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        香港牡蠣中鋅元素的分布及存在形態(tài)

        2021-07-25 13:21:04曹文紅章超樺秦小明高加龍鄭惠娜
        廣東海洋大學學報 2021年4期
        關鍵詞:鋅元素殘渣牡蠣

        韓 蓉,曹文紅,2,章超樺,2,秦小明,2,高加龍,2,鄭惠娜,2

        (1.廣東海洋大學食品科技學院//國家貝類加工技術研發(fā)分中心(湛江)//廣東省水產品加工與安全重點實驗室//廣東省海洋生物制品工程實驗室//廣東省海洋食品工程技術研究中心//水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室,廣東 湛江,524088;2.大連工業(yè)大學海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,遼寧 大連,116034)

        鋅是正常人體生命過程中不可缺少的元素,在人體內的各種生理活動中起著重要的影響和調節(jié)作用[1]。缺鋅會引發(fā)各種不良作用,易引起食欲減退、免疫功能低下、創(chuàng)傷不易愈合、小腦發(fā)育遲緩、男性性功能障礙等[2]。鋅元素在生物體內的存在狀態(tài)主要包括有機態(tài)和無機態(tài)兩種,無機鋅生物利用率較低且有毒副作用,有機鋅才易于吸收[3-4]。已有研究表明,多糖或蛋白與鋅結合后生物活性加強及有益于機體的有效吸收[5-6],鋅結合肌動蛋白可以保護神經元,鋅結合多糖可以降低血壓,鋅結合金屬硫蛋白可以抗氧化[7-8]。因此,天然來源的生物鋅更具有效性和安全性。

        牡蠣是已知的含鋅量最高的海洋貝類[9],前人對于牡蠣中鋅元素的研究主要局限于鋅含量的測定及生物功能的研究,目前尚未有關于牡蠣鋅元素形態(tài)的研究報道,故起生物功能作用的鋅的形態(tài)目前還不清楚?;诖耍狙芯繉ο愀勰迪牐–rassostrea hongkongensis)的鋅含量、組織分布及存在形態(tài)進行詳細檢測分析,為闡明其生物活性、揭示其安全性和功能性、探究最佳開發(fā)利用途徑提供理論依據。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        鮮活香港牡蠣原料,采集季節(jié)在7 月份,其長度(11.68±0.93)cm,質量(166.50±16.79)g,由廣東粵之寶水產有限公司提供。運回實驗室后開殼取肉,用超純水清洗牡蠣肉后用吸水紙吸干其表面水分備用。

        D101 大孔樹脂,中國安徽三星樹脂技術有限公司;二乙氨基乙基纖維素52(DEAE-52),美國Whatman 公司;扇貝成分分析標準物質(GBW10024),物理地球化學勘查研究所;鋅元素標準物品,美國Agilent 科技公司。硝酸、氯化鈉、氫氧化鈉為優(yōu)級純,其余均為分析純;試驗中用水為超純水。

        1.2 儀器與設備

        微波消解儀,奧地利Anton Paar Multiware PRO公司;7500cx 電感耦合等離子體質譜(ICP-MS),美國Agilent 公司;BRUKER TENSOR 27 傅立葉紅處光譜儀,德國Bruker 公司;FDU551 冷凍干燥機,東京理化器械株式會社;Eyela 旋轉蒸發(fā)儀,東京理化器械株式會社。

        1.3 方法

        1.3.1鋅元素檢測樣品的制備 將牡蠣肉樣品隨機均分成2 組。第1 組將牡蠣分解為外套膜、內臟團、鰓、閉殼肌4 個組織部分,各組織部分充分勻漿后進行鋅含量的比較分析。第2 組將牡蠣全臟器充分均漿后進行40 ℃水提2.6 h,稍冷后以9 874 g離心20 min,上清液經孔徑0.45 μm 微孔濾膜抽濾得提取液,對提取液及殘渣分別進行有機態(tài)和無機態(tài)鋅元素的比較分析。

        1.3.2鋅含量分析樣品的消解 稱取牡蠣樣品0.10~ 0.15 g(按干基計,精確至0.000 1 g,下同)或液體樣品2 mL 于消解罐中,加入9 mL 硝酸和2 mL過氧化氫,在微波消解儀上消解。經歷四個消解階段(室溫~ 120 ℃,5 min;120~ 150 ℃,5 min;150~ 185 ℃,20 min;185~ 70 ℃,20 min)后消化液呈無色透明或略帶黃色取出消解罐,180 ℃趕酸至約1 mL,冷卻后用超純水定容至50 mL,混勻備用。同時制備試劑空白和扇貝成分分析標準物質(GBW10024)消解物進行質量控制。

        1.3.3鋅元素的 ICP-MS 分析 采用 7500cx ICP-MS 進行鋅元素含量的測定。操作參數(shù)為:等離子氣體流量15 L/min;輔助氣體流量,1 L/min;載氣流量,1 L/min;補充氣流量,1 L/min;氦流量10 L/min;溫度2 ℃;正向功率1 550 W;反射功率1 W;排氣溫度為35.5 ℃。

        將鋅標準品配置成質量濃度為0、2、5、10、20、50、100、200 μg/L 標準溶液,按濃度順序分別導入電感耦合等離子體質譜儀,測其響應值,以質量濃度為橫坐標,響應值為縱坐標,繪制標準曲線。對響應值與濃度值作線性相關系數(shù)檢查,要求相關系數(shù)達到0.999 5< r ≤1,以保證試樣分析結果的準確性。

        1.4 提取液和殘渣中有機鋅與無機鋅的分離和測定

        1.4.1提取液中有機和無機鋅的測定 參考文獻[10]的方法用大孔吸附樹脂(直徑1.6 cm,長50 cm)對提取液進行離子交換柱層析,分別利用體積分數(shù)1% HNO3和30%乙醇溶液進行洗脫,收集洗脫液,減壓蒸餾濃縮后消化定容,檢測體積分數(shù)1%HNO3洗脫液中的無機鋅、體積分數(shù)30%乙醇洗脫液中的有機鋅含量。

        1.4.2殘渣中有機鋅和無機鋅的測定 牡蠣經水提、離心后的殘渣按固液質量(g)體積(mL)比1∶1 加入6 mol/L HCL 溶液,混合后超聲震蕩30 min,以9 874 g 離心20 min,取上清液,對離心沉淀物重復操作2 次,合并上清液,消解后測定鋅含量,即為殘渣中無機鋅含量。殘渣總鋅含量除去無機鋅含量即為有機鋅含量[11]。

        1.5 提取液和殘渣中蛋白、多糖組分的提取及鋅含量的測定

        1.5.1提取液中蛋白及多糖組分的提取 取100 g提取液,緩慢加入70 g 硫酸銨固體,攪拌均勻,充分溶解,于4 ℃下靜置24 h,9 874 g 離心40 min后取沉淀,用適量pH 8.0 的10 mmol/L Tris-HCl 緩沖液溶解,用分子質量3 500 u 透析袋于4 ℃超純水中透析4 d,完成脫鹽后真空冷凍干燥制得蛋白組分。

        取提取液80 g,與20 mL Sevag 溶劑(氯仿和正丁醇以體積比4∶1 混合而成)混合,在搖床上以120 r/min 轉速震蕩30 min,離心除去蛋白質等沉淀物,以上操作重復5 次,收集上清液,于旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮,濃縮定容后加入4 倍體積的無水乙醇,置于4 ℃冰箱中醇沉10 h,以9 874 g 離心30 min,所得的沉淀物為水溶性多糖,真空冷凍干燥制得多糖組分[12]。

        1.5.2殘渣中蛋白、多糖組分的提取 殘渣中蛋白結合鋅組分的提取參考文獻[13]的方法,在磷酸鹽溶液中對殘渣進行高壓均質提取。殘渣中多糖結合鋅組分的提取參考文獻[14]的方法,采用氫氧化鉀提取和乙醇沉淀。

        1.5.3蛋白組分和多糖組分鋅含量的測定 準確稱取蛋白組分和多糖組分于微波消解儀中消解。消解后的溶液進行趕酸,且根據標準曲線的范圍進行適當?shù)南♂?。同時制備試劑空白和扇貝成分分析標準物質(GBW10024)消解物進行質量控制。最后用ICP-MS 進行鋅元素含量的測定。

        1.6 鋅多糖的分離純化與分析

        由于牡蠣主要以海水中的微藻為餌料,在其全臟器內臟團中有未完全消化的微藻,微藻中所含的糖會對本研究的結果造成干擾,故將牡蠣去內臟后單獨提取其多糖組分,并進行分離純化,以利于分析牡蠣體內存在的天然多糖鋅。牡蠣多糖中存在不同電荷量的多糖,與離子交換劑DEAE-52 的結合能力存在差異,通過不同離子強度的氯化鈉溶液逐級洗脫,使這些物質根據結合力大小依次從層析柱中分離出來,從而得到電荷量單一的牡蠣多糖[15]。

        去內臟的牡蠣通過60 ℃水浴提取得到多糖提取液,提取液除蛋白后乙醇沉淀干燥后得到多糖組分。準確稱取100 mg 去內臟牡蠣多糖組分,充分溶解于5 mL 超純水中,依次用超純水、0.1、0.2、0.3、0.4 和0.5 mol/mL NaCl 溶液以0.9 mL/min 的速度在預處理好的DEAE-52 離子交換柱(直徑2.6 cm,長30 cm)中進行梯度洗脫,每個梯度收集25管,每管10 min。采用苯酚硫酸法檢測每管中多糖含量,合并每個多糖洗脫峰,經旋轉蒸發(fā)濃縮后透析(截留分子質量3 500 u),直至向透析液中滴入AgNO3溶液無沉淀為止,冷凍干燥得到純化的多糖組分。在190~ 400 nm 波長范圍內進行紫外可見光譜掃描,評估蛋白脫除效果。使用傅里葉變換紅外光譜儀,在400~ 4 000 cm-1范圍內進行掃描,探究多糖的官能團特征[16]。

        1.7 數(shù)據分析處理

        使用SPSS 19.0 分析實驗數(shù)據,進行方差分析和均值比較以識別差異,P <0.05 被認為在統(tǒng)計學上差異顯著,所有提取和分析均進行3 次重復。

        2 結果與分析

        2.1 鋅元素在牡蠣各組織部位的分布

        牡蠣的鋅元素來源于海水及其攝食的餌料,一部分通過吸收、生物轉化等途徑轉運至體內,成為機體組織成分,另一部分尚殘留于未消化的餌料殘渣中。香港牡蠣鋅的總質量分數(shù)為(1 267.51±2.85)μg/g(干基,下同)。Bilandzic 等[9]對肉制品、魚制品、貽貝中鋅含量進行研究,發(fā)現(xiàn)牡蠣中的鋅含量最高。鋅元素在牡蠣各組織部位的分布見圖1。

        香港牡蠣的各個組織部分中鋅含量呈現(xiàn)較大差異(圖1_A)。鰓部鋅的質量分數(shù)為(2 242.63±22.10)μg/g,外套膜中鋅質量分數(shù)為(1 826.16±12.09)μg/g,內臟團中鋅質量分數(shù)為(1 086.91±33.75)μg/g,閉殼肌中鋅質量分數(shù)為(790.41±1.58)μg/g,牡蠣各組織部位間的鋅含量具有顯著差異(P<0.05)。這表明牡蠣不同的組織部位具有不同的鋅富集能力,鰓在牡蠣的組織部位中具有最高的鋅富集能力,這可能與鰓部是牡蠣的濾食器官有關。由于內臟團在牡蠣全臟器中的重量最大,內臟團中的鋅在牡蠣全臟器總鋅中的占比達45.46%,其次是外套膜含鋅占比達28.71%,外套膜中的鋅占比亦在20%以上(圖1_B)。因此,牡蠣的鋅元素主要存在于內臟團中。

        2.2 牡蠣全臟器提取液及殘渣中鋅的含量及分布

        為了探究牡蠣中鋅元素的存在形態(tài),對牡蠣全臟器提取液、殘渣進行鋅含量的分析。結果如圖2_A所示,殘渣中的鋅質量分數(shù)為(1 050.76±38.10)μg/g(按干基計,下同),提取液中的鋅質量分數(shù)為(177.50±3.59)μg/g;殘渣和提取液的占比分別占全臟器中鋅元素的82.90%和14.00%(圖2_B)。水提取后牡蠣殘渣中的鋅含量極顯著高于提取液中的鋅含量(P <0.05),而Liu 等[10]發(fā)現(xiàn)金針菇提取液中的鋅含量高于殘渣中的鋅含量,是因為金針菇中鋅元素在70 ℃下從細胞內大量溶出,所以提取液中鋅元素比殘渣高。這一發(fā)現(xiàn)與本研究的結果不同,這可能與鋅在牡蠣中的存在形態(tài)及結合物溶解性有關。

        圖2 牡蠣提取液和殘渣中的鋅含量及占比Fig.2 Contents and proportions of zinc in waster extract and the residue of oyster

        牡蠣提取液中的鋅元素為研究對象可更準確地檢測提取液中有機態(tài)鋅和無機態(tài)鋅的含量。結果顯示,在提取液中有機鋅和無機鋅的質量分數(shù)分別為(23.35±5.42)μg/g 和(135.22±2.34)μg/g(圖3_A);有機鋅和無機鋅分別占14.02%和81.16%(圖3_B)。無機鋅的含量約為有機鋅的6 倍(P <0.05),表明鋅元素主要以無機態(tài)形式存在于提取液中。研究發(fā)現(xiàn),牡蠣鰓中存在無機ZnO 納米顆粒[17]。而在殘渣中,有機鋅和無機鋅的質量分數(shù)分別為(450.31±41.89)μg/g 和(597.22±14.76)μg/g(圖3_C);有機鋅和無機鋅分別占42.86%和56.84%(圖3_D),表明殘渣中存在著大量有機鋅??傮w而言,香港牡蠣全臟器中無機鋅和有機鋅的比例約為1.55∶1,有機鋅的含量低于無機態(tài)鋅的含量。

        圖3 牡蠣提取液及殘渣中不同存在形態(tài)的鋅含量和分布Fig.3 The content and distribution of different forms of zinc in the soluble solution and the residue of oyster

        2.3 牡蠣蛋白組分、多糖組分的鋅含量

        蛋白質、多糖是牡蠣中除水分外最主要的組成成分,亦是牡蠣體內鋅元素最可能結合的兩種高分子有機物。為進一步探究鋅元素的具體存在形態(tài),分別對牡蠣提取液和殘渣中的蛋白組分、多糖組分進行鋅元素的檢測,結果如表1 所示。

        從表1 可知,提取液中蛋白和多糖組分的鋅質量分數(shù)分別為(155.07±3.30)μg/g 和(1 137.52±19.78)μg/g。多糖組分比蛋白組分含有更多的鋅,兩者存在約7 倍的差異(P <0.05),這可能和溶液中多糖的官能團及所帶電荷有關。已有研究發(fā)現(xiàn),多糖的羥基和氨基能夠與鋅結合,多糖帶有的負電荷亦可通過靜電引力作用吸附鋅[18-19]。牡蠣提取液中多糖組分的鋅質量分數(shù)(1 137.52±19.78)μg/g顯著高于灰樹花多糖121.65 μg/g、樹舌多糖(190±15)μg/g、羊肚菌菌絲體多糖860 μg/g、金針菇多糖(6.74±1.11)μg/g 等目前發(fā)現(xiàn)的含多糖的含鋅量[20-23]。在加熱過程中多糖容易發(fā)生聚集,但牡蠣多糖性質較穩(wěn)定,可能存在更多與鋅結合的位點,能結合更多的鋅元素。殘渣中的蛋白組分、多糖組分的鋅質量分數(shù)分別為(766.15±18.25)μg/g和(253.50±4.00)μg/g,蛋白組分鋅含量約是多糖組分鋅含量的3 倍(P <0.05)。這可能是因為殘渣中存在的蛋白能夠結合鋅。已有研究表明,肌動蛋白能夠與鋅結合,蛋白中的組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸也能與鋅結合[24]。牡蠣殘渣中蛋白組分的鋅質量分數(shù)(766.15±18.25)μg/g 比灰樹花蛋白組分鋅質量分數(shù)(107.25 μg/g)高。因此,香港牡蠣水溶性成分中有機態(tài)鋅多存在于多糖組分中,而在水提取后的殘渣中有機態(tài)鋅多存在于蛋白質組分中。

        表1 牡蠣蛋白組分及多糖組分中鋅的含量Table 1 Contents of zinc in protein and polysaccharide fractions of the oyster

        2.4 去內臟牡蠣水溶多糖的分離純化與分析

        已有研究表明,多糖有抗氧化、抗衰老、降血脂、殺菌等生物活性,多糖與鋅結合后生物活性加強及有益于機體的有效吸收[25-26]。香港牡蠣的提取液中多糖組分含有較高含量的鋅元素,因此對牡蠣提取液里面鋅多糖進行研究。經超純水和0.1 mol/L NaCl 溶液的梯度洗脫之后,去內臟水提牡蠣鋅多糖分離到兩個多糖峰,水洗脫的組分(CT1)和0.1 mol/L NaCl 溶液的洗脫組分(CT2)(圖4)。

        圖4 基于DEAE-52 純化去內臟牡蠣水提多糖Fig.4 Purification of the eviscerated oyster polysaccharide extracted by water on DEAE-52

        去內臟牡蠣水提多糖的鋅質量分數(shù)為821.59μg/g,低于全臟器水提多糖的鋅含量,表明牡蠣內臟中未消化的藻類餌料亦含有豐富的鋅多糖成分。經DEAE-52 分離純化后得到CT1 和CT2 兩種多糖組分,CT1 的鋅質量分數(shù)達922.18 μg/g,而CT2僅為62.56 μg/g。這可能是因為CT1 組分中存在大量的與鋅結合的位點,也可能是CT1 組分里面存在硫酸基、糖醛酸帶電荷基團可以通過靜電引力作用吸附鋅。研究表明,牡蠣水解產物螯合鋅的位點主要是羧基、羰基、氨基[27]。多糖結合鋅后具有更廣泛的生物活性,如抗氧化、降血脂、殺菌等。

        2.5 去內臟牡蠣水溶多糖與鋅結合特征的初步解析

        牡蠣含大量蛋白質,為得到純度高的多糖組分需要進行除蛋白工藝處理。蛋白是否大量除去的一個重要的判定方法是通過紫外的特征吸收峰的進行鑒定。紫外光譜掃描中蛋白和核酸的吸收峰一般在260~ 280 nm 之間,多糖的吸收峰一般在200 nm附近。由圖5 可知,經過5 次除蛋白后的牡蠣粗多糖在260~ 280 nm 處吸收峰很弱,說明牡蠣粗多糖中只含有少量蛋白質,這些蛋白質可能是與多糖結合的糖蛋白。同時在200 nm 附近多糖特征吸收峰。經過DEAE-52 離子交換柱后的CT1 和CT2 在280 nm 處無吸收峰,說明經過分離純化后幾乎無蛋白質和核酸,在200 nm 附近有多糖特征吸收峰。

        圖5 去內臟牡蠣水提多糖及其分離組分的紫外掃描光譜Fig.5 UV scanning spectra of water-soluble polysaccharide and its separated components from the eviscerated oyster

        圖6 為CT1 的紅外光譜圖。在3 404 cm-1處的吸收峰是O-H 的伸縮振動,具有鮮明的多糖類物質的紅外光譜特征;在2 932 cm-1處的吸收峰是C—H的伸縮振動;在1 638 cm-1處CT1 表現(xiàn)出異常顯著的羧基中C==O 非對稱伸縮振動,而1 369 cm-1處顯示C==O 較強的對稱伸縮振動,表明含有糖醛酸;在1 416 cm-1處的吸收峰是C—H的變角振動;1 231 cm-1為S—O 不對稱伸縮振動,表明含有硫酸基;1155、1 080、1 022 cm-1為吡喃糖苷的吸收峰,其中1 155 cm-1處的吸收峰為仲醇基O—H 剪切振動峰。由于多糖與鋅離子配位的作用位點主要是羧基、羰基、羥基[28],因此CT1 存在多種可與鋅配位結合的官能團。由于CT1 是天然含鋅多糖,無空白對照,紅外光譜特征信息僅提示CT1 擁有可能與鋅結合的相關官能團,但對其具體的結構反映不全面,因此鋅與CT1 多糖的具體結合方式及結合量尚需深入研究。

        圖6 CT1 的傅里葉變換紅外光譜Fig.6 Fourier transform infrared spectra of CT1

        3 結論

        本研究對香港牡蠣的研究顯示,在各組織器官中,鰓部的鋅含量最高,內臟團含鋅量最多。牡蠣中無機態(tài)鋅元素與有機態(tài)鋅元素的比例約為1.55∶1。牡蠣全臟器水提液中有機態(tài)鋅元素主要存在于多糖組分中,殘渣中有機態(tài)鋅元素主要存在于蛋白組分中。多糖鋅、蛋白質鋅為牡蠣中有機態(tài)鋅的兩種重要存在形態(tài)。從去內臟牡蠣中提取液中分離到兩種多糖組分,其中CT1 組分鋅質量分數(shù)高達922.18 μg/g,紅外光譜分析表明其存在多種可與鋅配位的官能團。

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