朱國萍，章超樺，曹文紅，盧虹玉，秦小明，高加龍，鄭惠娜

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院//國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心（湛江）//廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室//水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

近年研究發(fā)現(xiàn)，飲食對學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)具有十分重要的作用[1]，飲食與大腦變化間存在關(guān)聯(lián)[2-3]，因此利用富含功效活性營養(yǎng)成分的食物作為飲食來源是一種具有潛在改善學(xué)習(xí)記憶功效作用的干預(yù)手段。許多陸生植物提取物已被證實(shí)具有顯著改善學(xué)習(xí)記憶的功效，核桃蛋白酶解物[4]、火麻仁提取液[5]可有效改善D-半乳糖誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶損傷小鼠對空間和有害刺激的學(xué)習(xí)記憶能力；枸杞子提取物[6]可顯著改善阿爾茨海默?。ˋD）小鼠的學(xué)習(xí)和記憶缺陷；日本當(dāng)藥（Swertia japonica）[7]、金針菇（Flammulina velutipes）多糖[8]對東莨?fàn)I堿誘導(dǎo)記憶功能損傷小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力均有顯著的修復(fù)作用。相對于陸生植物來源產(chǎn)物，來源于海洋的水產(chǎn)品因其生活環(huán)境的差異，使其含有獨(dú)特的天然活性物質(zhì)，呈現(xiàn)多樣的功效活性。近年的研究發(fā)現(xiàn)部分水產(chǎn)品的酶解產(chǎn)物也具有良好的改善學(xué)習(xí)記憶的作用。如海參（Cucumaria frondose）[9]和燈籠魚（Benthosema pterotum）[10]的酶解產(chǎn)物可改善D-半乳糖引起的早衰小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙；鳳尾魚（Coilia mystus）酶解產(chǎn)物可改善東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠記憶損傷[11]，馬氏珠母貝（Pinctada martensii）酶解蛋白粉可改善自然衰老導(dǎo)致的斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力衰退[12]。利用海洋來源的水產(chǎn)品進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶功效作用的研究已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。

牡蠣富含蛋白質(zhì)、糖原、?；撬帷\、硒等營養(yǎng)物質(zhì)，素有“根之源”“海洋牛奶”等美稱[13]，是研究學(xué)習(xí)記憶改善功效作用富有潛力的原料。Wang 等[14]發(fā)現(xiàn)大連灣牡蠣（Crassostrea talienwhanensis）的酶解產(chǎn)物可縮短正常小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)中總游泳路程，提高小鼠目標(biāo)象限時(shí)間，也能延長小鼠在黑白箱實(shí)驗(yàn)中白箱停留時(shí)間；課題組前期發(fā)現(xiàn)香港牡蠣（Crassostrea hongkongensis）酶解產(chǎn)物對正常小鼠及D-半乳糖誘導(dǎo)記憶損傷小鼠學(xué)習(xí)記憶均有一定改善作用[15-16]。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)牡蠣酶解產(chǎn)物具有改善學(xué)習(xí)記憶的功效作用，但課題組前期使用的行為學(xué)評價(jià)方法不夠系統(tǒng)，僅采用單一的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法對小鼠行為學(xué)進(jìn)行觀察，也沒有對牡蠣酶解產(chǎn)物灌胃劑量進(jìn)行篩選，其所含的與該生物活性相關(guān)性較大的營養(yǎng)成分含量尚不清楚。因此，本研究采用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)、水迷宮實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，利用高、中、低三劑量牡蠣酶解產(chǎn)物灌胃小鼠，綜合考察牡蠣酶解產(chǎn)物提高正常小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力，明確灌胃劑量及功效作用，同時(shí)測定其營養(yǎng)成分，了解其相關(guān)營養(yǎng)成分的含量，以期為未來利用牡蠣開發(fā)改善學(xué)習(xí)記憶的保健功效食品奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香港牡蠣（Crassostrea hongkongensis）購自廣東省湛江市東風(fēng)市場；BALB/c 小鼠、C57BL/6 小鼠（6～8 周齡，雄性，無特性病原體SPF 級），許可證號SCXK（粵）2013-0002，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；中性酶（5×104U/g），食品級，購自廣西南寧龐博生物工程有限公司；苯酚，AR，購自廣州化學(xué)試劑廠；葡萄糖，AR，購自國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司；吡拉西坦片，購自東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

U410 超低溫冰箱：英國 New Brunswick Scientific；T18 高速分散機(jī)：德國IKA 公司；V-1100V-WB 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海埃朗儀器有限公司；MW800 VHP 微波消解系統(tǒng)：加拿大Aurora 公司；Thermo MKIIM6 原子吸收分光光度計(jì)：美國Thermo 公司；Flyde-maz 跳臺(tái)記錄儀：廣州飛迪公司；PAT-8 避暗實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)：成都泰盟軟件有限公司；JL Behv-MWMG 水迷宮視頻分析系統(tǒng)：上海吉量軟件科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1牡蠣酶解產(chǎn)物的制備 牡蠣自然解凍后，組織均漿，然后按質(zhì)量（mg）體積（mL）比1∶3 加水，調(diào)節(jié)pH 至7.0，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%加入中性蛋白酶，50 ℃下酶解3 h，100 ℃下滅酶10 min，以10 000 r/min 離心20 min 取上清液，真空濃縮后冷凍干燥，-80 ℃ 超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2氨基酸組成測定 氨基酸組成采用氨基酸

1.3.5跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)[17]根據(jù)動(dòng)物在封閉空間中，會(huì)在邊緣與角落里活動(dòng)的生活特性而設(shè)計(jì)，在銅柵四處探索的小動(dòng)物遭受電擊后會(huì)立即跳上平臺(tái)進(jìn)行躲避，經(jīng)過多次電擊后的動(dòng)物，會(huì)產(chǎn)生短暫的記憶。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)分記憶鞏固與記憶消退實(shí)驗(yàn)。

記憶獲得訓(xùn)練：末次給藥后2 d 將小鼠單獨(dú)放到跳臺(tái)儀反應(yīng)箱中（平臺(tái)上、下均讓動(dòng)物熟悉），適應(yīng)3 min 后，將動(dòng)物放在銅柵上，立即通入36 V的交流電，動(dòng)物受電擊后會(huì)立刻跳回平臺(tái)躲避傷害，訓(xùn)練1 次后，將小鼠放在反應(yīng)箱平臺(tái)上，記錄5 min 內(nèi)小鼠第一次跳下平臺(tái)的時(shí)間，即為潛伏期。并記錄跳下平臺(tái)的錯(cuò)誤次數(shù)。

記憶鞏固實(shí)驗(yàn)：末次給藥3 d 后進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，將小鼠放在反應(yīng)箱平臺(tái)上，記錄第一次跳下平臺(tái)的時(shí)間，即為潛伏期，記錄3 min 內(nèi)受電擊次數(shù)、受電擊的動(dòng)物總數(shù)，計(jì)算出現(xiàn)錯(cuò)誤反應(yīng)的動(dòng)物百分率分析儀按 GB5009.124-2016 測定。

1.3.3無機(jī)元素的測定 無機(jī)元素含量的測定采用火焰原子吸收法按GB/T 15337-2008 測定。

1.3.4動(dòng)物分組、給藥及飼養(yǎng) BALB/c 小鼠用于跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)及避暗實(shí)驗(yàn)，C57BL/6 小鼠用于水迷宮實(shí)驗(yàn)；動(dòng)物飼養(yǎng)在專用動(dòng)物房，5 只/箱群養(yǎng)，采用12 h 晝∶12 h 夜的照明方式；期間動(dòng)物按實(shí)驗(yàn)要求喂給相應(yīng)顆粒飼料，并且動(dòng)物自由進(jìn)食飲水。

給藥方法：動(dòng)物分組后，受試樣品LG、MG、HG 組按20 mL/kg 的灌胃劑量以相應(yīng)濃度的受試樣品液，PG 組需灌胃吡拉西坦陽性藥液，CT 組需灌胃純凈水，各組灌胃1 次/日。實(shí)驗(yàn)開始前，跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)均灌胃30 d，但水迷宮實(shí)驗(yàn)開始后訓(xùn)練期間要求繼續(xù)給藥，故水迷宮實(shí)驗(yàn)共計(jì)灌胃40 d。具體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)劑量及分組見表1。（即受電擊動(dòng)物總數(shù)占該組動(dòng)物總數(shù)的百分率）。

表1 劑量設(shè)計(jì)與分組Table 1 Dose design and grouping

記憶消退實(shí)驗(yàn)：末次給藥8 d 后進(jìn)行一次記憶消退實(shí)驗(yàn)，方法同記憶鞏固實(shí)驗(yàn)。

1.3.6避暗實(shí)驗(yàn)[18]利用動(dòng)物趨暗避明生活習(xí)性而設(shè)計(jì)的裝置，喜歡呆在暗室的小鼠在遭受電擊后回到明室，當(dāng)小鼠遭受多次電擊后會(huì)產(chǎn)生短暫的記憶。避暗實(shí)驗(yàn)同樣分記憶鞏固與記憶消退實(shí)驗(yàn)。

記憶獲得訓(xùn)練：末次給藥24 h 后 開始訓(xùn)練，小鼠放入避暗儀中適應(yīng)3 min，后背向避暗儀洞口，放入明室，同時(shí)啟動(dòng)計(jì)時(shí)器，暗室電壓調(diào)為3 檔，小鼠穿過洞口進(jìn)入暗室受到電擊時(shí)，計(jì)時(shí)器自動(dòng)停止，此時(shí)間即為潛伏期。訓(xùn)練5 min，記錄5 min內(nèi)電擊次數(shù)。

記憶鞏固實(shí)驗(yàn)：于記憶獲得訓(xùn)練后24 h，小鼠不需要適應(yīng)3 min，直接按記憶獲得訓(xùn)練作實(shí)驗(yàn)，記錄潛伏期、5 min 內(nèi)的電擊次數(shù)、進(jìn)入暗室的動(dòng)物數(shù)，計(jì)算出現(xiàn)錯(cuò)誤反應(yīng)的百分率（即進(jìn)入暗室動(dòng)物總數(shù)占該組動(dòng)物總數(shù)的百分率）。

記憶消除實(shí)驗(yàn)：記憶鞏固實(shí)驗(yàn)結(jié)束5 d 后，進(jìn)行記憶消退實(shí)驗(yàn)，方法同記憶鞏固實(shí)驗(yàn)。

1.3.7水迷宮實(shí)驗(yàn) 水迷宮實(shí)驗(yàn)可將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)障礙與感覺、運(yùn)動(dòng)缺陷等方面分開，減少其對空間學(xué)習(xí)記憶過程檢測的干擾[19-20]，能較準(zhǔn)確地反映動(dòng)物的空間參考記憶和工作記憶能力[21-22]。Morris 水迷宮是神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域研究中最廣泛應(yīng)用的迷宮實(shí)驗(yàn)，包括定位航行和空間探索實(shí)驗(yàn)。

定位航行實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前1 d，小鼠自由游泳90 s適應(yīng)環(huán)境，期間引導(dǎo)小鼠站上站臺(tái)5 s，次日開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，站臺(tái)設(shè)置在第二象限，水迷宮水面高出站臺(tái)0.5 cm，水溫控制在（23±2）℃，并沿泳池壁貼好黑色參照物，從1 個(gè)象限中將小鼠面向池壁放入水中，計(jì)時(shí)90 s，讓小鼠尋找站臺(tái)并在站臺(tái)上停留3 s，儀器自動(dòng)記錄小鼠尋找并爬上站臺(tái)的游泳路線圖、總路程、所需時(shí)間（逃避潛伏期）。若小鼠90 s 內(nèi)不能找到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)人員引導(dǎo)其到達(dá)站臺(tái)，并在站臺(tái)上逗留3 s，潛伏期記為90 s。每天4 個(gè)象限均訓(xùn)練一次，每次間隔約10 min，訓(xùn)練1 d 后，進(jìn)行3 d 的定位航行實(shí)驗(yàn)，期間無需引導(dǎo)上站臺(tái)，每天小鼠放入象限的順序應(yīng)不相同。四個(gè)象限的平均成績?yōu)樽罱K的成績。訓(xùn)練期間繼續(xù)給藥。

空間探索實(shí)驗(yàn)：定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束5 d 后，將水下站臺(tái)撤除，水溫控制在（23±2）℃，并沿泳池壁貼好參照物，按定位航行實(shí)驗(yàn)的方法，分別從四個(gè)象限將動(dòng)物面朝池壁放入水中，記錄90 s 內(nèi)動(dòng)物的游泳路線、路程、在原站臺(tái)處穿越的次數(shù)，在原站臺(tái)所在象限逗留的時(shí)間。四個(gè)象限的平均成績作為最終的成績。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及分析；計(jì)量資料的數(shù)據(jù)方差齊，或數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換后的方差齊，則采用單因素的方差分析（ANOVA）；若數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換后方差仍不齊，采用秩和檢驗(yàn)的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。顯著性水平為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣酶解產(chǎn)物氨基酸的含量

牡蠣經(jīng)水解后獲得較高含量的總氨基酸及部分游離氨基酸，氨基酸的含量如表2 所示。18 種水解氨基酸中谷氨酸的含量最高，其次為天冬氨酸，分別占總氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.7%、9.68%；游離氨基酸中則以蘇氨酸占比最高。牡蠣酶解產(chǎn)物中?；撬豳|(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，達(dá)2.85%，其含量遠(yuǎn)高于魚類及甲殼類，是黃鯛（3.47 mg/g）及日本對蝦（1.99 mg/g）[23]所含?；撬岬? 倍和14 倍。

表2 牡蠣酶解產(chǎn)物氨基酸組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)（干基）Table 2 Composition of amino acids of enzymatic hydrolysis from oyster (dry matter basis) %

2.2 牡蠣酶解產(chǎn)物無機(jī)元素的含量

牡蠣酶解產(chǎn)物無機(jī)元素的含量如表3 所示，測定的8 種無機(jī)元素中Na、K 元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)高于其他元素，分別為1 414 mg/100g 和1 045 mg/100g，Se 含量在測定的8 種無機(jī)元素中最低。Zn 質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)175 mg/100g。

表3 牡蠣酶解產(chǎn)物無機(jī)元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(干基)Table 3 Composition of inorganic elements of enzymatic hydrolysis from oyster (dry matter biasis) %

2.3 基于跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)分析牡蠣酶解產(chǎn)物對小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

鞏固實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表4）顯示各組小鼠均沒有錯(cuò)誤跳下平臺(tái)遭受銅柵電擊，潛伏期均為180 s（圖1_A），顯示各組小鼠的學(xué)習(xí)能力不存在差異性（P >0.05）。消退實(shí)驗(yàn)CT 組出現(xiàn)4 只小鼠跳下平臺(tái)，樣品組LG、MG、HG 組分別有3、3、2 只小鼠跳下平臺(tái)，錯(cuò)誤動(dòng)物數(shù)及犯錯(cuò)次數(shù)有所減少，但差異不顯著（P >0.05），而PG 組沒有出現(xiàn)小鼠錯(cuò)誤跳下平臺(tái)的情況；相較于CT 組，喂食吡拉西坦可顯著延長小鼠的潛伏期（P <0.05），喂食牡蠣酶解產(chǎn)物

圖1 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)逃生潛伏期Fig.1 Escape latency in step down test

表4 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤動(dòng)物數(shù)及錯(cuò)誤次數(shù)Table 4 Number of errors of animal in step down test

2.4 基于避暗實(shí)驗(yàn)分析牡蠣酶解產(chǎn)物對小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

鞏固實(shí)驗(yàn)五組均有小鼠進(jìn)入通電的暗室，各組錯(cuò)誤動(dòng)物數(shù)及潛伏期差異不明顯，小鼠間學(xué)習(xí)能力無差別（P >0.05）（表5、圖2_A）。記憶消退實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CT 組相比，喂食吡拉西坦及牡蠣酶解產(chǎn)物均可減少小鼠進(jìn)入暗室的數(shù)量（表5），延長小鼠進(jìn)入暗室的潛伏期（P <0.05）（圖2_B），具有提高小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的功效作用，喂食吡拉西坦全組小鼠沒有進(jìn)入暗室。三個(gè)劑量樣品組錯(cuò)誤動(dòng)物數(shù)與空白對照組相比，分別減少4、3、5 只，潛伏期為（214±44）、（228±37）、（287±13），分別延長21、35、94 s（P <0.05）。高劑量牡蠣酶解產(chǎn)物延長小鼠的潛伏期接近吡拉西坦，具有相當(dāng)于吡拉西坦提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的功效作用。

表5 避暗實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤動(dòng)物數(shù)及錯(cuò)誤次數(shù)Table 5 Number of errors of animal in through test

圖2 避暗實(shí)驗(yàn)逃生潛伏期Fig.2 Escape latency in through test

2.5 基于水迷宮實(shí)驗(yàn)分析牡蠣酶解產(chǎn)物對小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

定位航行實(shí)驗(yàn)中，隨著測試時(shí)間的延長，各組小鼠上臺(tái)前的路程及潛伏期均呈現(xiàn)逐漸縮短的趨勢，至3 d，HG、LG 組及PG 組小鼠上臺(tái)前路程及潛伏期均顯著低于1 d（P <0.05）。與CT 組相比，2 d 時(shí)HG 組上臺(tái)前的路程及潛伏期也分別縮短1105 mm（P <0.05）、5.3 s（P <0.05），遠(yuǎn)低于PG組；至3 d，LG 組上臺(tái)前的路程也比CT 組顯著縮短1 431 mm（P <0.05）（圖3）。

圖3 定位航行逃生路程及潛伏期Fig.3 Escape distance and lantency in place navigation trail

空間探索實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，牡蠣酶解產(chǎn)物三劑量組小鼠在目標(biāo)象限所停留時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù)均呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，HG 組小鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù)均最高，其穿越平臺(tái)次數(shù)顯著高于CT 組（P <0.05），與PG 組相當(dāng)，但各組小鼠目標(biāo)象限所停留時(shí)間不存在明顯差異（P >0.05）（圖4）。

圖4 空間探索實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)象限時(shí)間比例及穿越平臺(tái)次數(shù)Fig.4 Percentage of target time and crossing times in spatial probe test

2.6 牡蠣酶解產(chǎn)物對實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量的影響

實(shí)驗(yàn)過程中各組小鼠體質(zhì)量變化見表6-8。各組小鼠體質(zhì)量均呈現(xiàn)增長趨勢，且逐漸增加，不同處理組間小鼠體質(zhì)量增長無顯著差異（P >0.05），說明牡蠣酶解產(chǎn)物對實(shí)驗(yàn)小鼠沒有毒副作用。

表6 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)各組小鼠體質(zhì)量Table 6 Weight of mice in step down test g

表7 避暗實(shí)驗(yàn)各組小鼠體質(zhì)量Table 7 Weight of mice in step through test g

表8 水迷宮實(shí)驗(yàn)各組小鼠體質(zhì)量Table 8 Weight of mice in Morris water maze test g

3 討論

水產(chǎn)品酶解產(chǎn)物改善學(xué)習(xí)記憶的功效作用報(bào)道研究中，一些來源于水產(chǎn)品的活性肽[21]、多糖[21]、酶解產(chǎn)物[9-11]及酶解蛋白粉[12]均呈現(xiàn)出良好的學(xué)習(xí)記憶改善作用。這些來源于海洋的水產(chǎn)品蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)含量豐富，多糖生物活性強(qiáng)。蛋白質(zhì)經(jīng)酶解發(fā)生降解釋放生物活性肽及氨基酸，氨基酸在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中具有廣泛的生理病理作用。部分氨基酸通過提高空間記憶作用[24]、神經(jīng)細(xì)胞的增殖作用[25]，海馬區(qū)的長時(shí)程增強(qiáng)[26]，干擾神經(jīng)細(xì)胞的凋亡通路[27-28]，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化、生成，提高認(rèn)知功能[29]，降低缺氧環(huán)境對人類認(rèn)知功能的損害[30]等方式參與多方面正常腦功能，包括認(rèn)知、記憶及學(xué)習(xí)。無機(jī)元素K、Ca2+、Mg2+等離子能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[31-33]。給予小鼠長期飲用含Mg2+的水，可增強(qiáng)其腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的表達(dá)，能增強(qiáng)大鼠的空間學(xué)習(xí)記及工作憶能力[33]；鋅是許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)突觸的共同傳遞因子且參與突觸的可塑性[34-35]，是神經(jīng)元轉(zhuǎn)運(yùn)過程中必不可少的金屬元素[36]。富含?；撬?、鋅等無機(jī)元素且氨基酸種類齊全的牡蠣酶解產(chǎn)物具有改善學(xué)習(xí)記憶功效的潛在價(jià)值。

跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)、迷宮實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)近年已成為神經(jīng)藥理學(xué)、神經(jīng)生理學(xué)、神經(jīng)心理學(xué)、老年病學(xué)等的常用研究手段[37-38]。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)和避暗實(shí)驗(yàn)均屬于被動(dòng)回避反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，聯(lián)合運(yùn)用可以更準(zhǔn)確地反應(yīng)藥物對動(dòng)物長時(shí)期記憶的作用。牡蠣酶解產(chǎn)物能顯著延長避暗消退實(shí)驗(yàn)小鼠的潛伏期，降低錯(cuò)誤動(dòng)物數(shù)，且高劑量樣品延長小鼠的潛伏期接近吡拉西坦。吡拉西坦是目前臨床上用于治療退行性神經(jīng)性疾病的有效藥物，牡蠣酶解產(chǎn)物延長避暗消退實(shí)驗(yàn)小鼠的潛伏期與吡拉西坦的效果相當(dāng)，說明牡蠣酶解產(chǎn)物具有相當(dāng)于吡拉西坦提高學(xué)習(xí)記憶能力的功效作用。牡蠣酶解產(chǎn)物也能一定程度延長跳臺(tái)消退實(shí)驗(yàn)的潛伏期，但差異不顯著，可能與樣品劑量較低有關(guān)。水迷宮實(shí)驗(yàn)屬主動(dòng)動(dòng)物反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)小鼠在喂食牡蠣酶解產(chǎn)物后縮短了逃避潛伏期及上臺(tái)前路程（上臺(tái)前潛伏期及路程），并提高了穿越平臺(tái)的次數(shù)，證明牡蠣酶解產(chǎn)物能夠提高小鼠空間記憶和工作記憶能力，使小鼠能清晰辨識出迷宮原平臺(tái)位置，從而采取更直線的游泳路徑，快速找到水下平臺(tái)逃生。

與林海生等[14]僅采用單一劑量進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)探究牡蠣酶解產(chǎn)物改善小鼠學(xué)習(xí)記憶的功效作用不同，本研究采用高、中、低三劑量進(jìn)行灌胃劑量的篩選，結(jié)合跳臺(tái)、避暗及水迷宮進(jìn)行綜合評價(jià)。在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)中，牡蠣酶解產(chǎn)物改善小鼠學(xué)習(xí)記憶的功效作用均呈現(xiàn)出劑量依賴性，小鼠在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)及避暗實(shí)驗(yàn)的逃生潛伏期均隨著灌胃劑量的提高而延長，而水迷宮實(shí)驗(yàn)中定位航行逃生潛伏期及逃生路程隨著灌胃劑量的提高而縮短，其穿越平臺(tái)次數(shù)隨著灌胃劑量的提高而提高。高、中、低三個(gè)灌胃劑量對小鼠的學(xué)習(xí)記憶均有一定的改善作用，但高劑量組改善作用最好。對灌胃劑量的篩選有利于選擇合適劑量的牡蠣酶解產(chǎn)物，使其發(fā)揮最優(yōu)的功效作用。

利用被動(dòng)與主動(dòng)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合也已成為動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)行之有效的評價(jià)方法。Gong 等[39]在研究蓮蓬原花青素對D-半乳糖引起的早衰小鼠認(rèn)知功能障礙的改善作用時(shí)采用Y-迷宮和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合進(jìn)行評價(jià)；Su 等[11]采用Morris 水迷宮和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)評價(jià)鳳尾魚酶解產(chǎn)物及其美拉德反應(yīng)物改善東莨膽堿引起的小鼠記憶損傷；Jeon 等[40]采用避暗實(shí)驗(yàn)和Y-迷宮研究齊墩果酸對東莨菪堿引起的大鼠認(rèn)知功能障礙的改善作用。通過四項(xiàng)行為實(shí)驗(yàn)（跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)、穿梭箱實(shí)驗(yàn)及水迷宮實(shí)驗(yàn)）中任二項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性來判定一種受試樣品具有輔助改善功能，本研究中牡蠣酶解產(chǎn)物可顯著延長小鼠進(jìn)入避暗箱的潛伏期（避暗實(shí)驗(yàn)陽性），也顯著縮短小鼠定位航行上臺(tái)前路程及潛伏期，提高小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)（水迷宮實(shí)驗(yàn)陽性），從而可以判定牡蠣酶解產(chǎn)物具有提高小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的功效作用。

4 結(jié)論

牡蠣酶解產(chǎn)物?；撬?、鋅含量豐富，氨基酸種類齊全；三種劑量牡蠣酶解產(chǎn)物飼喂小鼠30 d 后，高劑量牡蠣酶解產(chǎn)物顯示最好的功效作用，能顯著延長避暗消退實(shí)驗(yàn)小鼠逃生潛伏期，縮短定位航行實(shí)驗(yàn)小鼠上臺(tái)前路程及潛伏期，并提高空間探索實(shí)驗(yàn)小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)，具有顯著提高小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的功效作用。