高穎 楊亞苓 李慕紫 賀麗霞 李慧

摘要： AP2/ERF（APETALA2/ethylene-responsive factor）是一個龐大的轉(zhuǎn)錄因子超家族，其蛋白質(zhì)中均含有1段或2段由60～70個氨基酸殘基組成的結(jié)構(gòu)域，該家族基因廣泛存在于植物體內(nèi)，在植物生長發(fā)育，生物及非生物脅迫響應(yīng)，植物次級代謝中均發(fā)揮著重要的作用。本試驗(yàn)利用前期的青花菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用RT-PCR 技術(shù)從青花菜中分離克隆WRI4基因，利用生物信息學(xué)分析軟件對其進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)及特征分析。結(jié)果表明，青花菜WRI4轉(zhuǎn)錄因子基因共編碼308個氨基酸，WRI4具有2個AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，屬于AP2/ERF家族成員。WRI4蛋白為親水性蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和α-螺旋，β-轉(zhuǎn)角為主。氨基酸序列比對及進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，青花菜WRI4轉(zhuǎn)錄因子與白菜、油菜相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子有較高的相似性。采用同源重組技術(shù)構(gòu)建了WRI4過表達(dá)載體，為進(jìn)一步深入探究該轉(zhuǎn)錄因子的功能，培育青花菜新品種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 青花菜;WRI4;AP2/ERF;同源重組克隆

中圖分類號： S635.3;Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）03-0710-08

Cloning， bioinformatic analysis and expression vector construction of broccoli WRI4 gene

GAO Ying1， YANG Ya-ling1， LI Mu-zi1， HE Li-xia2， LI Hui1

（1.College of Horticulture and Landscape Architecture， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China;2.College of Life Sciences， Nankai University， Tianjin 300071， China）

Abstract： AP2/ERF （APETALA2/ethylene-responsive factor） is a large superfamily of transcription factors， there is one or two domains composed of 60-70 amino acid residues in its proteins. The family genes widely exist in plants and play important roles in plant growth and development， responses to biological and abiotic stresses and botanic secondary metabolism. WRI4 gene was isolated and cloned from broccoli by RT-PCR technique based on the previous data of transcriptome in broccoli， then the structure and characteristics of WRI4 gene were analyzed by bioinformatic analysis software. The results showed that， 308 amino acids were encoded by WRI4 transcription factor gene in broccoli， and there were two AP2/ERF domains in WRI4 transcription factor， which belonged to AP2/ERF family member. The WRI4 protein was hydrophilic and had no transmembrane structure， its main secondary structures were random coil， α-helix and β-rotation angle. Results of amino acid sequence alignment and evolutionary tree analysis showed that， WRI4 transcription factors in broccoli had high similarity with the corresponding transcription factors in cabbage and rape. Overexpression vector of WRI4 was constructed by homologous recombination technique， which provided basis for further exploring on its functions and cultivating new varieties of broccoli.

Key words： broccoli;WRI4;AP2/ERF;homologous recombination cloning

高鹽、干旱、極端溫度等不利因素對大多數(shù)植物的生長均有抑制作用。面對逆境脅迫，植物已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜的系統(tǒng)來調(diào)節(jié)對壓力信號的適應(yīng)[1]。AP2/ERF（APETALA2/ethylene-responsive factor）屬于植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子超家族。其廣泛參與植物的生物與非生物脅迫，并在一些信號交叉途徑中作為中間因子參與調(diào)節(jié)[2]。目前已有研究結(jié)果表明，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族對植物適應(yīng)非生物逆境、植物生長發(fā)育、花器官形態(tài)建成以及種子發(fā)育有重要影響[3]。

AP2/ERF家族均含有1個或2個DNA結(jié)合域，其保守域由60～70個氨基酸組成[4]。根據(jù)含有結(jié)構(gòu)域數(shù)量的不同，AP2/ERF超家族可以分為5類亞族：DREB （Dehydration-responsive element binding protein）、ERF（Ethylene-responsive factors）、AP2（APETALA 2）、RAV （Related to ABI3/VP1），以及Soloist亞族，其中ERF亞族和DREB亞族含有1個AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，Soloist亞族具有單一的保守型結(jié)構(gòu)域，AP2亞族大多數(shù)含有2個AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，RAV亞族包括1個AP2/ERF結(jié)構(gòu)域及1個B3結(jié)構(gòu)域[5]。

DREB亞族能夠特異性結(jié)合干旱脅迫響應(yīng)元件（DRE/CRT）和冷誘導(dǎo)響應(yīng)元件（A/GCCGAC）[5-6]，在調(diào)節(jié)植物對干旱和低溫等非生物脅迫及生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮功能[7]。ERF亞族參與植物激素的信號調(diào)節(jié)，具有調(diào)控乙烯應(yīng)答以及抗病相關(guān)基因表達(dá)的功能[8-9]。RAV亞族主要在生物和非生物脅迫響應(yīng)、乙烯響應(yīng)過程中起重要作用[10]。Soloist亞族與生物脅迫響應(yīng)相關(guān)[6]。AP2亞族基因最初被分離時，在花分生組織的建立中發(fā)揮著核心作用，AP2亞族基因主要影響植物的花器官發(fā)育、分化以及側(cè)根生長、脂肪酸代謝、角質(zhì)合成等過程[11]。其對花原基的形成、胚珠的發(fā)育[12]、種子的形成以及發(fā)育也起關(guān)鍵作用[8]。有研究結(jié)果表明，AP2突變體的擬南芥花瓣減少，雄蕊缺失，出現(xiàn)未融和萼片狀心皮結(jié)構(gòu)[13]。

已有研究結(jié)果證明，WRI類轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2亞族[14]。WRI類轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)合成的脂肪酸是所有植物細(xì)胞的基本組成成分，用于膜生物合成和修復(fù)，其覆蓋在表皮細(xì)胞角質(zhì)層脂質(zhì)（角質(zhì)層蠟和角質(zhì)），是防止水分流失、病原微生物進(jìn)入和器官粘連的重要保護(hù)屏障[15-16]。WRI1-like 組群中，WRI1、WRI3和WRI4這3個轉(zhuǎn)錄因子能夠有效調(diào)控?；満铣杀嚷?，參與花發(fā)育過程中脂肪酸生物合成的激活，并通過為角質(zhì)生物合成提供酰基前體來防止花器官粘附和半不育[17]。同時WRI1在植物油脂合成的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用[15]，它誘導(dǎo)了糖酵解生物合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，影響植物種子特異性三酰甘油（TAGs）的合成和貯藏[16]，有利于花器官角質(zhì)合成[18-19]。該轉(zhuǎn)錄因子通常被認(rèn)為是胚胎形成和種子成熟過程中的主要調(diào)控因子[17]。目前已經(jīng)在多種植物中成功克隆到 WRI1基因[20-22]，但國內(nèi)外關(guān)于WRI4基因的報道較少。

中國青花菜的主要栽培品種均由國外引進(jìn)，中國地域遼闊種植環(huán)境差異大，對青花菜生長發(fā)育有一定的限制，當(dāng)務(wù)之急是要加快選育出適合中國種植，綜合表現(xiàn)優(yōu)良的品種[23]。

WRI類轉(zhuǎn)錄因子能影響植物的生長發(fā)育，調(diào)節(jié)貯藏代謝機(jī)制，影響油脂的合成與貯藏。本試驗(yàn)對青花菜WRI4基因進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析，并利用同源重組技術(shù)構(gòu)建其表達(dá)載體，揭示該轉(zhuǎn)錄因子的功能，為青花菜育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用的青花菜品種是高代自交純系KJ-18，天津科潤蔬菜研究所江漢民博士惠贈。

RNA 提取試劑盒購于上海普洛麥格生物制品有限公司，質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒、ClonEXPress II One Step Cloning Kit 試劑盒均購自從北京莊盟國際生物基因科技有限公司，高保真酶 KOD FX DNA聚合酶，限制性核酸內(nèi)切酶 NcoI-HF、BstEII-HF購自New England Biolabs公司。

克隆載體pCAMBIA-3301購于北京擎科生物科技有限公司，大腸桿菌（Escherichia coli）菌株 DH5α、農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105購于北京莊盟國際生物基因科技有限公司;引物合成與測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)RNA提取試劑盒的說明書提取RNA。使用前用滅菌冷凍后的剪刀和鑷子取青花菜真葉放入液氮速凍，將凍好的材料放在提前冷凍過的研缽中快速研磨成粉末，迅速將其置于2.0 ml的離心管中，同時向該管中加入裂解液按說明書提取青花菜總 RNA。

1.2.2 WRI4全長cDNA引物設(shè)計及擴(kuò)增 利用軟件 Primer Premier 5.0 設(shè)計青花菜WRI4基因全長引物，根據(jù)同源重組反應(yīng)引物設(shè)計原則，選擇 NcoI-HF、BstE II-HF 2個限制性內(nèi)切酶，引物設(shè)計如下：正向引物：5′-ACGGGGGACTCTTGACCATGGAT￣G￣G￣C￣A￣AAACTCTCTCAACGGAAC-3′;反向引物：5￣′￣-￣G￣G￣G￣GAAATTCGAGCTGGTCACCTCAAGA￣C￣C￣A￣A￣T￣A￣A￣T￣C￣A￣A￣A￣C￣TCGTTACATA-3′。PCR程序?yàn)椋?4 ℃ 預(yù)變性5 min;94 ℃ 變性 15 s，58 ℃退火30 s，68 ℃ 延伸1 min ，33 個循環(huán);68 ℃延伸7 min ，運(yùn)行結(jié)束后將擴(kuò)增產(chǎn)物置于4 ℃進(jìn)行保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物鑒定。

1.2.3 同源重組技術(shù)構(gòu)建青花菜WRI4基因表達(dá)載體 按照ClonEXPress II One Step Cloning Kit 試劑盒說明書的操作流程進(jìn)行WRI4基因過表達(dá)載體的構(gòu)建。利用NcoI-HF，BstE II-HF內(nèi)切酶對pCAMBIA3301載體進(jìn)行雙酶切，獲得線性化的載體，膠回收線性化載體與目的基因條帶進(jìn)行連接，采用凍融法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，挑選單菌落進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.4 青花菜WRI4基因生物信息學(xué)分析 利用以下生物信息分析軟件及在線網(wǎng)站對WRI4基因進(jìn)行分析：利用NCBI （https：// www.ncbi.nlm.nih.gov/）對WRI4蛋白保守功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測，使用ProtParam （https：//web.expasy.org/protparam/）對WRI4基因一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，利用PRABI （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）分析WRI4氨基酸、蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)，利用ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）預(yù)測WRI4蛋白的親（疏）水性，使用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析，使用NetPhos （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測、分析，利用SWISS-MODEL： （https：//www.swissmodel.expasy.org/）對WRI4蛋白三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，利用MEME軟件對青花菜及其他物種中的WRI4蛋白進(jìn)行保守 motifs分析，使用DNAMAN 軟件對WRI4蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源比對，使用MEGA 軟件對不同物種WRI4蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 WRI4基因的克隆

提取青花菜RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測到RNA清晰條帶，采用NanoDrop-1000儀器測定提取的總RNA質(zhì)量，A260/A280在2.0左右，RNA 無降解，純度較高，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA 為模板利用高保真酶對WRI4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長約900 bp的cDNA 條帶（圖1），經(jīng)測序證明該條帶是目的基因WRI4，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 青花菜WRI4轉(zhuǎn)錄因子分子特征

對WRI4轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)其有2個AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域，證明WRI4轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2/ERF家族中AP2亞族（圖2A）。利用軟件ProtParam對青花菜中WRI4轉(zhuǎn)錄因子一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果顯示W(wǎng)RI4共編碼308個氨基酸，相對分子質(zhì)量為35 020，理論P(yáng)I值（蛋白質(zhì)等電點(diǎn)）為7.69。原子總數(shù)為4 829，脂肪指數(shù)為53.64，親水性平均值（GRAVY）為-0.944，青花菜WRI4可能是一種親水性蛋白質(zhì)。進(jìn)一步的親水性分析發(fā)現(xiàn)，親水性最小分值為-3.133，最大分值為1.667，表明此蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)（圖2B）;TMHMM，PRABI軟件分析結(jié)果表明，WRI4蛋白沒有跨膜區(qū)域，不是膜蛋白（圖2C）。蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果（圖2D）表明，WRI4蛋白有15個蘇氨酸，24個絲氨酸，5個酪氨酸，WRI4蛋白內(nèi)存在無規(guī)則卷曲（53.9%），α-螺旋（24.68%），β-轉(zhuǎn)角（7.47%），伸展鏈（13.96%），不存在β-折疊（圖2E、圖2F）。

2.3 青花菜WRI4系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過DNAMAN軟件對青花WRI4轉(zhuǎn)錄因子、薺菜（Capsella rubella，XP_023642912.1）、白菜（Brassica rapa，XP_009106692.1）、蘿卜（Raphanus sativus，XP_018457265.1）、亞麻薺（Camelina sativa，XP_010472844.1）、油菜（Brassica napus，XP_013650299.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，NP_001077849.1）、煙草（Nicotiana attenuata，XP_019248140.1）、甜櫻桃（Prunus avium，XP_021830086.1）物種的相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列進(jìn)行比對。比對結(jié)果（如圖3）顯示，青花菜WRI4轉(zhuǎn)錄因子與白菜、油菜的相似度高。

2.4 青花菜WRI4保守motifs及分子進(jìn)化分析

利用MEME、MEGA軟件分析不同物種結(jié)構(gòu)域以及親緣性。利用MEME對青花菜及其他物種中WRI4進(jìn)行 motifs分析，分析結(jié)果（圖4）顯示，WRI4轉(zhuǎn)錄因子具有 2 個 AP2 保守結(jié)構(gòu)域且均含有YRG 和 RAYD 2個保守結(jié)構(gòu)域。motifs越相近，親緣性越高。進(jìn)一步采用 MEGA 軟件對其進(jìn)行進(jìn)化樹及結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果如圖5所示，更進(jìn)一步證實(shí)青花菜WRI4與白菜和油菜相對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子有較高親緣性。

2.5 同源重組克隆技術(shù)構(gòu)建青花菜WRI4表達(dá)載體

根據(jù)ClonEXPress II One Step Cloning Kit 試劑盒說明書獲得線性化目的基因與載體，膠回收線性化載體，與目的基因條帶進(jìn)行連接，將產(chǎn)物涂布在含有 50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的LB 篩選培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，挑取單克隆菌落于相同抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)并進(jìn)行PCR鑒定（圖6），條帶大小正確，青花菜WRI4表達(dá)載體構(gòu)建成功。

3 討論

已有研究結(jié)果表明，AP2/ERF家族中WRI類轉(zhuǎn)錄因子對植物生長發(fā)育、脂肪酸產(chǎn)生、蠟質(zhì)的形成與貯藏以及植物開花有一定的調(diào)控作用，并對植物抵抗生物與非生物脅迫有重要影響[24-25]。擬南芥中過表達(dá)Brassica napus的WRI1同源基因會使轉(zhuǎn)基因種子以及葉片中油脂含量上升，過表達(dá)BnWRI1促使花期提前，在單子葉植物的葉片中異位表達(dá)BdWRI1后會使葉片中TAG和游離FA含量提高[25]。導(dǎo)入WRI1基因的轉(zhuǎn)基因玉米，過表達(dá)該基因?qū)ΨN子萌發(fā)、植株生長以及產(chǎn)量并未出現(xiàn)明顯影響，但轉(zhuǎn)基因玉米籽粒含油量比野生型提高了48%[19]。另有研究結(jié)果表明，煙草原生質(zhì)體中WRI4基因通過直接結(jié)合啟動子激活LACS1、KCR1、PAS2、ECR和WSD1的表達(dá)，參與蠟前體的脂肪酸延伸和蠟質(zhì)的產(chǎn)生與貯藏[17]。

本試驗(yàn)分離克隆了青花菜WRI4基因，利用生物信息學(xué)分析軟件對WRI4進(jìn)行分析，其編碼308個氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為3 520，有2個AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域，無跨膜結(jié)構(gòu)，親水性平均值（GRAVY）為-0.944，由此推斷其可能是一種親水性蛋白質(zhì)。由WRI4二級（三級）結(jié)構(gòu)分析結(jié)果可知，其含有無規(guī)則卷曲（53.9%），α-螺旋（24.68%），β-轉(zhuǎn)角（7.47%），伸展鏈（13.96%），不含β-折疊。Motifs分析結(jié)果顯示青花菜WRI4與白菜和油菜WRI4同源性高。雖然WRI1轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥、油菜、玉米、棉花等作物中已有報道，但WRI4轉(zhuǎn)錄因子的報道較少，因此探究該轉(zhuǎn)錄因子對青花菜生長發(fā)育影響，及其對外界脅迫的響應(yīng)顯得尤為迫切。本研究利用同源重組技術(shù)構(gòu)建了青花菜WRI4基因表達(dá)載體，為探究WRI4轉(zhuǎn)錄因子在青花菜生長發(fā)育中的作用，進(jìn)一步培育青花菜優(yōu)良品種奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）