王冰，王月鵬，陳北平

(盤錦市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，遼寧盤錦124000)

三陰性乳腺癌(triple-negative breast carcinoma，TNBC)患者乳腺癌組織免疫染色檢測(cè)雌、孕激素受體和人表皮生長(zhǎng)因子受體2表達(dá)均為陰性，約占乳腺癌的15%～20%。新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy，NAC)已廣泛用于治療TNBC，但腫瘤對(duì)化療藥物具有耐受性[1]，因此，TNBC生物學(xué)標(biāo)志物用于NAC療效預(yù)測(cè)成為目前研究熱點(diǎn)。微小RNA(microRNA，miRNA)作為內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，調(diào)控大部分基因的表達(dá)，在應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞增殖等進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-335和miR-146a異常表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲有關(guān)[3-4]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，血清miR-335表達(dá)降低參與了乳腺癌發(fā)生，可作為早期診斷乳腺癌的指標(biāo)[5]；miR-146a過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性[6]。但二者與NAC治療后TNBC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系尚不十分明確。本研究旨在測(cè)定TNBC患者血清miR-335和miR-146a的表達(dá)水平，并分析其與NAC療效、患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2016年6月至2018年6月盤錦市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科就診且經(jīng)NAC治療并行改良根治性手術(shù)、乳腺癌保乳手術(shù)、乳腺單切除的TNBC患者84例作為TNBC組，年齡(45.06±4.07)歲，均為女性。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理組織學(xué)確診為TNBC[7]；(2)非哺乳期或妊娠期患者；(3)臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)除三陰性乳腺癌外還患有其他腫瘤；(2)肝腎功能不全者。其中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌71例，浸潤(rùn)性小葉癌13例。未絕經(jīng)患者49例，絕經(jīng)患者35例。美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(american joint committeeon cancer，AJCC)臨床分期：Ⅱ期54例，Ⅲ期30例。另選取行手術(shù)治療的非三陰性乳腺癌患者84例(乳腺纖維腺瘤37例，乳腺導(dǎo)管擴(kuò)張癥25例，乳腺囊性增生22例)作為非TNBC組，年齡(44.93±5.08)歲，均為女性；收集同期于體檢中心體檢健康者84例作為健康人對(duì)照組。年齡(44.27±5.19)歲，均為女性。3組受試者年齡間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.652，P=0.522)。本研究經(jīng)盤錦市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：2015117)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2TNBC患者NAC方案及隨訪 所有TNBC患者手術(shù)前均接受NAC方案：阿霉素聯(lián)合環(huán)磷酰胺、表阿霉素聯(lián)合環(huán)磷酰胺或紫杉類藥聯(lián)合以上方案。4個(gè)療程后行手術(shù)治療，手術(shù)后繼續(xù)化療2個(gè)療程，化療過(guò)程中根據(jù)病情需要可提前進(jìn)行手術(shù)治療。NAC治療后64例患者行改良根治性手術(shù)，12例患者行保乳手術(shù)，8例患者行乳腺單切除手術(shù)。根據(jù)NAC治療后是否病理完全緩解(pathologic complete response，pCR)，分為pCR組32例和非pCR組52例。TNBC患者出院后，采取電話隨訪、門診復(fù)查、住院檢查的方式進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間為6～36個(gè)月，以患者死亡、失訪或最后1次隨訪時(shí)間為終點(diǎn)。記錄隨訪期間患者的生存狀況。

1.3樣本采集 健康人對(duì)照組于體檢當(dāng)日，非TNBC組患者于入院第2日清晨，TNBC組患者于NAC治療前及治療4、6個(gè)療程后，采集清晨空腹靜脈血6 mL，室溫下靜置20 min，4 ℃、5 000 r/min離心20 min，吸取上清液，置于-80 ℃保存。

1.4試劑和儀器 RNA提取試劑盒(北京索萊寶公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量(quantitative real-time，RT-qPCR)試劑盒(美國(guó)Bioworld公司)。UV-3200紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器公司),CFX96型RT-qPCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.5RT-qPCR檢測(cè)血清中miR-335、miR-146a的表達(dá)水平 取各組血清樣本100 μL，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，取UV-3200紫外分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度(A260/280 nm)值為1.8～2.0之間的樣本，置于-80 ℃保存。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，樣本置于-20 ℃保存。根據(jù)GenBank中提供的miR-335(序列號(hào)：NC_000072.7)、miR-146a(序列號(hào)：NC_000005.10)及U6(序列號(hào)：NC_015438.3)的基因序列，由上海吉瑪生物公司設(shè)計(jì)并合成。miR-335上游引物序列：5′-TAGCTTATCAGACTG-A-3′，下游引物序列：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′，退火溫度60 ℃，產(chǎn)物片段大小217 bp。miR-146a上游引物序列：5′-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3′，下游引物序列：5′-CCCATGGAATTCAGTTCTCATT3′，退火溫度63 ℃，產(chǎn)物片段大小269 bp。U6上游引物序列：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物序列：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，退火溫度60 ℃，產(chǎn)物片段大小253 bp。按照RT-qPCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行擴(kuò)增，PCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括SYBR Green Mix 10 μL，10 mmol/L上、下游引物各2 μL，cDNA 2 μL，RNase-free ddH2O 4 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 s，共45個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參照，采用2-△Ct法對(duì)miR-335、miR-146a的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和分析，計(jì)量資料采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，存在差異時(shí)以LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Pearson檢驗(yàn)分析NAC治療前后TNBC患者血清miR-335與miR-146a表達(dá)水平的相關(guān)性；采用Kaplan-Meier法分析NAC治療后miR-335、miR-146a表達(dá)水平與TNBC患者3年生存率的關(guān)系；采用Cox回歸分析影響TNBC患者NAC治療后預(yù)后的危險(xiǎn)因素。

2 結(jié)果

2.1各組血清miR-335、miR-146a表達(dá)水平的比較 健康人對(duì)照組miR-335、miR-146a的表達(dá)水平分別為1.02±0.12、1.01±0.12，非TNBC組miR-335、miR-146a的表達(dá)水平分別為0.81±0.20、0.87±0.22，TNBC組miR-335、miR-146a的表達(dá)水平分別為0.43±0.08、0.56±0.11，3組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為370.678、178.430，P均<0.01)。此外，與健康人對(duì)照組相比，非TNBC組、TNBC組血清miR-335、miR-146a的表達(dá)水平均降低(miR-335的t值分別為13.520、37.984，miR-146a的t值分別8.121、26.102，P均<0.05)；與非TNBC組相比，TNBC組血清miR-335、miR-146a的表達(dá)水平均降低(t值分別為24.464、17.981，P均<0.05)。

2.2TNBC患者NAC治療前后血清miR-335、miR-146a表達(dá)水平的比較 NAC治療前miR-335、miR-146a的表達(dá)水平分別為0.43±0.08、0.56±0.11，NAC治療4個(gè)療程后miR-335、miR-146a的表達(dá)水平分別為0.51±0.10、0.70±0.18，NAC治療6個(gè)療程后miR-335、miR-146a的表達(dá)水平分別為0.75±0.17、0.83±0.21，3組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為154.278、51.860，P均<0.01)。與NAC治療前相比，NAC治療4、6個(gè)療程后血清miR-335、miR-146a的表達(dá)水平均升高(miR-335的t值分別為5.967、23.867，miR-146a的t值分別7.466、14.399，P均<0.05)；與NAC治療4個(gè)療程后相比，NAC治療6個(gè)療程后血清miR-335、miR-146a的表達(dá)水平均升高(t值分別為17.900、6.933，P均<0.05)。

2.3NAC治療前miR-335和miR-146a的表達(dá)與TNBC患者臨床病理參數(shù)關(guān)系 血清miR-335、miR-146a表達(dá)水平與TNBC患者年齡、臨床分期、腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05)，而與有無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移、有無(wú)脈管瘤栓相關(guān)(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 NAC治療前miR-335和miR-146a的表達(dá)與TNBC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4NAC治療前TNBC患者血清miR-335與miR-146a表達(dá)水平的相關(guān)性 Pearson檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，NAC治療前TNBC患者血清miR-335與miR-146a的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.493，P=0.000)，NAC治療4、6個(gè)療程后TNBC患者血清miR-335與miR-146a的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r分別為0.385和0.402，P均=0.000)。

2.5NAC治療前miR-335、miR-146a表達(dá)水平與化療療效的關(guān)系 非pCR組miR-335的表達(dá)水平為0.38±0.06，顯著低于pCR組的(0.51±0.09)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.947，P=0.000)；而非pCR組miR-146a的表達(dá)水平為0.50±0.09，顯著低于pCR組的(0.66±0.12)，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.956，P=0.000)。

2.6NAC治療后miR-335、miR-146a表達(dá)水平與TNBC患者3年生存率的關(guān)系 根據(jù)NAC治療后miR-335均值(0.75)，將其分為低表達(dá)組(44例)和高表達(dá)組(40例)，根據(jù)NAC治療后miR-146a均值(0.83)，將其分為低表達(dá)組(42例)和高表達(dá)組(42例)。分析結(jié)果表明，經(jīng)NAC治療后miR-335低表達(dá)、miR-146a低表達(dá)組TNBC患者的3年生存率(13.64%和11.90%)均顯著低于miR-335高表達(dá)和miR-146a高表達(dá)(32.50%、33.33%)組患者(χ2值分別為4.260、5.509，P分別為0.039、0.019)。NAC治療后miR-335低表達(dá)組TNBC患者的中位生存時(shí)間(25.60個(gè)月)和miR-146a低表達(dá)組患者的中位生存時(shí)間(23.80個(gè)月)均顯著少于miR-335高表達(dá)組患者(33.20個(gè)月)和miR-146a高表達(dá)組患者(33.02個(gè)月)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為4.524、5.009，P均=0.000)，結(jié)果見(jiàn)圖1、2。

圖1 NAC治療后miR-335表達(dá)與TNBC患者生存率關(guān)系

圖2 NAC治療后miR-146a表達(dá)與TNBC患者生存率的關(guān)系

2.7影響TNBC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素 Cox回歸分析結(jié)果表明，有脈管瘤栓、NAC治療后miR-335和miR-146a低表達(dá)是影響TNBC患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 影響TNBC患者NAC治療后預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

3 討論

miR-335在多種腫瘤中呈異常表達(dá)，可能參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程。研究表明，miR-335低表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生有關(guān)，可作為潛在的診斷標(biāo)志物[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清miR-335表達(dá)水平由高至低依次為健康人對(duì)照組、非TNBC組、TNBC組，NAC治療6個(gè)療程后、NAC治療4個(gè)療程后、NAC治療前。這與Hao等[9]研究結(jié)果相似，其證實(shí)TNBC組織中miR-335呈低表達(dá)，且miR-335過(guò)表達(dá)可增加癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇、順鉑和阿霉素的敏感性，提高化療效果[9]。故而筆者推測(cè)血清miR-335表達(dá)水平升高可能與TNBC發(fā)生有一定關(guān)聯(lián)，而NAC治療能上調(diào)TNBC患者血清中miR-335的表達(dá)水平，表明NAC治療可能通過(guò)調(diào)控miR-335表達(dá)改善TNBC疾病狀態(tài)。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-335水平與TNBC患者有無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移、有無(wú)脈管瘤栓有關(guān)，提示miR-335可能參與TNBC發(fā)展進(jìn)程。此外，與pCR組相比，非pCR組miR-335的表達(dá)水平較低，miR-335低表達(dá)組TNBC患者3年生存率顯著低于miR-335高表達(dá)組患者，且患者中位生存時(shí)間也較短，與余進(jìn)松等[10]的研究結(jié)果相似，提示miR-335可能與NAC療效、患者預(yù)后有關(guān)。

miR-146a作為免疫反應(yīng)調(diào)控因子，在乳腺癌等多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要的作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-146a表達(dá)水平由高至低依次為健康人對(duì)照組、非TNBC組、TNBC組，NAC治療6個(gè)療程后、NAC治療4個(gè)療程后、NAC治療前，且組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示miR-146a可能參與了TNBC發(fā)病過(guò)程，而NAC治療能上調(diào)TNBC患者血清中miR-146a的表達(dá)水平，提示miR-146a高表達(dá)可能有助于TNBC治療，其作用機(jī)制可能是miR-146a可通過(guò)阻滯乳腺癌細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而發(fā)揮抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的作用[12-13]。miR-146a與TNBC患者有無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移、有無(wú)脈管瘤栓相關(guān)，與付明剛等[13]研究結(jié)果類似，提示miR-146a可能通過(guò)某種機(jī)制在TNBC發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。筆者通過(guò)預(yù)后隨訪發(fā)現(xiàn)，與pCR組相比，非pCR組miR-146a的表達(dá)水平較低，miR-146a低表達(dá)TNBC患者的生存率亦低于miR-146a高表達(dá)患者，且低表達(dá)患者的中位生存時(shí)間更短，提示miR-146a高表達(dá)可能有助于提高NAC療效，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間。但本研究隨訪時(shí)間相對(duì)較短，今后需延長(zhǎng)隨訪年限，繼續(xù)探討miR-146a與TNBC患者遠(yuǎn)期生存的關(guān)系。本研究進(jìn)一步行Pearson檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，NAC治療前TNBC患者血清miR-335與miR-146a的表達(dá)水平呈正相關(guān)，且二者低表達(dá)是影響NAC治療后TNBC患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示miR-335、miR-146a有望成為評(píng)價(jià)NAC治療后TNBC患者預(yù)后的血清學(xué)指標(biāo)。

綜上所述，NAC治療可上調(diào)TNBC患者血清miR-335、miR-146a的表達(dá)水平，且與有無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移、有無(wú)脈管瘤栓、NAC療效、患者生存率有關(guān)，有望成為評(píng)價(jià)NAC療效和預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)，但二者參與調(diào)控TNBC機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。