評并對實驗質(zhì)評結(jié)果進(jìn)行及時地回顧、反饋及干預(yù)。進(jìn)一步提高核酸檢測質(zhì)量，從而降低臨床假陰性風(fēng)險、有效控制病毒傳播[46-47]。實驗室人員和試劑研發(fā)人員應(yīng)時刻關(guān)注突變株對病原體核酸檢測的影響。通過對照公開的病毒基因組序列數(shù)據(jù)庫定期評估和修正引物集及檢測體系，以保證檢測有效性?？茖W(xué)家們應(yīng)對研發(fā)更快、更便捷、更準(zhǔn)確、更安全的核酸檢測迭代技術(shù)和搭建POCT平臺保持熱度，適應(yīng)疫情偶發(fā)和常態(tài)化的現(xiàn)實狀況，滿足防控要求。

COVID-19疫情引發(fā)了對分子診斷技術(shù)的開發(fā)和投資。在此次寶貴經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，臨床醫(yī)生、科學(xué)家和公共衛(wèi)生管理人員之間的多學(xué)科合作無疑可以實現(xiàn)向其他病原體疾病的拓展。

利益沖突：作者聲明無任何利益沖突