路鵬飛 田俊華 楊 程

1 重慶市長(zhǎng)壽區(qū)人民醫(yī)院骨一科 401220； 2 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九九〇醫(yī)院骨科； 3 岳陽(yáng)市第一人民醫(yī)院骨科

股骨骨不連指股骨骨折經(jīng)過(guò)治療，8個(gè)月后仍達(dá)不到骨性愈合，連續(xù)3個(gè)月未見(jiàn)任何愈合現(xiàn)象，稱之為股骨骨不連[1]。股骨骨不連主要包括萎縮性、肥大性以及滑膜假關(guān)節(jié)形成性骨不連[2]，然而其具體發(fā)生機(jī)制尚不明確。目前認(rèn)為原因有軟組織破壞、血運(yùn)不佳、大塊骨缺損、骨折端固定不牢等，造成新生骨折斷端部分骨質(zhì)喪失、缺損間隙纖維瘢痕肉芽組織填充、骨折斷端間連續(xù)骨痂形成缺少、骨性愈合延長(zhǎng)或骨不連[3-4]。近有研究發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP7)/轉(zhuǎn)錄因子蛋白2(Transcription factor protein 2，Runx2)信號(hào)通路可調(diào)節(jié)成骨分化及礦化并參與骨骼生長(zhǎng)、修復(fù)、股骨形成、骨愈合等生理過(guò)程[5-6]。本研究所采用的三花接骨散具有活血化瘀、消腫止痛、接骨續(xù)筋等功效，臨床上常用于治療骨折筋傷、瘀血腫痛等癥狀[7]。但三花接骨散對(duì)股骨骨不連骨愈合的作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究建立大鼠股骨骨不連模型，對(duì)此進(jìn)行探討，以期為臨床用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)(SPF)同遺傳背景SD雄性大鼠60只，體重200～220g，6～7周育齡，購(gòu)自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部[SCXK(京)2014-0018]。所有大鼠于本院動(dòng)物房中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：自然光照，自由飲食、飲水，溫度25℃，相對(duì)濕度50%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遵循3R原則。

1.2 主要試劑及儀器 三花接骨散(批號(hào)：2019122501，購(gòu)自營(yíng)口三花制藥有限公司，規(guī)格：5g/袋)；復(fù)方骨肽注射液(批號(hào)：2019062101，購(gòu)自南京新百藥業(yè)有限公司，規(guī)格：5ml∶75mg/支)；HE染色試劑盒(貨號(hào)E677218-0200，購(gòu)自上海生物公司)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)ELISA試劑盒(貨號(hào)：LCS30913，購(gòu)自廈門(mén)侖昌碩生物科技有限公司)；血小板衍生因子(PDGF)ELISA試劑盒(貨號(hào)：70-EK9137-96，購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；BMP-7、骨鈣素(Osteocalcin，OCN)、轉(zhuǎn)錄因子蛋白2(Runx2)等抗體(貨號(hào)：ab129156、ab93876、ab76956)等，均購(gòu)自美國(guó)abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒(貨號(hào)：P0768，購(gòu)自美國(guó)Pierce公司)。光學(xué)顯微鏡(型號(hào)SMZ745，日本尼康公司)；半干轉(zhuǎn)膜儀(型號(hào)Trans-Blot SD，美國(guó)Bio-Rad公司)等。

1.3 方法

1.3.1 大鼠股骨骨不連模型建立及分組給藥：參照文獻(xiàn)[8]構(gòu)建股骨骨不連模型，具體操作方法為：用3%戊巴比妥鈉麻醉，將動(dòng)物俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，取右側(cè)髕旁縱行5mm切口，牽開(kāi)髕骨暴露股骨遠(yuǎn)端內(nèi)外側(cè)髁，用電鉆將1根克氏針從內(nèi)外髁之間逆行打入至髓腔并自股骨近側(cè)端穿出皮膚，將遠(yuǎn)端克氏針截?cái)嗖⒈ＷC其埋入膝關(guān)節(jié)面下。于股骨中段外側(cè)切約1mm切口，沿肌間隙暴露股骨，用線鋸鋸斷(注意保護(hù)周圍肌肉血管等軟組織)，將骨折端兩側(cè)骨膜各灼燒2mm(仔細(xì)操作防止灼燒致骨皮質(zhì)壞死)，用無(wú)菌生理鹽水沖洗切口及皮膚并用尼龍線縫合，術(shù)后大鼠自然清醒，右下肢活動(dòng)欠佳視為造模成功。正常對(duì)照組10只大鼠骨折端不做處理，其余同模型組。將造模成功SD大鼠隨機(jī)分為模型組，三花接骨散低(1g/kg)、中(4g/kg)、高(8g/kg)劑量組，復(fù)方骨肽注射液組(陽(yáng)性組，25mg/kg)，每組10只。術(shù)后待大鼠清醒開(kāi)始給藥，三花接骨散參照文獻(xiàn)[7]及人大鼠等效劑量換算設(shè)置各劑量組，并用生理鹽水配置為0.10、0.40、0.80g/ml的混懸液，以10ml/kg劑量灌胃給藥；陽(yáng)性組參照文獻(xiàn)[9]經(jīng)皮下以10ml/kg的劑量注射復(fù)方骨肽注射液(2.50mg/ml)；正常對(duì)照組、模型組灌胃給予等劑量生理鹽水。均連續(xù)給藥8周，2次/d。

1.3.2 X射線檢測(cè)大鼠股骨愈合情況：末次給藥禁食禁水12h后，用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，采用Faxitron小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)對(duì)右后肢股骨骨折處拍攝數(shù)字X線攝影(Digital radiography，DR)片，并進(jìn)行評(píng)分。各組評(píng)分取平均值，評(píng)分越高，預(yù)示骨折愈合情況越好。

1.3.3 標(biāo)本采集：做完X射線檢測(cè)后，將各組大鼠麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血3ml置于肝素鈉抗凝管中，抗凝15min后，在3 000r/min條件下離心10min，取上清液，置于-20℃冰箱中保存；斷頭處死大鼠，剝離大鼠右后肢皮膚，取右后肢完整股骨，查看骨折愈合情況，包括骨痂色澤、質(zhì)地、斷端活動(dòng)等。用小刀刮取骨折線處結(jié)痂組織0.5g置于-80℃冰箱保存，取骨折端、骨不連連接區(qū)組織及兩側(cè)正常股骨約1cm，置于4%中性多聚甲醛固定24h備用。

1.3.4 血清VEGF、PDGF指標(biāo)檢測(cè)：取1.3.3項(xiàng)下-20℃保存的血清，置于4℃冰箱中解凍后，采用ELISA試劑盒分別檢測(cè)血清VEGF、PDGF水平，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.5 股骨組織HE染色：取1.3.3中固定24h后的股骨組織，用10%乙二胺四乙酸脫鈣1周，若注射器針頭可輕松刺入骨質(zhì)中表示脫鈣完成。然后進(jìn)行常規(guī)透明、浸蠟、包埋、切片，取部分切片進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察股骨組織形態(tài)變化，并參照文獻(xiàn)[10]根據(jù)骨愈合(NILSSON)組織學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。

1.3.6 Western blot法檢測(cè)骨痂組織BMP-7、OCN、Runx2蛋白的表達(dá)：取1.3.3中-80℃保存骨痂組織，用蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白總濃度。取50μg蛋白上樣，進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，TBST溶液清洗后，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1h，TBST溶液清洗3次后，加入一抗[BMP-7、OCN、Runx2、β-actin(內(nèi)參)抗體，稀釋倍數(shù)分別為1∶500，1∶500，1∶5 000，1∶1 000]，4℃搖床室溫孵育過(guò)夜，TBST振洗后加入HRP羊抗兔二抗(稀釋倍數(shù)1∶2 000)，37℃搖床室溫孵育1h，TBST清洗3次后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色后拍照，并以Image-J軟件分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠股骨標(biāo)本肉眼觀察結(jié)果 正常對(duì)照組大鼠股骨折斷處肉眼可見(jiàn)正常骨性連接。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肉眼可見(jiàn)軟組織包繞骨折端，斷端硬化且間隙增大；與模型組相比，三花接骨散低、中、高劑量組及陽(yáng)性組大鼠肉眼可見(jiàn)斷端骨性連接形成增加。

2.2 各組大鼠骨折部位X射線觀察結(jié)果 正常對(duì)照組正常愈合骨折線基本消失。模型組大鼠骨折線明顯，骨折兩側(cè)未剝離骨膜處有少量新生骨痂形成，無(wú)明顯骨性連接，X射線評(píng)分顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)。三花接骨散低、中、高劑量組及陽(yáng)性組大鼠骨折線模糊，骨折斷端間有大量骨性連接形成，骨折間隙消失，骨折愈合進(jìn)入骨板形成塑型期，且X射線評(píng)分顯著高于模型組(P<0.05)，三花接骨散各劑量組X射線評(píng)分依次升高，見(jiàn)圖1、表1。

表1 各組大鼠股骨X射線評(píng)分

2.3 各組大鼠骨折組織病理形態(tài)檢測(cè)結(jié)果 正常對(duì)照組大鼠斷端皮質(zhì)與新生骨界限不明顯，連接軟骨區(qū)域的愈傷組織幾乎消失，骨折被覆蓋，新形成的小梁骨已愈合，編織骨再造厚度較小。與正常對(duì)照組相比，模型組可見(jiàn)斷端纖維組織填充、骨小梁排列紊亂、大量纖維瘢痕組織包繞骨折端，編織骨表面縫隙較大，骨愈合組織學(xué)評(píng)分降低(P<0.05)。與模型組相比，三花接骨散低、中、高劑量組及陽(yáng)性組大鼠可見(jiàn)斷端骨愈傷組織之間的間隙減小，骨小梁及骨性骨痂形成較多，骨細(xì)胞沉積較多，且骨愈合組織學(xué)評(píng)分升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表2。

表2 各組大鼠股骨骨愈合組織學(xué)評(píng)分

2.4 各組大鼠血清VEGF、PDGF水平檢測(cè)結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清VEGF、PDGF水平均降低(P<0.05)；與模型組相比，三花接骨散低、中、高劑量組及陽(yáng)性組大鼠血清VEGF、PDGF水平均升高(P<0.05)，且隨著三花接骨散劑量升高上述指標(biāo)依次升高。三花接骨散高劑量組與陽(yáng)性組上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清VEGF、PDGF水平檢測(cè)結(jié)果

2.5 各組大鼠骨痂組織BMP-7、OCN、Runx2蛋白表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠BMP-7、OCN、Runx2蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)。與模型組相比，三花接骨散低、中、高劑量組及陽(yáng)性組大鼠BMP-7、OCN、Runx2蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)，且隨著三花接骨散劑量升高上述指標(biāo)依次升高。三花接骨散高劑量組與陽(yáng)性組上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3、表4。

表4 各組大鼠骨痂組織BMP-7、OCN、Runx2蛋白表達(dá)水平

圖3 各組大鼠骨痂組織BMP-7、OCN、Runx2蛋白免疫印跡圖

3 討論

目前常以X線病理診斷分為萎縮性、肥大性以及滑膜假關(guān)節(jié)形成性骨不連[11]，其中萎縮性骨不連發(fā)生率相對(duì)較高，其X線表現(xiàn)為骨折斷端間充滿纖維結(jié)締組織或纖維瘢痕肉芽組織、間隙消失、新生骨痂量少、斷端硬化等[12]。本研究參照文獻(xiàn)[8]造模方法，通過(guò)髓腔內(nèi)克氏針固定并在橫行骨折端兩側(cè)各灼燒骨膜2mm，建立大鼠股骨骨不連模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠X射線評(píng)分及骨愈合組織學(xué)評(píng)分均低于正常對(duì)照組，肉眼可見(jiàn)軟組織包繞骨折端，斷端間隙較大，X線照射顯示骨折兩側(cè)無(wú)明顯骨性連接，HE染色可見(jiàn)斷端有大量纖維組織填充及纖維瘢痕組織包繞，骨小梁排列紊亂，與萎縮性骨不連病理組織學(xué)形態(tài)一致，表明造模成功。

骨折形成早期，血小板可分泌大量PDGF，促進(jìn)骨折局部成纖維細(xì)胞增殖和分化，積極參與骨折愈合過(guò)程，且在萎縮性骨不連患者中檢測(cè)到PDGF及其受體PDGF-BB明顯降低，給予重組人PDGF-BB治療后患者骨缺損愈合增強(qiáng)，推測(cè)PDGF可能是萎縮性骨折不愈合的敏感標(biāo)志物[12-14]。另外，VEGF是成骨和血管生成的關(guān)鍵因子，在骨折早期階段其水平增加有利于促進(jìn)血管形成和骨折愈合[12,15]。本研究檢測(cè)到模型組大鼠血清VEGF、PDGF水平明顯低于正常對(duì)照組，預(yù)示骨愈合過(guò)程中VEGF、PDGF缺少，可能抑制血管形成及成骨細(xì)胞分化，使得骨折處血運(yùn)不佳、骨形成緩慢，導(dǎo)致骨不連。三花接骨散主要由活血祛瘀藥如紅花、三七，補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨藥物如續(xù)斷、骨碎補(bǔ)、牛膝等藥物組成，臨床上常用于治療骨折筋傷、瘀血腫痛等癥狀。趙啟亮等[7]發(fā)現(xiàn)三花接骨散可促進(jìn)糖尿病患者骨折愈合，表明三花接骨散對(duì)骨愈合有一定促進(jìn)作用。但三花接骨散對(duì)萎縮性骨不連骨愈合的作用效果還未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，三花接骨散低、中、高劑量組及陽(yáng)性組大鼠骨折斷端間骨性連接及骨小梁形成較多，X射線評(píng)分、骨愈合組織學(xué)評(píng)分、血清VEGF、PDGF水平均明顯高于模型組，提示給予三花接骨散治療后，大鼠骨折端骨不連情況明顯改善，但其促進(jìn)骨愈合的具體分子生物學(xué)機(jī)制還不明確，本研究對(duì)此進(jìn)行研究。

骨愈合過(guò)程復(fù)雜，包括血腫期、炎癥反應(yīng)期、纖維骨痂形成期、骨性痂塑形期，涉及BMP等多種細(xì)胞因子參與[16]。研究證實(shí)BMP-7能刺激未分化的間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，并促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及成骨形成[17]，應(yīng)用重組人BMP-7治療骨缺損已取得較好效果，表明BMP-7可誘導(dǎo)成骨活性和修復(fù)骨缺損[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)，BMP-7可提升堿性磷酸酶活性，上調(diào)成骨基因Runx2及OCN表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、抑制破骨細(xì)胞活化、加快骨礦化、促進(jìn)新骨形成和穩(wěn)定骨代謝[19]。Deng等發(fā)現(xiàn)，抑制miRNA-9可通過(guò)提高股骨骨不連大鼠骨折部位BMP-7、Runx2及OCN表達(dá)，增強(qiáng)骨愈合[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠骨痂組織中BMP-7、Runx2、OCN表達(dá)均低于正常對(duì)照組，推測(cè)骨不連骨愈合緩慢或不愈合可能與BMP-7/Runx2/OCN通路抑制、成骨形成及礦化作用緩慢有關(guān)。而三花接骨散可增加大鼠骨痂組織中BMP-7、Runx2、OCN表達(dá)，提示三花接骨散可能通過(guò)活化BMP-7/Runx2/OCN信號(hào)通路促進(jìn)成骨形成，促進(jìn)骨不連大鼠骨愈合。

綜上所述，三花接骨散可能通過(guò)活化BMP-7/Runx2/OCN信號(hào)通路，促進(jìn)股骨骨不連大鼠骨愈合。但中醫(yī)藥治療疾病具有多靶點(diǎn)、多途徑作用，本研究?jī)H就其中一條通路進(jìn)行探究，三花接骨散治療促進(jìn)骨愈合的具體分子生物學(xué)機(jī)制，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。