時文麗，袁二鳳，田遠(yuǎn)，高金爽，郭亞清，桑敏，楊麗君，張琳琳

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，a.婦產(chǎn)科，b.檢驗科，鄭州 450052)

據(jù)統(tǒng)計，我國出生缺陷發(fā)生率約為5.6%[1]，其中胎兒染色體異常是導(dǎo)致新生兒出生缺陷疾病的重要原因之一。目前我國針對染色體異常的主要產(chǎn)前篩查手段是唐氏綜合征產(chǎn)前篩選檢查(唐篩)和無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)(noninvasive prenatal test, NIPT)。唐篩是利用母體血清學(xué)指標(biāo)[2]對21/18三體綜合征進(jìn)行風(fēng)險評估，當(dāng)胎盤或胎兒結(jié)構(gòu)存在異常時可導(dǎo)致孕婦血清生化指標(biāo)的改變。NIPT是利用新一代DNA測序技術(shù)對母體外周血漿中的游離DNA片段(包含胎兒游離DNA)進(jìn)行測序，特異性識別被檢胎兒是否患21/18/13三體綜合征。故而唐篩的特異性和敏感性均不如NIPT。但多項研究證實，唐篩假陽性結(jié)果往往與非21/18三體的染色體異常相關(guān)[3-5]。隨著產(chǎn)前診斷技術(shù)的發(fā)展，染色體微陣列(chmmosomal microamy analysis，CMA)技術(shù)和基于二代測序的低深度全基因組拷貝數(shù)變異(CNVseq)檢測也逐步應(yīng)用于臨床，二者可以檢測1×105bp以上的染色體微缺失/微重復(fù)。但該兩項技術(shù)在產(chǎn)前應(yīng)用的適應(yīng)癥中均未提及唐篩高風(fēng)險或臨界風(fēng)險人群[6-7]。本研究通過分析自愿選擇CMA或CNVseq技術(shù)的人群數(shù)據(jù)，旨在探討唐篩對非21/18三體染色體異常的檢測出效能，分析致病性或傾向致病性CNVs的檢出率，以期為唐篩高風(fēng)險和臨界風(fēng)險孕婦后續(xù)產(chǎn)前診斷的實驗室檢測方案的選擇提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1研究對象 選擇2018年12月至2019年12月因唐篩高風(fēng)險或臨界風(fēng)險在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院產(chǎn)科門診就診且行羊水CMA或CNVseq檢測的孕婦3 028例，年齡19～45歲，孕齡17～25周。根據(jù)產(chǎn)前篩查中心報告的唐篩風(fēng)險結(jié)果分為高風(fēng)險組(2 555例)和臨界風(fēng)險組(473例)，其中高風(fēng)險組為血清學(xué)篩查提示21-三體綜合征高風(fēng)險(≥1∶270)和(或)18-三體綜合征高風(fēng)險(≥1∶350)的孕婦；臨界風(fēng)險組為血清學(xué)篩查提示21-三體臨界風(fēng)險(1∶270～1∶1 000)和(或)18-三體臨界風(fēng)險(1∶350～1∶1 000)的孕婦。所有病例均為自然受孕、單胎妊娠，進(jìn)行產(chǎn)前診斷前無胎兒超聲異常表現(xiàn)；排除具有染色體異常遺傳病史及家族病史、妊娠前患有基礎(chǔ)疾病(如高血壓、糖尿病、血液疾病、肝腎功能不全及惡性腫瘤)等可能影響母體血清標(biāo)志物水平因素的孕婦。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：2021-WZ-007)，孕婦及家屬簽署知情同意書。

1.2主要儀器與試劑 GE Voluson E8型彩色多普勒超聲診斷儀(美國GE公司)，臺式高速離心機(jī)(美國Thermo Fisher公司)，ABI 9700 PCR System(美國Applied Biosystems公司)，基因組DNA純化濃縮儀(Genomic DNA Clean&Concentrator，美國Zymo公司)，Affymatrix CytoScan 750K芯片(美國Thermo公司)，Nextseq CN500高通量測序儀(美國Illumina公司)。QIAamp血液DNA純化試劑盒(德國Qiagen公司)。

1.3方法

1.3.1羊水組織收集 孕婦在完善血常規(guī)、血凝、傳染病4項(包括艾滋病、乙肝、丙肝和梅毒)、心電圖、胎兒常規(guī)超聲檢查后，在產(chǎn)前診斷門診行B超輔助下羊膜腔穿刺術(shù)，無菌抽取羊水8～15 mL，置于4 ℃保存。采集標(biāo)本時避免血液污染。

1.3.2基因組DNA提取及檢測 采用離心法(15 000 r/min離心10 min)收集離心管底白色沉淀，即胎兒的脫落細(xì)胞，按照QIAamp血液DNA純化試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞DNA抽提。對采用CMA檢測的孕婦，采用短串聯(lián)重復(fù)(short tandem repeat，STR)位點比對法進(jìn)行母血污染的鑒定，確認(rèn)無母血污染后，按照Affymatrix CytoScan 750K芯片說明書進(jìn)行CMA檢測，包括酶切消化、PCR、標(biāo)記、雜交芯片掃描等操作。對采用CNVseq檢測的孕婦，采用磁珠法提取DNA，將50 ng DNA用于構(gòu)建DNA文庫。使用Nextseq CN500高通量測序儀對全基因組DNA進(jìn)行測序。

1.3.3數(shù)據(jù)分析 將上述兩種測序方式得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行序列比對和數(shù)據(jù)分析，獲取全部≥1×105bp的染色體基因組拷貝數(shù)變異。將上述染色體基因組拷貝數(shù)變異數(shù)據(jù)分別與人類染色體變異數(shù)據(jù)庫(database of chromosomal imbalance and phenotype in humans using ensemble resources，DECIPHER，https://decipher.sanger.ac.uk)、基因變異數(shù)據(jù)庫(database of genomic variants，DGV，http://projiects.tcag.ca/variation)、細(xì)胞基因組國際標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(International Standards for Cytogenomic Arrays，ISCA，http://www.iscaconsortium.org/)、GeneReviews數(shù)據(jù)庫(https://www.generreviews.org/)、Clingen數(shù)據(jù)庫(https://dosage.clinicalgenome.org/)和在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online Mendelian inheritance in man，OMIM，http://www.omim.org/)中的已有數(shù)據(jù)進(jìn)行比對[8]，按照2020年美國醫(yī)學(xué)遺傳會與基因組學(xué)會(ACMG)標(biāo)準(zhǔn)[9]進(jìn)行致病性分析，將檢出的CNVs分為致病性、傾向致病性、臨床意義不明確、傾向良性、良性5個級別，并著重分析致病性或傾向致病性CNVs。

2 結(jié)果

2.1唐篩高風(fēng)險或臨界風(fēng)險孕婦的CMA或CNVseq檢測結(jié)果 3 028例孕婦中唐篩高風(fēng)險孕婦2 555例、臨界風(fēng)險473例，二者共檢出胎兒致病性或傾向致病性染色體異常107例，占3.53%(107/3 028)，其中21/18三體綜合征55例，占1.82%(55/3 028),性染色體異常7例，占0.23%(7/3 028)，致病性或傾向致病性CNVs 44例，占1.45%(44/3 028)。結(jié)果見表1。

表1 3 028例孕婦中各種致病性或傾向致病性染色體異常的檢出情況及比較[n(%)]

2.2唐篩高風(fēng)險或臨界風(fēng)險孕婦中CNVs的檢出情況 唐篩高風(fēng)險或臨界風(fēng)險孕婦經(jīng)CMA或CNVseq檢測驗證后提示存在CNVs 106例，按照ACMG標(biāo)準(zhǔn)分級，分為致病性CNVs 28例，傾向致病性CNVs 16例。見表2。

表2 CNVs致病性情況分析[n(%)]

按照ACMG標(biāo)準(zhǔn)對CNVs的評級,在28例致病性CNVs中明確綜合征疾病22例，其中1個病例含2個致病性綜合征。包括類固醇硫酸酯酶缺乏癥(STS)9例、Xq28微重復(fù)綜合征2例、Digeorge綜合征2例、16p11.2微重復(fù)綜合征2例、16p11.2微缺失綜合征、17q21.3微缺失綜合征、16p13.11微缺失綜合征、22q11.2微重復(fù)綜合征、PWS/AS綜合征、2q37微缺失綜合征、1q21.1微缺失綜合征、Xp11.23微缺失綜合征各1例。

2.3唐篩高風(fēng)險組和臨界風(fēng)險組提示染色體異常檢出率的比較 高風(fēng)險組和臨界風(fēng)險組對21/18三體、致病性或傾向致病性非21/18三體染色體異常和CNVs的檢出率結(jié)果見表1。分別對兩組進(jìn)行卡方檢驗，發(fā)現(xiàn)唐篩高風(fēng)險組對21/18三體的檢出率明顯高于臨界風(fēng)險組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.392，P=0.036)；但對致病性或傾向致病性非21/18三體的染色體異常的檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.114，P=0.735)；對致病性或傾向致病性CNVs的檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.003，P=0.958)。

2.421/18三體綜合征與致病性或傾向致病性的CNVs檢出率的比較 納入研究的所有孕婦中胎兒致病性或傾向致病性CNVs的檢出率為1.45%(44/3 028)；胎兒21/18三體綜合征的檢出率為1.82%(55/3 028)。唐氏篩查對21/18三體綜合征的檢出率與致病性或傾向致病性CNVs的檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.243，P=0.265)。

3 討論

染色體異常是新生兒出生缺陷的重要原因之一，目前唐篩對21/18三體綜合征的產(chǎn)前篩查價值已得到廣泛認(rèn)可，本研究重點分析唐篩結(jié)果陽性孕婦中非21/18三體染色體異常情況。目前產(chǎn)前診斷的方法眾多，其中CMA[10]和CNVseq[11-12]檢測技術(shù)是對全基因組進(jìn)行覆蓋檢測，可發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)染色體核型分析不能檢測的染色體微缺失/微重復(fù)，且自動化程度高，結(jié)果判斷相對客觀。有研究報道，CMA或CNVseq檢測染色體非整倍體及CNVs的敏感性及特異性均為100%[13]。因此，本研究應(yīng)用CMA和CNVseq檢測技術(shù)對唐篩高風(fēng)險或臨界風(fēng)險孕婦羊水進(jìn)行驗證。

唐篩作為一種廣泛應(yīng)用但特異性不高的產(chǎn)前篩查手段，對于非21/18三體染色體異常也有一定的提示作用。2018年，Lindquist等[14]通過對澳大利亞墨爾本地區(qū)2014和2015年行產(chǎn)前檢測的孕婦進(jìn)行回顧性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在傳統(tǒng)孕早期血清學(xué)篩查結(jié)果為高風(fēng)險的人群中，可以檢出大量21/18/13三體綜合征之外的其他染色體異常。2018年，Vogel等[4]在丹麥地區(qū)發(fā)現(xiàn)孕早期篩查對致病性CNVs具有一定的檢出作用。本研究對唐篩高風(fēng)險和臨界風(fēng)險孕婦中染色體異常結(jié)果分析顯示致病性或傾向致病性CNVs的檢出率達(dá)1.45%，而人群中CNVs總體發(fā)病率為0.37%(1/270)，遠(yuǎn)高于人群中染色體異常的發(fā)生率，說明當(dāng)唐篩存在高風(fēng)險或臨界風(fēng)險時，應(yīng)考慮到非21/18三體染色體異常，特別是CNVs的可能性。本研究進(jìn)一步對檢出的致病性CNVs進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該類患者多伴有智力低下、精神異常、發(fā)育遲緩、多器官畸形等癥狀，但本研究中檢出率最高的類固醇硫酸酯酶缺乏癥(STS)主要表現(xiàn)為皮膚魚鱗樣改變，致死致畸率低，這可能是人群中高發(fā)的原因之一，在遺傳咨詢時要告知患者可能存在的相關(guān)風(fēng)險。本研究結(jié)果提示高風(fēng)險和臨界風(fēng)險人群中21/18三體綜合征與致病性或傾向致病性CNVs的檢出率基本一致，但目前針對唐篩存在風(fēng)險孕婦行進(jìn)一步產(chǎn)前診斷多采用染色體核型分析，因此，存在漏診致病性或傾向致病性CNVs的情況。故而建議后續(xù)進(jìn)行產(chǎn)前診斷時應(yīng)納入CMA或CNVseq檢測技術(shù)，避免染色體異常出生缺陷兒的出生。

然而，CMA或CNVseq在檢出致病性或傾向致病性CNVs的同時，也檢出了部分目前臨床意義不明確的CNVs，這給遺傳咨詢時對其的解讀帶來了挑戰(zhàn)和困難，同時也給孕婦及家屬造成困擾。Miller等[15]研究發(fā)現(xiàn)，約12%找不到具體原因的先天畸形胎兒是由染色體微缺失微重復(fù)導(dǎo)致的。因此，隨著檢測水平的不斷提高，在大量數(shù)據(jù)研究論證下那些臨床意義不明確CNVs可能是致病性的，這也將成為未來研究的熱點。