李夢(mèng)瑤，石俊如，布合加爾·克熱木尼亞孜，曹洪偉，黃 凱，李 森，管 驍?

（上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

藜麥（Chenopodium quinoa Willd）是一種原產(chǎn)于南美洲安第斯山脈地區(qū)的農(nóng)作物，屬莧科藜屬的一年生雙子葉植物[1]，其種子顏色主要有黑、紅、白幾種顏色[2]。藜麥營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，富含氨基酸、優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)以及多酚、皂苷等生物活性物質(zhì)[3-5]，其蛋白質(zhì)氨基酸比例均衡，可調(diào)節(jié)機(jī)體的脂肪代謝，進(jìn)而起到降低血脂的作用；與其他谷物相比，藜麥具有很高的抗氧化能力，可作為天然抗氧化劑的來(lái)源，也被推薦為最適合人類的完美全營(yíng)養(yǎng)食品[6]，現(xiàn)已被多個(gè)國(guó)家引進(jìn)種植，我國(guó)在 1987年將其引進(jìn)西藏地區(qū)并開(kāi)始種植，自2015年更是在山西、內(nèi)蒙、青海等多個(gè)地區(qū)開(kāi)始種植[7]。

近年來(lái)，藜麥已經(jīng)引起各類研究者、生產(chǎn)者及普通消費(fèi)者廣泛的關(guān)注，但藜麥作為有待普及和推廣的新興作物，對(duì)藜麥的理論研究和開(kāi)發(fā)利用尚有待深入。固態(tài)發(fā)酵（Solid State Fermentation，SSF）是指利用不溶性固體基質(zhì)來(lái)培養(yǎng)微生物的過(guò)程，培養(yǎng)基呈固態(tài)，含水豐富，但沒(méi)有或幾乎沒(méi)有自由流動(dòng)水的狀態(tài)下進(jìn)行的一種或多種微生物發(fā)酵過(guò)程，底物（基質(zhì)）是不溶于水的聚合物，它不僅可以提供微生物所需碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、水及其它營(yíng)養(yǎng)物，還是微生物生長(zhǎng)的場(chǎng)所[8-9]。固態(tài)發(fā)酵是一種經(jīng)濟(jì)高效的綠色發(fā)酵方式[10]，有文獻(xiàn)表明固態(tài)發(fā)酵可以提高谷物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[11]，但目前對(duì)藜麥進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵的研究較少。

本研究以三種不同顏色種類的藜麥為原料，對(duì)其進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，測(cè)定其發(fā)酵產(chǎn)物中總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮含量，并測(cè)定其 pH值，篩選出營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的藜麥品種；并研究藜麥固態(tài)發(fā)酵后發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性，以 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率和鐵離子還原能力為指標(biāo)，篩選抗氧化性能最優(yōu)的藜麥品種，旨在全面揭示不同顏色藜麥品種之間抗氧化性質(zhì)的差異，同時(shí)為藜麥?zhǔn)称返拈_(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黑色藜麥、紅色藜麥、白色藜麥：山西五臺(tái)山；麥曲、塊曲：上海金楓酒業(yè)有限公司；酵母：安琪酵母股份有限公司。

亞鐵氰化鉀三水合物、無(wú)水硫酸銅、甲基紅、亞甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉、D-無(wú)水葡萄糖、三氯乙酸：上海維塔化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、沒(méi)食子酸：上海阿拉丁生物科技股份有限公司；福林酚、氫氧化鈉、鹽酸、六氰合鐵酸鈉、二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、無(wú)水三氯化鐵、甲醛：國(guó)藥集團(tuán)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

霉菌培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Himac CR22N高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司；L550臺(tái)式低速大容量離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV-2800A型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)尤尼柯公司；WK2102T電磁爐：美的集團(tuán)有限公司；IKA RO5多點(diǎn)磁力攪拌器：艾卡儀器設(shè)備有限公司；FE20 pH計(jì)：梅特勒–托利多儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藜麥預(yù)處理

將160 g藜麥在320 mL蒸餾水中浸泡1 h，瀝干水分，然后放入墊有四層紗布的蒸鍋上蒸煮30 min，將蒸熟的藜麥放在鐵盤中平鋪放開(kāi)涼至溫度30 ℃以下備用。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵

將藜麥、128 mL蒸餾水、4 g麥曲、12 g塊曲、酵母液（0.16 g酵母溶于16 mL糖水中，在35 ℃水浴加熱15 min）混合均勻，四層紗布封口放入霉菌培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)定為28 ℃。

分別取 12、24、36、48、60、72、84、96 h的發(fā)酵液。將發(fā)酵完的藜麥在4 000 r/min條件下離心30 min，并用濾紙過(guò)濾，取得原液，在4 ℃保存，備用待測(cè)。

1.3.3 總糖的測(cè)定

總糖的測(cè)定：根據(jù)國(guó)標(biāo) GB/T 13662—2018《黃酒》采用亞鐵氰化鉀滴定法測(cè)定。預(yù)先配好費(fèi)林試劑甲、乙液，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 g/L），6 mol/L HCl溶液，200 g/L NaOH溶液，1 g/L甲基紅指示液。

吸取費(fèi)林甲溶液和費(fèi)林乙溶液各 5 mL于100 mL錐形瓶中，加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液9 mL，搖勻后加入2粒沸石，置于電爐上加熱，在2 min內(nèi)沸騰，然后用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至藍(lán)色消失變?yōu)辄S色，記作滴定終點(diǎn)，記錄消耗的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積V1。

1.3.3.1 制樣 吸取試樣5 mL于100 mL容量瓶中，加入蒸餾水30 mL和HCl溶液5 mL，在70 ℃水浴中加熱15 min，冷卻，加入兩滴甲基紅指示液，用 NaOH溶液中和至紅色消失。加水定容100 mL，搖勻，過(guò)濾，作為試樣水解液備用。

1.3.3.2 預(yù)滴定 吸取費(fèi)林甲液、乙液及試樣水解液各5 mL于100 mL錐形瓶中，搖勻后加入2粒沸石置于電爐上加熱至沸騰，用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點(diǎn)，記錄消耗的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積 V2。

1.3.3.3 滴定 吸取費(fèi)林甲液、乙液及試樣水解液各5mL于100 mL錐形瓶中，加入比預(yù)滴定少1.00 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻后加入2粒沸石置于電爐上加熱至沸騰，用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點(diǎn)。記錄消耗的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（V3）。

試樣中總糖含量X計(jì)算為：

式中：

ρ——葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，單位為g/mL；

n——試樣的稀釋倍數(shù)。

1.3.4 總酸和氨基酸態(tài)氮的測(cè)定

參照劉安康[12]等實(shí)驗(yàn)方法并調(diào)整，吸取試樣10 mL于100 mL錐形瓶中，加入蒸餾水50 mL。錐形瓶中放入磁力攪拌子，置于磁力攪拌器上攪拌。用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定，開(kāi)始時(shí)可快速滴定至pH 7.00，此后放慢滴定速度，直至pH 8.20為終點(diǎn)，記錄消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積V1。加入甲醛溶液10 mL，繼續(xù)用NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至pH 9.20，記錄消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積V2。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)，分別記錄不加甲醛溶液及加入甲醛溶液時(shí)，空白實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)所消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積V3、V4。

總酸含量X1如下：

酸態(tài)氮含量X2如下：

式中：

X1——試樣中總酸的含量，單位為g/L；

X2——試樣中氨基酸態(tài)氮的含量，單位為g/L；

c——NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，單位為mol/L；

V0——吸取試樣的體積，單位為mL。

1.3.5 總酚含量的測(cè)定

吸取2 mL離心發(fā)酵液上清，加入10 mL 80%甲醇溶液，45 ℃條件下水浴1 h，4 000 r/min離心10 min收集上清。采用Folin-酚試劑測(cè)定多酚含量[13]，取1 mL提取液，加入0.5 mL福林酚試劑，混勻后靜置 5 min，然后加入 1.5 mL 20%Na2CO3溶液，去離子水定容至10 mL，混勻后避光靜置1 h，在760 nm下測(cè)定吸光度。以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？偡雍恳詻](méi)食子酸當(dāng)量μg GAE/mL DW表示。

1.3.6 體外抗氧化指標(biāo)測(cè)定

1.3.6.1 DPPH自由基清除活性 參照 Ye等[14]方法，并進(jìn)行調(diào)整。配置DPPH溶液：用無(wú)水乙醇配制0.1 mmol/L的DPPH溶液，避光保存。將1 mL測(cè)試樣品溶液及1 mL DPPH溶液加入到同一試管中，搖勻，室溫下暗處?kù)o置30 min后以3 000 r/min離心10 min，測(cè)定其吸光度Asample，同時(shí)測(cè)定1 mL DPPH溶液與1 mL乙醇混合后的吸光度Acontrol，以及1 mL測(cè)試樣品溶液與1 mL無(wú)水乙醇混合后的吸光度Ablank。

自由基清除能力的表示：

1.3.6.2 還原能力測(cè)定 參照Oyaizu[15]方法，并作調(diào)整。取 0.4 mL樣品和 1 mL磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）以及1 mL 1%鐵氰化鉀溶液混合，于50 ℃水浴中加熱20 min，冷卻到室溫后加入1 mL 10% TCA混勻，靜置15 min。取1 mL上清液，加入0.2 mL 0.1%三氯化鐵溶液和1 mL水。10 min后，在700 nm處測(cè)吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并用Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖分析，采用單因素方差分析中的Duncan多重比較法分析結(jié)果間的顯著差異（P<0.05表示具有顯著性差異）。每組實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 總糖含量變化

發(fā)酵過(guò)程中黑藜、紅藜、白藜總糖含量的變化見(jiàn)圖 1，從圖 1可以看出，大米在發(fā)酵過(guò)程中總糖的含量顯著高于藜麥（P<0.05），這是由于大米所含碳水化合物尤其是淀粉含量相對(duì)較高所導(dǎo)致，藜麥中淀粉含量通常為60%[16]，而大米淀粉含量可高達(dá)75%以上[17]。研究發(fā)現(xiàn)，藜麥與大米在發(fā)酵過(guò)程中均出現(xiàn)了總糖含量先升高后降低的趨勢(shì)，這是因?yàn)榘l(fā)酵前期淀粉被霉菌及其他一些細(xì)菌分泌的淀粉酶、糖化酶等大量分解導(dǎo)致了總糖的升高和相應(yīng)微生物的增殖，但隨著總糖含量達(dá)到一定高度，酵母菌開(kāi)始大量增殖且不斷消耗產(chǎn)生的還原糖，從而導(dǎo)致總糖含量的降低。其中藜麥的總糖含量在發(fā)酵24 h時(shí)達(dá)到最高，而大米則需發(fā)酵36 h。藜麥的發(fā)酵隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在48 h總糖含量趨于穩(wěn)定，且白藜的總糖含量要高于黑、紅藜，大米的總糖含量則持續(xù)降低，此現(xiàn)象與酵母的增殖與藜麥、大米中淀粉含量相關(guān)。

圖1 發(fā)酵過(guò)程中黑藜、紅藜、白藜總糖含量的變化Fig.1 Changes of total sugar content of black quinoa,red quinoa and white quinoa during fermentation

2.2 總酸含量變化

發(fā)酵過(guò)程中黑藜、紅藜、白藜總酸含量的變化見(jiàn)圖 2，從圖 2可以看出，大米及藜麥在發(fā)酵前期總酸含量持續(xù)上升，是整個(gè)菌群環(huán)境不斷調(diào)整的結(jié)果。不適應(yīng)酸性環(huán)境的菌體生長(zhǎng)受到抑制，能夠適應(yīng)酸性環(huán)境的菌體開(kāi)始不斷增殖并形成優(yōu)勢(shì)菌群。結(jié)合總糖含量的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)總酸含量在48 h時(shí)趨于穩(wěn)定，與總糖含量變化趨于穩(wěn)定的時(shí)間點(diǎn)相吻合，是弱勢(shì)菌群持續(xù)產(chǎn)酸而優(yōu)勢(shì)菌群則以已產(chǎn)的有機(jī)酸為底物繼續(xù)發(fā)酵，導(dǎo)致了總酸含量變化減緩。相比較于藜麥，大米總酸持續(xù)增加，是因?yàn)槠涞矸酆枯^高，從而淀粉水解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。藜麥淀粉的顆粒相對(duì)較小，粒徑僅幾微米甚至納米級(jí)[18-19]，而大米淀粉顆粒則高達(dá)幾十微米，此因素也可能導(dǎo)致大米淀粉的水解時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)，從而產(chǎn)酸持續(xù)增加。此外，藜麥發(fā)酵中總酸含量顯著高于大米，有可能是發(fā)酵初期，藜麥中乳酸菌增殖相對(duì)較高。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中黑藜、紅藜、白藜總酸含量的變化Fig.2 Changes of total acid content of black quinoa,red quinoa and white quinoa during fermentation

2.3 pH的變化

在發(fā)酵過(guò)程中，藜麥的 pH變化總體呈下降趨勢(shì)，而大米的 pH則先降低再平穩(wěn)最后略有上升的趨勢(shì)，結(jié)果如圖3所示。相較于大米，藜麥發(fā)酵過(guò)程中 pH的變化相對(duì)較小，由于所用發(fā)酵劑為酒曲，其中富含霉菌、酵母、乳酸菌等各類微生物，均可以產(chǎn)生各類酸類物質(zhì)，從而可以導(dǎo)致 pH的降低，但相比較于藜麥，大米在發(fā)酵過(guò)程中由于淀粉含量的相對(duì)較高，發(fā)酵后期能夠通過(guò)酵母的增殖不斷將有機(jī)酸轉(zhuǎn)化為酒精，因此，pH的變化會(huì)呈現(xiàn)后期相對(duì)平穩(wěn)甚至上升的趨勢(shì)。對(duì)于藜麥的 pH持續(xù)下降，是因?yàn)榘l(fā)酵后期蛋白酶對(duì)于蛋白的持續(xù)分解，由于蛋白質(zhì)氨基酸組成的差異，導(dǎo)致游離出的氨基酸所帶酸堿性差異，從而導(dǎo)致了大米、藜麥的pH值存在一定區(qū)別。

圖3 發(fā)酵過(guò)程中黑藜、紅藜、白藜pH的變化Fig.3 pH changes of black quinoa,red quinoa and white quinoa during fermentation

2.4 氨基酸態(tài)氮含量變化

氨基酸態(tài)氮是指以氨基酸形式存在的氮元素的含量，可以用來(lái)判斷發(fā)酵程度。如圖4所示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，藜麥發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸態(tài)氮總體變化呈上升趨勢(shì)，而大米則呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定的趨勢(shì)。由于藜麥中蛋白質(zhì)含量幾乎是大米的兩倍[20]，因此，隨著微生物分泌的蛋白酶不斷酶解蛋白，藜麥的氨基酸態(tài)氮要高于大米，發(fā)酵前期，原料中的蛋白質(zhì)大都被一些高產(chǎn)蛋白酶微生物，如霉菌類，進(jìn)行分解形成低分子的肽和游離氨基酸，因此其氨基酸態(tài)氮含量上升較快。

圖4 發(fā)酵過(guò)程中黑藜、紅藜、白藜氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.4 Changes of amino acid nitrogen content in black quinoa,red quinoa and white quinoa during fermentation

2.5 總酚含量變化

谷物中存在大量的多酚黃酮類抗氧化物質(zhì)，主要以游離態(tài)、可溶酯化態(tài)和不溶結(jié)合態(tài)形式存在[21]，但谷物中可游離出的酚類或黃酮類物質(zhì)含量相對(duì)較低，Raj等[22]研究發(fā)現(xiàn)固態(tài)發(fā)酵（5 d）可以顯著提高玉米總酚（游離酚）含量及抗氧化活性。通過(guò)微生物發(fā)酵法可有效釋放谷物中與淀粉、蛋白等物質(zhì)結(jié)合的酚類物質(zhì)，從而能有效提升抗氧化效果。如圖5所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，藜麥與大米的總酚含量不斷增加，但當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)48 h，總酚含量呈下降趨勢(shì)。發(fā)酵前期總酚含量的增加是蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等酶的不斷增加，從而有效的釋放結(jié)合酚的結(jié)果。但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物會(huì)消耗所產(chǎn)生的酚類物質(zhì)，導(dǎo)致含量降低。此外，藜麥發(fā)酵中總酚含量顯著高于大米（P<0.05），一方面，大米經(jīng)加工后，大量的酚類物質(zhì)隨著脫殼、脫皮處理造成了流失，而藜麥未經(jīng)過(guò)精細(xì)加工，從而保留了大部分的酚類物質(zhì)；另一方面，藜麥本身的酚類物質(zhì)含量就高于大米，從而在發(fā)酵釋放過(guò)程中總酚含量也高于大米。

圖5 發(fā)酵過(guò)程中黑藜、紅藜、白藜總酚含量的變化Fig.5 Changes of total phenols content in black quinoa,red quinoa and white quinoa during fermentation

2.6 DPPH自由基清除率

選用三種不同顏色的藜麥，并以大米為參照，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后，測(cè)其發(fā)酵產(chǎn)物的DPPH自由基清除率，結(jié)果如圖6所示。可以看出在相同發(fā)酵條件下藜麥的DPPH自由基清除率要高于大米，在發(fā)酵48 h時(shí)，黑藜發(fā)酵產(chǎn)物的DPPH自由基清除率達(dá)到80%，這與其發(fā)酵后總酚含量在48 h含量達(dá)到最高呈現(xiàn)一致趨勢(shì)，整體來(lái)說(shuō)黑藜的 DPPH自由基清除率比其他品種高。由結(jié)果知藜麥發(fā)酵產(chǎn)物的DPPH自由基清除率的變化趨勢(shì)與其總酚含量的變化相近，從而驗(yàn)證了固態(tài)發(fā)酵釋放酚類物質(zhì)可提高發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化性能。

圖6 發(fā)酵過(guò)程中黑藜、紅藜、白藜DPPH自由基清除能力的變化Fig.6 Changes of DPPH radical scavenging ability of black quinoa,red quinoa and white quinoa during fermentation

2.7 還原能力

發(fā)酵過(guò)程中黑藜、紅藜、白藜還原能力的變化見(jiàn)表 7，從圖 7可以看出在相同發(fā)酵條件下藜麥發(fā)酵產(chǎn)物的還原能力要高于大米，與DPPH自由基清除能力的變化相比，藜麥和大米發(fā)酵產(chǎn)物的還原能力幾乎都在48 h達(dá)到最高，僅有黑藜在60 h達(dá)到最高。藜麥發(fā)酵產(chǎn)物的還原能力變化趨勢(shì)與其對(duì)DPPH自由基清除能力的變化趨勢(shì)成一致性，這主要是由于其酚類物質(zhì)含量的變化引起的，且黑藜的酚類含量高，故其還原能力也強(qiáng)。因此再一次驗(yàn)證了固態(tài)發(fā)酵釋放酚類物質(zhì)可提高發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化性能。

圖7 發(fā)酵過(guò)程中黑藜、紅藜、白藜還原能力的變化Fig.7 Changes of reducing ability of black quinoa,red quinoa and white quinoa during fermentation

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)藜麥固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，以大米作為參照，研究藜麥發(fā)酵過(guò)程中pH、總酸、總糖、氨基酸態(tài)氮含量的變化，這些變化與藜麥中淀粉、蛋白質(zhì)含量有關(guān)并與發(fā)酵過(guò)程中微生物種群類別、數(shù)量息息相關(guān)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，黑藜與紅藜相較于白藜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高。研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過(guò)程中，48 h時(shí)藜麥的總酚含量達(dá)到最高，且發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力與酚類物質(zhì)含量高低呈現(xiàn)一致性，其中黑藜通過(guò)固態(tài)發(fā)酵的效果最好，其 DPPH自由基清除率最高達(dá)到80%，可知通過(guò)固態(tài)發(fā)酵技術(shù)，能有效釋放藜麥中的結(jié)合酚類物質(zhì)，提高總酚含量，從而提升發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力。